微生物药物的分离精制鉴别.ppt

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1、第三节第三节 微生物制药微生物制药一、微生物药物的几个相关基本概念一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃物的综合利用和环境保护七、废弃物的综合利用和环境保护六、微生物药物的分离、精制和鉴别六、微生物药物的分离、精制和鉴别n n微生物药物分离纯化的重要原则微生物药物分离纯化的重要原则n考虑使用高选择性的分离纯化方法，保证产品考

2、虑使用高选择性的分离纯化方法，保证产品要求的纯度；要求的纯度；n考虑不影响产品的生物活性；考虑不影响产品的生物活性；n获得的最终产品必须达到或超过国家药典（或获得的最终产品必须达到或超过国家药典（或出口国）的质量标准。出口国）的质量标准。1、提取的过程和原则、提取的过程和原则n提取的提取的3个阶段：个阶段：1)发酵液的预处理和固液分离发酵液的预处理和固液分离2)提取（分离浓缩）提取（分离浓缩）3)精制（纯化）精制（纯化）n发酵液的预处理和固液分离发酵液的预处理和固液分离v目的：达到固液分离目的：达到固液分离v根据活性物质的许可范围，可以采取酸化、根据活性物质的许可范围，可以采取酸化、加热、过滤

3、、絮凝、离心等方法。加热、过滤、絮凝、离心等方法。微生物药物的分离、精制和鉴别微生物药物的分离、精制和鉴别1 1、发酵液的过滤和预处理、发酵液的过滤和预处理n分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），核酸和蛋白质的沉淀物），n除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。于后继各步操作。（1）发酵液中蛋白质的去除）发酵液中蛋白质的去除a.pH的调节的调节b.采用加热使蛋白质变性采用加热使蛋白质变性c.加入蛋白质沉淀剂和絮凝剂加入蛋白质沉淀剂和絮凝剂在抗生素稳定性好时可采用较强的无机酸

4、调节在抗生素稳定性好时可采用较强的无机酸调节pH，一般采用较为缓和的有机酸，如草酸。，一般采用较为缓和的有机酸，如草酸。金属盐类：硫酸锌、硫酸金属盐类：硫酸锌、硫酸 铝、氯化铝铝、氯化铝水溶性高分子化合物：聚苯乙烯衍生物水溶性高分子化合物：聚苯乙烯衍生物（2）发酵液中高价离子的去除）发酵液中高价离子的去除Ca2+Ca2+，草酸，草酸Mg2+Mg2+，三聚磷酸钠，三聚磷酸钠Fe3+Fe3+，黄血盐，黄血盐普鲁氏蓝沉淀普鲁氏蓝沉淀（3）发酵液的过滤）发酵液的过滤影响过滤速度的因素影响过滤速度的因素菌种、发酵培养基菌种、发酵培养基的组成、发酵周期长短等；的组成、发酵周期长短等；改善过滤性能改善过滤性

5、能常用助滤剂硅藻土；常用助滤剂硅藻土；过滤设备过滤设备鼓式真空过滤器，板框压滤机鼓式真空过滤器，板框压滤机（4）不过滤提取）不过滤提取v主要用于离子交换法提取抗生素，如链霉素；主要用于离子交换法提取抗生素，如链霉素；v一般采用反吸附，将经稀释后黏度降低的发一般采用反吸附，将经稀释后黏度降低的发酵液自下而上的流经树脂床，树脂呈酵液自下而上的流经树脂床，树脂呈“沸腾状沸腾状”，吸附后的废液（包括发酵液中的悬浮颗粒），吸附后的废液（包括发酵液中的悬浮颗粒）一起流出离子交换罐外。一起流出离子交换罐外。n提取（分离浓缩）提取（分离浓缩）v对活性物质的浓缩对活性物质的浓缩v方法：化学萃取，树脂吸附，沉淀等

6、方法：化学萃取，树脂吸附，沉淀等n精制（纯化）精制（纯化）v获得活性物质的纯品获得活性物质的纯品v方法：沉淀，吸附，结晶，脱色，色谱层析等。方法：沉淀，吸附，结晶，脱色，色谱层析等。n分离提取的原则：分离提取的原则：1)1)操作时间应尽可能的短；操作时间应尽可能的短；2)2)操作温度一般要低；操作温度一般要低；3)3)分离纯化操作应在药物性质许可的分离纯化操作应在药物性质许可的pH pH 范围内；范围内；4)4)经常清洗消毒，避免杂菌的污染；经常清洗消毒，避免杂菌的污染；5)5)如果是注射用药物，精制和成品阶段应保证无如果是注射用药物，精制和成品阶段应保证无菌操作。菌操作。2、提取纯化的基本方

7、法、提取纯化的基本方法1)吸附法吸附法2)沉淀法沉淀法3)溶剂萃取法溶剂萃取法4)离子交换法离子交换法吸附法吸附法n利用适当的吸附剂（如活性炭、白土、氧化铝等）利用适当的吸附剂（如活性炭、白土、氧化铝等），在一定的，在一定的pHpH条件下，使发酵液中的目的产物被条件下，使发酵液中的目的产物被吸附，然后改变吸附，然后改变pHpH，以适当的洗脱剂（一般为有，以适当的洗脱剂（一般为有机溶剂）将产物洗下。机溶剂）将产物洗下。n早期的青霉素、链霉素及目前的丝裂霉素、放线早期的青霉素、链霉素及目前的丝裂霉素、放线菌酮等药品的分离提取主要采用吸附法。菌酮等药品的分离提取主要采用吸附法。n操作简单，成本较低，

8、但吸附性能不稳定，使用操作简单，成本较低，但吸附性能不稳定，使用大量有机溶剂影响环境。大量有机溶剂影响环境。n发展趋势发展趋势应用和开发新型大孔吸附树脂。应用和开发新型大孔吸附树脂。大网格树脂是一种非离子性吸附剂，具有选大网格树脂是一种非离子性吸附剂，具有选择性好、解吸容易、树脂性能稳定、机械强度好、择性好、解吸容易、树脂性能稳定、机械强度好、可反复使用等优点。可反复使用等优点。非极性非极性从极性溶液中吸附非极性物质从极性溶液中吸附非极性物质 极性极性 从非极性溶液中吸附极性物质从非极性溶液中吸附极性物质 中等极性中等极性均具有吸附能力均具有吸附能力吸附法吸附法沉淀法沉淀法n利用某些微生物代谢

9、产物的两性性质，使其在利用某些微生物代谢产物的两性性质，使其在等电点时沉淀，或在一定等电点时沉淀，或在一定pH条件下，与酸碱盐条件下，与酸碱盐形成不溶性或几乎不溶的复盐。如四环素类药形成不溶性或几乎不溶的复盐。如四环素类药物的提取。物的提取。n设备简单，成本低，收率高。但不是所有的药设备简单，成本低，收率高。但不是所有的药物都可以使用沉淀法提取的，且反应形成的沉物都可以使用沉淀法提取的，且反应形成的沉淀物过滤困难。实际操作中常与溶剂萃取法结淀物过滤困难。实际操作中常与溶剂萃取法结合使用。合使用。溶剂萃取法溶剂萃取法n利用微生物药物在水和与水不互溶的有机利用微生物药物在水和与水不互溶的有机溶剂中

10、的溶解性的差异，将药物从一种液溶剂中的溶解性的差异，将药物从一种液体转移到另一种液体中，从而达到浓缩和体转移到另一种液体中，从而达到浓缩和提纯的目的，如目前的青霉素提取。提纯的目的，如目前的青霉素提取。n产品的浓缩倍数大，产物纯度高，操作周产品的浓缩倍数大，产物纯度高，操作周期短，可以连续生产。但对设备的要求较期短，可以连续生产。但对设备的要求较高，大量消耗有机溶剂，污染环境。高，大量消耗有机溶剂，污染环境。n青霉素的提取及精制青霉素的提取及精制n青霉素：酸性化合物，酸性时为游离酸，青霉素：酸性化合物，酸性时为游离酸，易溶于有机溶剂。在易溶于有机溶剂。在pH7以上以盐状态以上以盐状态存在，易溶

11、于水。存在，易溶于水。pH2.5，滤液，滤液醋酸丁酯醋酸丁酯pH7.0，缓冲液，缓冲液pH2.5，醋酸丁酯，醋酸丁酯丁酯提取液冷冻脱水，加入醋酸钾丁酯提取液冷冻脱水，加入醋酸钾-乙醇溶液乙醇溶液青霉素钾盐结晶青霉素钾盐结晶反萃取反萃取n红霉素的提取及精制红霉素的提取及精制n红霉素：碱性化合物，在碱性条件下溶于有机红霉素：碱性化合物，在碱性条件下溶于有机溶剂，在酸性时溶于水。溶剂，在酸性时溶于水。erythromycin发酵液预处理、过滤发酵液预处理、过滤将滤液将滤液pH调节到调节到9.8-10.2，用醋酸丁酯提取，用醋酸丁酯提取提取液用提取液用pH4.0-4.2的酸性缓冲液反提取的酸性缓冲液反

12、提取将将pH调节到调节到9.8-10.2，用醋酸丁酯二次提取，用醋酸丁酯二次提取提取液加入一定量丙酮，冷却至提取液加入一定量丙酮，冷却至-5，放置后析出红霉素结晶，放置后析出红霉素结晶过滤，干燥，得成品过滤，干燥，得成品红霉素的提取及精制红霉素的提取及精制离子交换法离子交换法n利用某些微生物药物能够解离成阴离子或阳离子利用某些微生物药物能够解离成阴离子或阳离子的特性，通过离子交换树脂的选择性交换，实现的特性，通过离子交换树脂的选择性交换，实现产物的分离。如卡那霉素、庆大霉素是碱性化合产物的分离。如卡那霉素、庆大霉素是碱性化合物，可以采用阳离子交换树脂来提取。物，可以采用阳离子交换树脂来提取。n

13、分离纯化的成本低，需要的设备简单，操作方便，分离纯化的成本低，需要的设备简单，操作方便，使用的有机溶剂少，不污染环境。但工艺周期长，使用的有机溶剂少，不污染环境。但工艺周期长，操作过程中操作过程中pH变化大，很多微生物药物不能耐变化大，很多微生物药物不能耐受。受。n链霉素的提取链霉素的提取n链霉素是链霉素是3价阳离子，具有很强的碱性，在碱价阳离子，具有很强的碱性，在碱性条件下不稳定。性条件下不稳定。链链霉霉素素的的提提取取选用钠型的弱酸性阳离子交换树脂选用钠型的弱酸性阳离子交换树脂1014或或110在在中性条件下进行吸附，饱和的树脂用稀硫酸解吸。中性条件下进行吸附，饱和的树脂用稀硫酸解吸。高交

14、联度氢型磺酸基阳离子交换树脂高交联度氢型磺酸基阳离子交换树脂125或或120去除去除Na+、Mg2+等无机离子。等无机离子。用碱性羟基型树脂中和洗脱液的酸性，用碱性羟基型树脂中和洗脱液的酸性，并去除链霉胍等小分子有机杂质。并去除链霉胍等小分子有机杂质。精制液经浓缩、脱色、喷雾干燥，得成品。精制液经浓缩、脱色、喷雾干燥，得成品。3、微生物药物提取方法的选择、微生物药物提取方法的选择n分离纯化方法的确定需要由小试决定。分离纯化方法的确定需要由小试决定。n具体实施时应考虑因素有：具体实施时应考虑因素有：a.产品的基本理化性能产品的基本理化性能b.化合物的稳定性化合物的稳定性c.尽可能避免二次污染尽可

15、能避免二次污染4、微生物药物的鉴别、微生物药物的鉴别n早期鉴别早期鉴别n最终鉴别和结构测定最终鉴别和结构测定（1）早期鉴别）早期鉴别n微生物药物的提取方法及其溶解性，微生物药物的提取方法及其溶解性，微生物药物本身的特异颜色，微生物微生物药物本身的特异颜色，微生物药物对酸、碱、温度、光线的稳定性药物对酸、碱、温度、光线的稳定性等都可以作为微生物药物鉴别用的一等都可以作为微生物药物鉴别用的一个个“指纹指纹”。用微量注射器针头或微细管把样品点一用微量注射器针头或微细管把样品点一小点在层析床的一端。要求层析床必须小点在层析床的一端。要求层析床必须完全干燥，点样之后转入装有展层剂的完全干燥，点样之后转入

16、装有展层剂的玻璃槽中。当展层剂的前沿跑到滤纸全玻璃槽中。当展层剂的前沿跑到滤纸全长的长的80-90时，将层析床取出。时，将层析床取出。纸层析纸层析可以用可以用相对迁移率（相对迁移率（Rf）来表示一种物质的迁移：来表示一种物质的迁移：或者也可以用或者也可以用相对于一种已知迁移率的标准物的迁相对于一种已知迁移率的标准物的迁移（移（Rx）来表示：来表示：待测物移动的距离待测物移动的距离标准物移动的距离标准物移动的距离Rx=组分移动的距离组分移动的距离溶剂移动的距离溶剂移动的距离Rf=在分析待测样品时，应在同一层析床上同时分析在分析待测样品时，应在同一层析床上同时分析一种或多种标准物质，来检验样品的一

17、种或多种标准物质，来检验样品的Rf值。值。薄层扫描仪薄层扫描仪快速；快速；可用腐蚀性试剂显色；可用腐蚀性试剂显色；易于制备少量样品。易于制备少量样品。薄层层析薄层层析十六元环大环内酯类抗生素的薄层色谱图十六元环大环内酯类抗生素的薄层色谱图1:乙酰螺旋霉素乙酰螺旋霉素;2:麦迪霉素麦迪霉素;3:麦白霉素麦白霉素;4:吉他霉素吉他霉素;5:乙酰吉他霉素乙酰吉他霉素（2）微生物药物的快速、准确鉴别）微生物药物的快速、准确鉴别nLC-UV（液相色谱（液相色谱-紫外光谱联用技术）紫外光谱联用技术）nLC-MS（液相色谱（液相色谱-质谱联用技术）质谱联用技术）nLC-IR（液相色谱（液相色谱-红外联用技术）红外联用技术）nLC-NMR（液相色谱（液相色谱-核磁共振技术）核磁共振技术）（3）微生物药物的结构鉴定）微生物药物的结构鉴定n紫外光谱紫外光谱n红外光谱红外光谱n核磁共振谱核磁共振谱n质谱质谱碳谱与氢谱碳谱与氢谱的对比的对比