(5)--分子生物学讲稿分子生物学.doc

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1、第一章 基因的结构第一节 基因和基因组一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列一个典型的真核基因包括编码序列外显子(exon) 插入外显子之间的非编码序列内合子(intron) 5-端和3-端非翻译区(UTR) 调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和， 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-

2、value Paradox)。人类基因组计划（human genome project, HGP）基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）第二节 真核生物基因组一、真核生物基因组的特点： ，真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(23)，三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因可能由某一共同祖先基因(ancestral g

3、ene)经重复(duplication)和突变产生。基因家族的特点：基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因； 有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因 (Pseudogene)a1表示与a1相似的假基因四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同第四节 细菌和病毒基因组一、细菌基因组的特点。1

4、功能相关的几个结构基因往往串联在起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，2结构基因中没有内含子，也无重叠现象。3细菌DNA大部分为编码序列。二、病毒基因组的特点1每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；2病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp；3除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。4大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成 5真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子6有重叠基因第五节 染色质和染色体(二)组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷5%的人基因可在不同的组织或生理状态下，通过选

5、择性剪接产生不同的蛋白质异构体，这是造成真接生物高度异质性的基础。第四节 翻译水平调控四、翻译后修饰1、 氨基酸侧链的共价修饰：乙酰化、磷酸化、糖基化（N-、O-）；2、 蛋白质前体的切割和成熟。Proproteinprotein.例：胰岛素的成熟。五、蛋白质的分泌和胞内定位信号肽：作为蛋白质定位信号的短肽序列，指导蛋白质运输到正确位置，定位结束后通常被特异的信号肽酶切除。第四章 原癌基因与抑癌基因第一节 概述病毒致癌作用，病毒癌基因Viral oncogene，V-onc).。细咆癌基因(cellular oncogene ，c-onc)或原癌基因(protoncogene)正常细胞中与v-

6、onc同源的基因，抑癌基因(tumor suppressor gene)：是指由于其存在和表达而抑制细胞癌变的基因。原癌基因与抑癌基因生物学性质差异：1功能：抑癌基因在细胞生长中起负调节作用，抑制增殖、促进分化成熟与衰老，或引导多余细胞进入程序性细胞死亡(PCD)，原癌基因的作用则相反2遗传方式：原癌基因是显性的，激活后即参与促进细胞增殖和癌变过程，而抑癌基因为隐性，只有发生纯合失活时才失去抑癌功能3突变的细胞类型：抑癌基因突变不仅可发生在体细胞中，也可发生在生殖系(germ 1ine)细胞中，并通过其遗传突变，而原癌基因只在体细胞中产生突变。第二节 原癌基因原癌基因是细胞的正常基因，其表达产

7、物对细胞的生理功能极其重要，只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时，才有可能导致细胞癌变。一、原癌基因表达的特点：l、正常细胞中原癌基因的表达水平一般较低，而且是受生长调节的，其表达主要有三个特点：具有分化阶段特异性；细胞类型特异性； 细胞周期特异性。2、肿瘤细胞中原癌基因的表达有2个比较普遍和突出的特点：一些原癌基因具有高水平的表达或过度表达原癌基因的表达程度和次序发生紊乱，不再具有细胞周期特异性。3、细胞分化与原癌基因表达 在分化过程中，与分化有关的原癌基因表达增加，而与细胞增殖有关的原癌基因表达受抑制。二，原癌基因的结构改变与其表达激活(一)点突变(二)染色体易位 染色体易位(trans

8、location)：是染色体的一部分因断裂脱离，并与其它染色体联结的重排过程。(三)基因扩增 即基因拷贝数增加(四)LTR插入 LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复，其中含有强启动子序列。三、原癌基因产物的功能大多数原癌基因编码的蛋白质都是复杂的细胞信号转导网络中的成份，在信号转导途径中有着重要的作用原癌基因产物可作为：1、生长因子，如sis(PDGF-)，fgf家族(int-2，csf-1等)2、生长因子受体(质膜)：具酪氨酸蛋白激酶活性，如neu，ht，met，erbB，trk，fms，ros-1等。 3、非受体酪氨酸蛋白激酶(质膜胞质) 如src家族：src，syn，fyn，abl，

9、lck，ros，yes，fes，ret等4、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(胞质)：如raf，raf-1，mos，pim-1，5、G蛋白(质膜内侧)，具GTP结合作用和GTP酶活性，如ras家族中的 H-ras，K-ras，N-ras，以及mel和ral等 ，6核内DNA结合蛋白(转录因子) 如myc家族，fos家族，Jun家族，ets家族，rel，erb A(类固醇激素受体)第三节 抑癌基因一、抑癌基因失活与杂合性丢失抑癌基因为隐性癌基因，只有发生纯合失活时才对肿瘤形成起作用，通常的表现为抑癌基因的一个等位基因丢失，面另一个存留的等位基因发生突变(点突变、微缺失，重排等)，等位基因丢失常伴有抑癌基因相

10、邻区域的杂合性丢失(Loss of heterozygosity，LOH)，LOS指肿瘤中特定染色体上某种DNA多态性标志(如RFLP，VNTR、STR或SSCP等)的等位基因片段在同一患者中由正常组织基因组中的两种变为一种，即等位基因型由杂合子变为纯合子。LOH是肿瘤细胞中部分染色体区域缺失的表现。二、抑癌基因产物的功能巳知的肿瘤抑制基因及其蛋白产物功能基因 相关癌 产物胞内定位 作用p53 Rb WT-1 APC DCC NF l RET VHL P16(MTS-1) WAFCIPl BRCAl 肺癌、乳腺癌等（51种） 视网膜细胞瘤等wilm肿瘤 结肠癌 结肠癌 神经纤维 瘤甲状腺癌 肾

11、癌 黑素瘤等(多种) 多种乳腺癌、宫颈癌等 核胞质？ 粘附分子GTP酶激活剂受体酪氨酸激酶 转录延伸因子 CDK抑制剂 CDK抑制剂 转录因子 抑癌基因p53人P53基因定位：17P13，11个外显子编码393个氨基酸。p53基因突变：存在于一半以上的人肿瘤中，多为点突变，主要发生于外显子5-8,如肝癌中的249号密码子第3碱基GT ,与黄曲霉素B1有关。 P53蛋白结构和功能：P53蛋白为核内转录因子，包括核心区的DNA结合域；N端转录激活域；C端介导寡聚体化的结构域。1、 P53的中央域识别和结合一个10bp的启动子序列，可激活转录（通过N-端的反式激活域）。P53突变大多发生于中央DNA

12、结合域。2、 P53也可结合DNA损伤时产生的单链区域。3、 P53是四聚体，寡聚化需要C-端域4、P53激活cki p21, 后者抑制细胞周期于G1期. 5、 p53 激活与负责辐身损伤的修复蛋白GADD45，维持基因组稳定性。 6、P53诱导凋亡的机制尚不清楚。 7、正常情况下p53以低水平存在，半衰期短。DNA损伤稳定P53并增加其转录活性8、Mdm2使p53不稳定，易被降解，并能直接抑制其反式激活活性（Mdm2是癌基因） 第五章 信号转导细胞外信号通过与细胞表面的受体相互作用转变为胞内信号并在细胞内传递的过程称为信号转导(signal transduction)跨膜信号转导过程包括：1

13、，胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；2，通过胞内信号转导物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用传递信号；3，信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答（如激活核内转录因子，调节基因表达）。第一节 胞内信使细胞内信使(intracellular messenger)是具有信息传递作用的一些小分子，也称为第二信使(second messengers)。一、cAMP环磷酸腺苷) ，生成： 腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP;代谢： cAMP磷酸二酯酶水解cAMP产生5-AMP功能： ，激活蛋白激酶A抑制蛋白磷酸酯酶二、cGMP(环磷酸鸟苷)生成酶：鸟苷酸环化酶代谢酶：cGMP磷酸二酯酶功

14、能：激活蛋白激酶G 调控细胞膜离子通道三、三磷酸肌醇（inositol triphosphate,IP3）和甘油二酯（diacyglycerol, DAG）G-蛋白偶联受体激活磷脂酶C生成IP3及DAG功能：1、IP3：开放胞内钙库，激活Ca2+途径2、DAD：在Ca2+和磷脂酰丝氨酸存在下，激活蛋白激酶C，四、钙离子细胞内钙离子主要贮存于胞内钙库(如肌细胞的肌浆网，SR)和线粒体中。细胞质膜两铡Ca2+跨膜梯度：细胞外液胞浆胞浆内Ca2+的调节一通过(质膜和钙库膜上的)钙离子通道(进入)和钙泵(出)，钙通道开放的条件：质膜或钙库膜去极化(可兴奋细胞)；成IP3介导钙库膜上钙通道开放(任何细胞

15、)钙泵激活线粒体钙泵的作用Ca2+功能：与钙调蛋白(calmodulin, CaM)结合形成Ca2+CaM复合物：激活腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶，激活Ca2+CaM依赖蛋白激酶钙通道阻断剂及其临床应用。五、一氧化氮(NO)NO合成酶催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸NO合成酶(NOS)分类：神经元型(nNOS)内皮细胞型(ecNOS)诱导型（iNOS)功能：激活乌苷酸环化酶，刺激cGMP合成。NO的生理病理作用第二节 蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶蛋白激酶(Protein kinase，PK)催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯（ATP的磷酸基转移至氧）蛋白质磷酸酯酶(Protein p

16、hosphatase，PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种相反酶活性之间的平衡决定的。蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。一、信号转导过程中的蛋白激酶一)丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(SerThr PK)是一大类特异地催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的激酶家族，参与多种信号转导过程。1、蛋白激酶A（PKA)-cAMP依赖性蛋白激酶.PKA由两个催化亚基C和两个调节亚基R所构成PKA参与cAMP介导的转录水平调控。PKA的其它(下游)底物：多种代谢相关酶核内组蛋白和非组蛋白膜蛋白等。

17、2、蛋白激酶C(PKC)-Ca2+激活的磷脂依赖性蛋白激酶调节：可被Ca2+，DAG和磷脂酰丝氨酸激活TPA(佛波酯)也可激活PKC分子由N-端的调节区和C端催化区（亲水的蛋白激酶结构域）所组成。 PKC有多种亚型(12种)PKC可激活：受体，如EGFR，胰岛素受体，细胞因子受体等。细胞骨架蛋白如Map，Tau膜蛋白，如Na+-H+交换蛋白，Ca2+-ATP酶等核蛋白转录因子，起始因子等，信号转导物如鸟苷酸环化酶，Raf-1等3、Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Cam-PK)Cam-PKII是一种多功能的蛋白激酶4。cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)功能：调节胞内钙离子5，DNA依赖的蛋白激酶(

18、DNA-PK)调节：结合游离DNA片段后被激活，底物：核内DNA结合蛋白和转录因子，如SPl，FosJun，Myc和P53，作用：参与DNA修复和重组,通过激活TF调节基因表达;参与细胞周期的关卡机制(Checkpoint).6丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase， MAPK)调节：MAPK激酶-MAPKK（MEK）。下游底物：核内转录因子如Myc，Jun，Ets及其它胞内蛋白(二)酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine protein kinase，TPK)特异地催化蛋白质的酪氨酸残基磷酸化，蛋白质酪氨酸磷酸化在细胞生长，分化和转化的调节中起重要作

19、用。1、经典的src激酶家族原癌基因c-src蛋白产物Src是一种酪氨酸蛋白激酶，它有三个基本结构域：从C-端至N-端依次为SH1、SH2，SH3(SH=src homolog)。SHl结构域：具酪氨酸激酶活性，SH2结构域：能识别并结合含磷酸化酪氨酸的短序列，SH结构域：通过脯氨酸和疏水性氨基酸残基与靶蛋白结合，Src家族：包括原癌基因src，yes，lyn，fyn，lck，blk，fgr，bcd和yrk编码蛋白，它们都有TPK活性共同参与细胞转化的信号转导过程SH2结构域在信号转导途径中的重要作用：由于含SH2结构域的信号转导分子可以识别和结合其他含磷酸化酪氨酸的蛋白，因此，通过蛋白质的酪

20、氨酸磷酸化去磷酸化调节可以决定信号转导分子的结合与解离，从而导致信号的开启或关闭。2、JAK嫩酶家族JAK(Janus kinase)激酶家族包括Jakl，Jak2，Jak3，Tyk2等，Jak激酶具有一个TPK结构域和一个激酶样结构域，它们与Src的TPk激酶结构域具有同源性，但JaK激酶没有SH2，SH3结构域；Jak激酶主要参与细胞因子的信号转导二、蛋白磷酸酯酶对磷酸化的调节(一)、丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酯酶 这类酶选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C，等PP2A，催化亚基及其功能 (二)酪氨酸蛋白磷

21、酸酯酶(PTPase)蛋白质酪氨酸磷酸酯酶催化磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应，与相应的酪氨酸蛋白激酶共同调节蛋白质的磷酸化水平，PTPase家族可分为2类：1、胞质型(非受体型)：小的可溶性蛋白，只有一个催化结构域，特点是合有SH2 domain，如PTPlC，PTPlB等 ，2受体型(PTPR)，是大的跨膜蛋白，特点是有2个串联的胞浆催化结构域，如白细胞共同抗原CD45，PTPlC(存在于造血细胞)：N端2个串联重复的SH2结构域识别TyrP，并指导蛋白与蛋白结合)，C端为磷酸酯酶催化结构域。Jak可作为PTP1C底物PTPase基因可能是肿瘤抑制基因第三节 细胞膜受体介导的信号转导一、受体

22、的分类质膜受体和胞内受体（胞浆或核受体，如类固醇激素受体）膜受体的分类：（一）G蛋白耦联受体家族又称为七次胯膜受体家族，特点是具有七段跨膜的螺旋结构，本身无酶活性，胞浆侧肽链上有磷酸化位点，受体功能受磷酸化调节。成员；肾上腺素受体、多巴受体、视紫红蛋白等。（二）酪氨酸激酶受体家族受体本身胞浆侧有蛋白酪氨酸激酶活性，并且胞浆侧肽链上有自身磷酸化位点，配基结合后受体形成二聚体，二聚体中每个亚基可以磷酸化对应的另一亚基，从而启动信号转导。这类受体主要包括多数生长因子受体(如IGF，EGF，PDGF，NGF，SCF，HGF等生长因子的受体)，除胰岛素受体外，这类受体均由一条肽链组成(三)细胞因子受体家

23、族这类受体本身无TPK活性，但其胞浆侧近膜部分有非受体酪氨酸蛋白激酶的结合位点，在配基与受体结合后，受体发生二聚化或寡聚化，并激活Jak族蛋白酪氨酸激酶此类受体包括细胞因子受体以及生长激素、促乳素等受体细胞因子(cytokine)：是淋巴细胞和造血细胞产生的一大类对细胞生长和分化有调节作用的蛋白因子。包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、白血病抑制因子（LIF）、抑癌素M等 (但IL-8R为G蛋白藕联受体)(四)离子通道受体与配基结合后构成离子通道，主要存在于神经突触，如乙酰胆碱(ACH)，5-HT受体等。二、G蛋白介导的信号转导 。G蛋白藕联受体的信号转导途径由三部分组成：细胞膜受体；G

24、蛋白效应物(effector)，其中G蛋白将受体与效应物藕联G-蛋白(G-protein)是一种鸟苷酸结合蛋白，是由、和三个亚基组成的异三聚体， 多，和亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位GG亚基可分为Gs,Go,Gi,Gq等，其活性可被霍乱毒素（CT）或百日咳毒素（PT）修饰。G-蛋白介导的信号转导的机制：G-蛋白循环。G-pr的效应物：离子通道、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2等三、RAS-MAPK信号转导途径1、途径中的信号分子Ras：具鸟苷酸结合活性的一种胞浆蛋白（与G-蛋白不同）Ras活性与其结合的鸟苷酸有关。鸟苷酸交换因子（SOS）RasGDP RasGTP(失活) GTP酶激

25、活蛋白（GAP） （激活） 接头蛋白：生长因子受体结合蛋白Grb2，通过其SH2结构域与Tyr被磷酸化的受体结合，同时通过其SH3域与具有pro富集区的SOS结合，并通过SOS活化Ras蛋白2、Ras-MAPK途径：生长因子生长因子受体(具酪氨酸激酶活性)含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)鸟苷酸交换因子SOSRas-GTPRaflMAPKK（MEK）MAPK转录因子调节基因表达。3Ras-MAPK途径的调节Ras-MAPK途径中信号转导分子的突变(如Ras)和表达量的改变其他信号转导途径的影响cAMP-PKA：抑制Raf-1； PKC：活化Rafl，四、Jak-stat途径：STAT：信

26、号转导物与转录激活剂（signal transducer and activators of transcription）至少6种，分子量84-113KD，含一个SH2结构域(羧端)，一个SH3样结构域，并合有DNA结合域，Stat的激活依赖通过磷酸化形成二聚体Jak-Stat途径：细胞因子受体(二聚体化)JakStatStat二聚体(活化)易位至核，影响转录 第六章 细胞周期及其调节细胞增殖(cell proliferation)与细胞生长分裂周期第一节 细胞周期一、细胞周期(cell cycle)：指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程，这个过程所需的时间称为细胞周期时间。细胞周

27、期由G1、S、G2和M期组成(G1、S和G2期又合称为分裂间期)。G1(Gap1)期：DNA合成前期(复制前期)，从上次有丝分裂完成到DNA复制之前的阶段;S期：DNA复制期;G2期：合成后期，从DNA复制完成至有丝分裂开始;M期：有丝分裂(Mitosis)期，包括核分裂和胞质分裂M期结束后形成两个新的子细胞。注：不同细胞的细胞周期时间不同，一般S+G2+M期较恒定，而G1期变化较大，因而它决定了细胞周期时间的长短；G1期细胞有三种可能的趋向：1)进入S期(即进入细胞周期)2)处于静止期即Co期(在一定条件下可重新进入增殖周期)，3)分化、衰老、凋亡。二、细胞周期中各时相的主要生化事件细胞周期

28、中每期都有其特殊功能，其中S期的DNA复制和M期细胞核的有丝分裂是细胞周期中2个最关键的过程：1、G1期：为DNA复制作准备，G1早期合成各种RNA、结构蛋白和酶等，细胞通过一个限制点(restriction point，R点)后在G1后期合成DNA复制有关的蛋白和酶。在开始合成DNA之前有一个关卡(checkpoint)，检查染色体DNA是否有损伤，如有则先要进行修复。2、S期：DNA(包栝端粒)的复制及组蛋白合成、核小体装配S期后每一染色体复制成2个染色单体 SG2期关卡：检查DNA复制是否完成3、G2期：为有丝分裂作准备有RNA和非组蛋白合成。4、M期：染色体浓缩一仿锤体形成染色体分离并移向细胞两端染色体解聚，形成两个新核胞质分裂。第二节 周期素依赖性蛋白激晦与细胞周期调节周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent