液体菌种制备技术规程 第1部分：香菇.doc

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1、ICS 65.020.20B 05DB37山东省 地方标准DB 37/T XXXXXXXXX液体菌种制备技术规程 第 1 部分：香菇Technical specifications for the preparation of liquid spawnpart1：Lentinula edodesXXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施山东省 市场监督管理局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI目 次前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 基本要求.34.1 人员要求.3 4.2 产地环境要求.3 4.3 生产设备与设施.35 生产技术.3

2、5.1 工艺流程.3 5.2 品种选择.4 5.3 母种活化.4 5.4 摇瓶液体菌种生产.4 5.5 发酵罐液体菌种生产.5 5.6 贮藏.66 生产档案.7附 录 A （规范性附录） 香菇液体菌种生产记录事项.8DB37/ XXXXXXXXXII前 言本标准依据GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业技术推广总站、泰安市农业科学研究院、山东七河生物科技股份有 限公司、山东惠民齐发果蔬有限责任公司。 本标准主要起草人：赵淑芳、高瑞杰、高中强、王庆武、高霞、司元明、张燕、崔慧、吴元元

3、、 崔晓、张晓雱、王晓婷、林雪、崔艳秋、李霄、黄雪、苏建昌、孙振福、张振宇、李欣。DB37/ XXXXXXXXX1液体菌种制备技术规程 第 1 部分：香菇1 范围本标准规定了香菇液体菌种的术语和定义、基本要求、生产技术和生产档案管理等要求。 本标准适用于香菇液体菌种的制备。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 150 压力容器 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 127

4、28 食用菌术语 GB 19170 香菇菌种 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程3 术语和定义GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 食用菌液体菌种发酵罐 edible mushroom liquid strain fermenter 进行食用菌液体菌种培养的专用发酵设备，应符合GB 150要求。3.2 食用菌液体菌种接种器 edible mushroom liquid strain inoculator 将液体菌种按无菌操作要求接种到固体培养基物料上的工具。3.3 空气压缩机 air compressor 能为食用菌液体菌种

5、发酵生产提供压缩空气的设备。3.4 空气过滤器 air filter 能对食用菌液体菌种发酵罐所用空气进行滤除杂菌和其他杂质，达到无菌洁净要求的设备。3.5 DB37/ XXXXXXXXX2罐压 jar pressure 在液体菌种发酵制备过程中发酵罐内保持的空气压力（表压），单位：MPa。3.6 通气量 ventilation volume 液体菌种培养过程中发酵罐体积与每分钟通入发酵罐中无菌空气体积的比例。用 V/V（发酵罐体 积/通入空气体积）表示。3.7 接种量 inoculation amount 菌种体积与培养基体积的比例，用百分数表示。3.8 液体菌种菌龄 period of l

6、iquid strain running 菌种接入培养基开始计算的液体菌种培养时间。3.9 发酵罐空消 empty fermenter sterilization 对尚未加水投料的空发酵罐进行高压灭菌。3.10 投料 feeding 将配置好的培养基投放到培养器中。3.11 定容 constant volume 培养器中加入培养基后，加水至所要求体积3.12 发酵罐实消 fermenter sterilization 指对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。3.13 罐压回零 jar pressure returning to zero 液体菌种培养过程中，发酵罐内压力回到零点。3.14 摇瓶液体

7、菌种 liquid spawn in flask 装至玻璃菌种瓶内在磁力搅拌器或恒温摇床上培养的液体菌种。3.15 培养基起始pH initial pH value of medium 液体培养基灭菌后尚未接种时的pH。DB37/ XXXXXXXXX34 基本要求4.1 人员要求工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵车间必须穿戴经灭菌处理的工作服、口罩、鞋、帽。4.2 产地环境要求4.2.1 场所要求生产场所符合NY/T 528的环境卫生要求，场地开阔、路面硬化、卫生清洁。4.2.2 厂房要求4.2.2.1 厂房设计应符合 NY/T 528 要求，增设摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室。 4.

8、2.2.2 应设置与职工人数相适应的更衣室，车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。过道应设置 风淋室。 4.2.2.3 车间地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（1.01.5） 和良好的排水系统。 4.2.2.4 墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水。 4.2.2.5 门窗应设置防蚊蝇纱网。 4.2.2.6 车间安装排气管道或者排风设备。 4.2.2.7 液体菌种接种间应设置缓冲间。 4.2.2.8 摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室应符合 GB 50073 要求。 4.2.2.9 车间设封闭式废物桶。4.3 生产设备与设施4.3.1 生产设备与用具应具有磅秤、天平、高压蒸汽

9、灭菌锅、发酵罐、液体菌种接种器、超净工作台、调温设备、除湿 设备、恒温培养箱、恒温摇床或磁力搅拌器、冰箱、显微镜等及常规用具。压力容器应经政府有关部 门检验合格，符合GB 150要求。应具有备用电源。4.3.2 基本设施培养基配制室、摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室规模要配套，布局合理，其中培养基配制室 空间洁净度应达到万级以上，摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室要有调温设施，空间洁净度应达到 百级。菌种检验室和母种制作室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施和常规用具。5 生产技术5.1 工艺流程工艺流程见图1。DB37/ XXXXXXXXX4图 1 香菇液体菌种生产工艺流程5.2 品种选择

10、选用高产、优质、抗逆性强、商品性好的香菇品种，从具有相应资质的供种单位引种且种性清楚。 引种后必须进行适应性出菇试验验证。5.3 母种活化母种活化配方及操作流程应符合 NY/T 528要求。活化后母种质量应符合GB 19170要求。5.4 摇瓶液体菌种生产5.4.1 容器使用无色或近无色专用玻璃菌种甁，可用棉塞（梳棉或化纤棉）、硅胶塞、专用封口透气膜封口。5.4.2 培养基配方可选用以下配方：a)配方 1：葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 3 g，磷酸二氢钾 3 g，硫酸镁 1.5 g，维生素 B1 5 mg，水 1 L，pH 6.06.5；b)配方 2：玉米粉 20 g，葡萄糖 20

11、 g，酵母膏 5 g，牛肉膏 4 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 1 g，维生素 B1 5 mg，水 1 L，pH 6.06.5。 生产用水应符合GB 5749要求，培养基质应符合NY/T 528要求，玉米粉应过20目筛。5.4.3 培养基配制按液体培养基配方配制，玉米粉先用水搅拌均匀，装入摇瓶中，混合均匀，装液量为摇甁容量的 2/53/5，瓶塞封口，并用硫酸纸或牛皮纸包扎。5.4.4 灭菌将分装好的摇瓶放入灭菌锅内，锅内留有一定的空隙。检查锅内水位，立即灭菌。灭菌蒸汽压力 升至0.1 MPa0.12 MPa，恒压维持35 min40 min。5.4.5 接种发酵培养无菌空气摇甁液体菌种母种活

12、化基质培养基配制投料灭菌发酵罐液体菌种发酵罐空消接种DB37/ XXXXXXXXX5待培养基冷却后于消毒过的超净工作台上，用经火焰消毒并冷却后的接种针挑取56块（35） mm（35）mm的母种块迅速转接于待接种摇甁培养基内。5.4.6 摇瓶菌种培养种结束后封口，放入恒温箱中23 25 静置培养1 d，然后置于摇床上震荡培养，摇床温度 控制在23 25 ，转速140 r/min160 r/min，培养时间10 d12 d。5.4.7 摇瓶菌种质量标准培养液澄清透明，无杂菌、无异味；镜检无杂菌、菌丝形态正常；菌丝球、菌丝片段密集，不低 于整个培养液80 %，均匀悬浮于液体培养基中不分层。5.5 发

13、酵罐液体菌种生产5.5.1 煮罐、空消发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种等情况出现其一时，应煮罐和空消。蒸气压力 0.15 MPa、温度126 ，维持40 min。5.5.2 液体菌种培养基配方可选用以下配方：a)配方 1：玉米粉 20 g，葡萄糖 20 g，酵母膏 5 g，牛肉膏 4 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 1g，维生素 B15 mg，消泡剂 0.3 g，水 1 L，pH 6.06.5；b)配方 2：马铃薯 100 g（煮汁），葡萄糖 10 g，麦麸 40 g（煮汁），蛋白胨 2 g，磷酸二氢 钾 2 g，硫酸镁 1 g，消泡剂 0.3 g，水 1 L，pH 6.06.5；

14、c)配方 3：玉米粉 20 g，麦麸 20 g（煮汁），葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，磷酸二氢钾 2 g，硫 酸镁 1 g，消泡剂 0.3 g，水 1 L，pH 6.06.5。 生产用水应符合GB 5749要求，培养基质应符合 NY/T 528要求，玉米粉应过20目筛。5.5.3 投料和定容用水把淀粉、玉米粉等原料搅拌均匀，不能有结块，通过吸管或漏斗加入罐体，装液量为罐体容 量的70 %80 %，加入0.03 %消泡剂，通入空气搅拌1 min2 min，混合均匀，拧紧上料口盖。5.5.4 灭菌发酵罐加热层通入冷水，水位低于排水口20 cm，关闭进、排水阀门加热。待加热层蒸汽压力达到 0.0

15、5 MPa时，缓慢打开排气阀降压至0 MPa，关闭排气阀，再次升压至0.11 MPa；待发酵罐培养层蒸汽 压力达到0.05 MPa时，缓慢打开排气阀降压至0 MPa，关闭排气阀，再次升压至0.11 MPa，同时打开空 气过滤器灭菌，微开排气阀，维持50 min60 min。5.5.5 冷却灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开空气过滤器排水阀降压至0 MPa，加热层通 入冷水降温；同时缓慢打开发酵罐培养层排气阀降压，待压力接近0 MPa时向培养层内通入无菌空气， 调整排气阀，维持罐压0.04 MPa0.05 MPa，培养液温度降至25 以下时，关闭加热层进水阀。5.5.6 接种DB3

16、7/ XXXXXXXXX6接入摇甁菌种，接种量为2 %4 %。将摇瓶接种管和发酵罐接种口用75 %酒精消毒，用95 %酒精 的火焰圈套在接种口上，轻微打开呼吸器阀门，使发酵罐压力为0 MPa。点燃火焰圈，在火焰保护下用 镊子去掉接种管上的牛皮纸和瓶塞，打开接种口阀门，将接种管插入接种口，将摇瓶菌种注入发酵罐。 拔出接种管，关闭接种阀门，去掉火焰圈，打开空气压缩机。5.5.7 发酵罐菌种培养根据菌丝生长情况，适时调节进气按钮，通入适量无菌空气，同时调节排气阀，维持罐压0.01 MPa0.03 MPa，培养温度控制在23 25 ，培养9 d10 d。5.5.8 液体菌种检测5.5.8.1 形态学观

17、察。主要是通过肉眼观察菌球形态，通过显微镜观察菌丝体形态。 5.5.8.2 霉菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量疑有霉菌污染的培养液，接种于 GB/T 4789.28 中 规定的 PDA 培养基中，置于 28 30 恒温培养 48 h，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况和有无 杂菌污染；若出现白色以外的杂色者，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行水封片镜检。 5.5.8.3 细菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量疑有细菌污染的培养液，接种于 GB/T 4789.28 中 规定的营养肉汤培养液中，置于 28 30 恒温培养 24 h48 h，观察培养液是否浑浊。培养液浑 浊，为有细菌污染；培养液澄清，

18、为无细菌污染。 5.5.8.4 pH 测定。取样用 pH 计或 pH 试纸测定菌液酸碱度。pH 小于 5 为不正常。 5.5.8.5 菌丝湿重测定。称取一定体积的培养液，经 1 000 r/min 离心 5 min，称重。5.5.9 发酵罐液体菌种质量标准5.5.9.1 感官要求感官指标应符合表1的规定。表 1 香菇发酵罐液体菌种感官要求项 目要 求菌液色泽菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅棕色菌液形态培养液澄清透明，菌丝球、菌丝片段均匀悬浮于液体中，不分层，直径小于 3.5 mm菌液气味有香菇液体培养时特有的香气，无酸、臭等异味，发酵罐排气口气味正常，无明显改变显微镜下菌丝形态可见香菇菌种液体

19、培养中特有的菌丝形态，菌丝粗壮，分支较少，无杂菌5.5.9.2 理化指标理化指标应符合表2的规定。表 2 香菇发酵罐液体菌种理化指标理 化 指 标要 求pH5.36.0DB37/ XXXXXXXXX7菌丝湿重（g/mL）0.150.185.6 贮藏香菇液体菌种生产后应立即使用，如不能立即使用，需进行贮藏。贮藏环境温度低于20 。发酵 罐内液体菌种，持续通无菌空气，保持罐压0.01 MPa0.03 MPa，可存放2 d。6 生产档案母种、摇瓶液体菌种和发酵罐液体菌种生产的每个环节都要有详实的记录，记录内容按附录A执行。 生产记录归档保存，至少两年。DB37/ XXXXXXXXX8A A附 录 A （规范性附录） 香菇液体菌种生产记录事项香菇液体菌种生产记录事项如下：a)生产投入品使用情况（包括液体菌种的制作培养基质、营养辅料、所用菌种、菌瓶）：1)名称；2)来源；3)用法、用量；4)使用、停用的日期。b)菌种生产（培养基制作、灭菌、接种、培养）及杂菌发生情况：1)培养基制作；2)高压灭菌；3)接种；4)培养。c)贮藏过程及杂菌发生情况；d)主要菌种生产设备及用具：1)主要菌种生产设备；2) 主要菌种生产用具。e)生产场所名称、菌种数量、记录人、入档日期。_