(4.15)--核酸扩增试验在淋病诊断和治疗中的研究进展.pdf

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1、中国性科学2018 年 11 月第 27 卷第 11 期The Chinese Journal of Human SexualityNovember，2018Vol27 No 11135菌性阴道病的疗效观察 河北医药，2017，39(9):1384-1386 9李东辉，颜志中 制霉素联合乳酸菌治疗妊娠期复发性外阴阴道念珠菌感染的临床疗效观察 医学研究杂志，2016，45(7):105-107 10Monteiro D，Takamiya AS，Feresin LP，et al Susceptibility of Candi-da albicans，and Candida glabrata，bio

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4、ization of Candida species from patients with vul-vovaginitis Brazilian Journal of Microbiology，2016，47(2):373-380 17丁桂英，张玲云 保妇康栓联合雌激素软膏治疗老年糖尿病性阴道炎的疗效及对患者生活质量的影响 中国性科学，2016，25(2):60-62 18朱晓莺，邓晓杨 中西医结合治疗复发性支原体感染性阴道炎临床研究 中医学报，2017，32(2):293-296(收稿日期:2017-09-01)【基金项目】中华医学会临床医学科研专项资金(14020210558)【第一作者简介

5、】陈康宁(1992)，男，住院医师、在读硕士研究生，主要研究方向为男性不育、性功能障碍和性病的诊治【通讯作者】董治龙(1978)，男，主任医师、博士，E-mail:dzl1997student sina comDOI:10 3969/j issn 1672-1993 2018 11 041皮肤性病学核酸扩增试验在淋病诊断和治疗中的研究进展【摘要】淋病是一种由淋病奈瑟菌感染引起的性传播疾病，临床表现主要为泌尿生殖道感染，如不及时诊断和治疗往往会引起严重的并发症。实验室的检测在淋病的诊断和治疗中具有十分重要的作用。近年来，随着 PC 技术的迅速发展，快速、敏感、特异性高的核酸扩增试验已经成为实验室

6、检测的重要手段。本文就核酸扩增试验在淋病诊断和治疗后诊断的最新研究进展加以综述，期盼能够为淋病的诊疗提供新的方法。【关键词】淋病;核酸扩增试验;淋球菌;研究进展Nucleic acid amplification test for diagnosis and treatment of gonorrhea:Advances in studiesCHENKangning，GAO Ke，LI ongxin，DONG Zhilong esearch Institute of Urology，The Second Hospital of LanzhouUniversity/Key Laboratory

7、for Urinary System Diseases of Gansu Province/Center of Clinical Medicine for UrinarySystem Diseases of Gansu Province，Lanzhou 730030，Gansu，China【Abstract】Neisseria gonorrhoeae is the pathogenic bacteria of the sexually transmitted disease gonorrhea，which is characterized by acute urethritis in men，

8、and cervicitis in women Unrecognized and untreated infectionthat may lead to serious complications Laboratory testing plays a very important role in the diagnosis and treatmentof gonorrhea In recent years，high peed，sensitivity，specificity nucleic acid amplification test has been an impor-tant method

9、 of laboratory testing with rapid development of PC Technology The present article focuses on the re-cent advances in the studies of nucleic acid amplification in the diagnosis and posttreatment diagnosis of gonorrhea toprovide a new method for the diagnosis and treatment of gonorrhea【Key words】Gono

10、rrhea;Nucleic acid amplification test;Neisseria gonorrhoeae;Advances in studies淋病是一种由淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae，NG)感染引起的性传播疾病，近年来世界淋病有明显增加的趋势，其发病率居我国性传播疾病第二位，罹患该病的患者逐年呈直线增多趋势，成为性病的主要发病病种1，发病率在 30/10 万左右2。淋病发病率高、社会危害性大，感染后若不及时治疗，可以伴发多种合并症。其临床主要表现为泌尿生殖系统化脓性炎症(尿道炎和宫颈炎)，早期诊断与治疗是控制淋病传播的关键。但是，大多数女性感染淋球菌后

11、无明显泌尿系统症状，不能及时接受诊断和治疗，继而引起盆腔炎症性疾病、异位妊娠、不 136 中国性科学2018 年 11 月第 27 卷第 11 期The Chinese Journal of Human SexualityNovember，2018Vol27 No11孕等严重并发症。据统计，大约有 15%的淋病女性患者发生输卵管阻塞和不孕;男性患者则由于未得到及时的诊断治疗，而导致附睾炎、尿道狭窄、不育等严重并发症;新生儿淋菌性结膜炎则会引起新生儿失明3。有关研究4 发现，5%20%的男性和 60%的女性感染者呈现无症状感染，女性无症状感染者的大量存在增加了淋病传播的风险，同时延误了及时治疗的

12、时机，更容易导致并发症，引起不孕、异位妊娠等不良后果。国外对于 25 岁有性生活的育龄妇女及有感染风险的高龄女性推荐每年进行淋病筛查，我国尚无明确规定5。实验室的检测对于淋病的诊断、治疗和有效控制等具有十分重要的作用。目前，常用的实验室检测方法有直接涂片法、核酸扩增试验(nucleicacid amplification test，NAAT)、分离培养和快速抗原检测法等，细菌培养检测法仍然是 NG 临床检测的金标准。由于 NG 在人体外抵抗力极弱，且随着 NG 耐药性的逐年提升，使得 NG 培养日趋困难，同时传统方法均不同程度存在着漏检现象。随着分子生物学技术的发展，快速、敏感的 NAAT 在

13、淋病的诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。本文就近年来 NAAT 在淋病诊断和治疗后诊断加以概述，期盼能够为淋病的诊疗提供新的方法。1NAAT 在淋病诊断中的应用在淋病常用的实验室检测方法中，直接涂片法具有简便、快捷、直观的优点，但是其阳性检出率较低，尤其是症状轻微的女性患者检出率更低，同时对检测者的技术和经验要求很高6。快速抗原检测法同样也存在着检出率低的情况。细菌培养法依然是诊断 NG 感染的金标准，但 NG 培养条件苛刻，不少患者在就诊前接受过非正规的抗生素治疗，增加了细菌培养的难度，加之报告时间长难以被患者接受等，这些缺点使得该方法的临床推广应用受到制约，但细菌培养法可以同时检测NG

14、对于抗生素的敏感性，能够为临床治疗提供依据。NAAT 是一种非培养检测方法，操作简单，出结果较快，对标本的留取亦无太高的要求。传统的 NG 检测主要采集泌尿生殖道分泌物为标本，会给患者带来取样痛苦，降低了其检测意愿7，而 NAAT是一种可同时检测泌尿生殖道分泌物和尿液标本的非侵入性检查方法，不仅减轻了患者痛苦，也减少了临床医生的工作量8，同时还可以检测出存活细菌和死细菌，即便患者接受抗生素检查也可以诊断出来9。在临床实际应用中，初次感染或反复感染急性期可以选择 NAAT 与培养法同时进行检测，临床症状不典型或抗生素治疗效果观察亦可以选择 NAAT10。NAAT 主要包括常规 PC、DNA 实时

15、荧光定量 PC 法(real-timefluorescence quantitative PC，T-PC)和 NA 实时荧光恒温扩增检测法(simultaneous amplification and testing，SAT)，其中 SAT法的阳性检出率高于实时荧光定量 PC11。王彦彬等8 的研究发现，SAT 检测灵敏度为 100.0%，特异度为 98.2%。与常规PC 相比，T-PC 无需后续处理。此外，整个检测过程中仅需要在加样时开盖，其余时间可以保持密闭操作，因而在简化操作流程的同时还可以降低因污染物的原因造成的假阳性概率12。NAAT 检测出 NG 的敏感性高达 99%，在女性患者中

16、，尿液 NAAT 敏感性比阴道和宫颈拭子低 10%13;在男性患者中，首段尿标本与尿道拭子的敏感性相当，甚至在某些情况下更优，更易于采集14。NAAT 检测法是针对细菌的 DNA 或者NA 进行检测，因此它能够克服标本过少的问题。宋潇等15 的研究发现，采用 PC 检测法阳性率为 73.1%，细菌培养法为44.8%，直接涂片法为 17.9%。其中，PC 检测法阳性检出率明显高于其他检测方法，可以作为临床慢性淋病的首选检查方法。韦敏 等16 的 研 究 也 发 现，T-PC 法 的 阳 性 检 出 率(97.9%)明显高于培养检测法的阳性检出率，与培养检测法阳性比较，在检测线性范围、检测重复性、

17、检测灵敏度、检测特异性和检测试剂稳定性等方面具有一定的优势，而且受检测标本类型影响较小。淋病经常合并有解脲支原体(ureaplasma urealyticum，UU)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，CT)的感染。国内的研究17 发现，407 例淋病患者混合 UU 和(或)CT 感染146 例，混合感染率达 35.9%，而 UU、CT 感染患者症状较轻或无症状。因此，当淋病患者混合 UU、CT 感染时，UU、CT 容易被漏诊而延误治疗。T-PC 检测通常扩增不同目的 DNA 片段，可以同时检测多种病原微生物18。国内已经成功建立了针对 NG、UU、CT 的多重T-PC

18、法检测方法，多重 T-PC 法灵敏度为 100%，3 种病原体检测特异性均高于 98.5%;同时，1 份标本同时可以检测 3 种病原体，提高了检测效率和准确率，对提高临床诊断治疗水平和开展流行病学调查具有重要意义19。标准的 NAAT 是运用 Aptima Combo 2(AC2)转录介导的扩增分析法(Hologic Gen-Probe，San Diego，CA)，在 Tigris DTS 系统(Hologic，San Diego，CA，USA)中对第一段尿标本及宫颈、尿道及阴道拭子进行 NG 和 CT 的检测20-21。ice 等人认为，NAAT 和细菌培养需要留取所有可能发生 NG 的粘膜

19、样本，甚至包括血培养、关节滑液、脑脊液和皮肤破损部位22。相对于培养法，NAAT 的标本选取范围广，但在一些身体部位的 NG 感染检测中受到限制。口咽中存在共生奈瑟菌，因此用 NAAT 检测口咽部 NG 感染可能会出现假阳性结果。近年来，在使用PC 技术上衍生的新技术反向线点杂交技术检测时，NG 的特异性检测探针只与 NG 杂交，不与脑膜炎奈瑟氏菌杂交，避免了假阳性的发生23。虽然 NAAT 具有灵敏度高、特异性强、准确和快速的特点，但是此种方法容易出现假阳性结果，对实验室环境要求高，操作过程中一定要特别仔细认真，严格按照 PC 标准操作程序实施，制定有效的防污措施，杜绝残留污染和样品间扩增序

20、列交叉污染;同时，实验全过程必须设立阴阳性对照，严防假阳性和假阴性。此外，考虑到试剂和仪器设备都比较昂贵，临床上应当根据患者需要加以选择应用。2NAAT 在淋病治疗后诊断中的应用从 80 年前开始使用抗生素治疗 NG 到现在，NG 逐渐对青霉素类、四环素类、喹诺酮类，甚至头孢菌素类抗生素产生了耐药性，NG 的抗药性已经成为世界主要公共健康问题之一24，尤其是多重耐药已经成为淋病防治的一个难点。2009 年至 2014年，世界卫生组织全球淋球菌微生物药物监测规划发现，97%的国家存在耐药菌株;对阿奇霉素的耐药性不断增加(81%)，且目前最后治疗手段 超广谱头孢菌素口服头孢克肟或注射用头孢曲松钠，

21、已经出现耐药性(66%)25。NG 抗药性的发生可能与其具有自我调节能力，即通过变异获得抗药性或降低药物治疗效果有关15。许多研究认为，NG 对氟喹诺酮类药物耐药性的发生主要与 gyrA 和 parC 基因 QD 区突变密切相关，其中 gyrA 基因 QD 区突变是淋病奈瑟菌氟喹诺酮耐药的主中国性科学2018 年 11 月第 27 卷第 11 期The Chinese Journal of Human SexualityNovember，2018Vol27 No 11137要原因，parC 基因突变与 NG 对氟喹诺酮类药物高度耐药有关26。赵立红27 研究中建立的 Taqman T-PC 方

22、法，可以用于临床标本中 NG parC 基因点突变检测，从而快速筛出氟喹诺酮高水平耐药株。NG 多重耐药性的产生可能与其可传递多重耐药(multiple transferable resistant，mtr)系统有关。许志萍等28 的研究发现，30 株 NG 的多重耐药株(对 3 种及以上药物耐药)为 11 株，多重耐药率为 37%。采用 PC 扩增其 mtr 基因发现，在这 30 株菌株中，仅对 1 种抗菌药物耐药和仅对 2 种抗菌药物同时耐药的临床株未发现 mtr 基因突变，因此可以采用NAAT 检测 mtr 基因来检测 NG 的耐药性从而指导治疗。在多数国家，淋病患者接受标准治疗后效果较

23、好，因此治疗性诊断是不被提倡的。见于无症状 NG 感染的频发和目前检测抗生素的抵抗性方法有限，学者建议对咽喉 NG 感染、持续NG 感染及接受非标准治疗的患者进行治疗性诊断29。2012年，Hjelmevoll 等人通过监测接受口服 400mg 头孢克圬的 27 名淋病患者 porA 基因的表达情况，发现 7d 和 14d 后，患者尿道NG DNA 清除率分别为 84%和 100%30。2014 年，Beymer 等人对 194 名接受头孢菌素类药物治疗的同性恋患者的尿道和肛门标本的 NG DNA 进行 NAAT 检测，发现治疗后 7d 患者的尿道NG DNA 清除率为100%，肛门 NG 清

24、除率为92%31。2015 年，Bissessor 等人对接受头孢曲松联合阿奇霉素的 190 名男同性恋患者的口咽和肛门标本的 porA 和 opa 基因进行检测，发现在口咽部感染 NG 的患者中，7d 后 NG DNA 为阳性的患者占比为13%，14d 后，仍有8%的患者 NG DNA 检测结果为阳性;在肛门感染 NG 的患者中，治疗后 7d 和 14d 淋球菌 DNA 阳性患者占比分别为6%和8%32。同年，Carolien 等人对62 名 NG 患者进行一次性肌肉注射 500mg 头孢曲松后 28d，发现 NG NA 和DNA 被清除的中位时间均为 2d;95%的患者 NG NA 和 D

25、NA分别在治疗后6d 和9d 被清除;不同部位 NG 的 NA 和 DNA 清除时间亦有所不同，NG NA 在尿道、肛门和子宫的清除时间分别为 5d、5d 和 7d，NG DNA 在上述 3 个部位的清除时间分别为15d、4d 和 8d33。T-PC 法检测靶标为 NG DNA，而 DNA 在环境中较为稳定，需要 2 3 周才能彻底分解，因此 T-PC 法不能够区分病原体是死菌还是活菌，难以即时判断 NG 治疗效果。而 SAT 只检测病原菌体 NA，只有活菌才有完整的 NA片段，故能够排除患者治疗后病灶处残留 DNA 对检测结果的影响;NA 在环境中极不稳定8，病原体死亡后其 NA 很快降解，

26、降解后检测结果均为阴性，可以很好地用于临床疗效评估，且靶标和扩增产物都是 NA，不易污染，不易出现假阳性11。综合上述研究结果发现，对于大部分淋病患者，接受标准的头孢菌素治疗后 14d，可以进行 NAAT 检测感染部位 NG DNA 和NA 是否被清除。但是，由于 NG 感染部位的差异和少数患者短期内复发，NG DNA 和 NA 的清除时间亦有所不同。由此可知，我们仍然需要继续探索适宜的 NG 治疗性诊断时间。对于短期内复发和治疗无效的患者，NAAT 不是最佳选择，分泌物NG 培养依然是最重要的检测手段34。2015 年，Carolien 等人用 AC2 转录介导的扩增分析法，分别对 ESwa

27、b 标本和标准 NAAT 标本进行 NAAT 试验，NAAT 试验结果为阳性的标本需要进行延迟的 NG 培养。该种方法不仅可以保持 NAAT 的高敏感性，也可以延长 NG 的体外生存时间，保证 NG 体外培养的有效性35。结果发现，ESwab 样本中的尿液和尿沉渣的 NAAT 与细菌培养结果无明显差异。肛周样本NAAT 为阳性结果的样本，普通细菌培养和用 ESwab 样本细菌培养的结果大致相同，尿液的一致性相对较低。因此，ESwab 系统可以对治疗前后的淋病患者进行诊断和治疗监测;若治疗后检测结果为阳性，还可以及时地为临床检验工作者提供有效的细菌培养标本，为临床医生选择有效的抗生素提供重要依据

28、。3NAAT 在淋病诊疗中应用的探讨对于高危或者怀疑患有淋病的患者进行特殊的微生物感染诊断是有必要的，及时有效的诊断治疗可以降低淋病的并发症，防止淋病复发和传播。细菌培养和 NAAT 是检测 NG 感染的 2 种主要手段。由于 NAAT 的敏感性和特异性均高于细菌培养，其具有操作简单、出结果快等特点，从而逐渐取代细菌培养，成为诊断 NG 感染的首选方法。但是，目前在肛门、口咽、结膜等部位感染的检测仍然只能选用细菌培养法，国际上还未允许将 NAAT 用于这些部位的检测，其原因可能与上述部位存在 NG同类菌属，用高敏感性的 NAAT 检测容易产生假阳性结果有关。但是，随着 PC 技术的不断改进，为

29、上述部位 NG 感染的诊断提供了可能。同时，在一些人口数量少、经济欠发达的国家，NAAT 的可行性亦受到限制。淋病的患者往往合并有 UU 和 CT的感染，多重 T-PC 法可以同时检测出多种病原微生物，对提高临床诊断治疗水平和开展流行病学调查具有重要意义。Car-olien 等人建议，用 ESwab 系统保存患者 NG 感染部位的标本，以确保其核酸扩增试验结果为阳性后，可以立即进行 NG 培养。但是，ESwab 内保存的 NG 亦随着时间推移其活性下降，影响了细菌培养的结果;同时，其实验的标本主要源于尿道、肛门和宫颈。因此，有必要继续优化 ESwab 系统的培养基，提高 NG 活性，延长其保存

30、时间，提高 NG 的检测率;同时，亦需要继续研究该种方法在口咽、眼睑等部位应用的可行性。近年来 NG 耐药性的问题日益严重，尤其是多重耐药菌的出现更给淋病的治疗和治疗后诊断带来了困难。新的 NAAT 技术可以通过检测不同的基因位点检测出 NG 对不同抗生素的耐药性，指导淋病的临床治疗，但是相关的研究较少、耐药性机制不明、不同菌株耐药性的差异性和变化性较大，可以指导临床治疗的稳定的、特异的、全面的、创新的 NAAT 方法仍然有待后续的研究。目前，对于非复杂性的宫颈、尿道、肛门和咽部的 NG 感染，首选的治疗方案为头孢曲松单次剂量 250mg 肌肉注射联合单次口服 1g 阿奇霉素36。一般来说，非

31、复杂性尿道或肛周感染NG 患者接受标准治疗后不需要对其进行治疗性诊断，但是，在接受选择性治疗方案后，咽部感染 NG 的患者，需要在治疗后14d 接受回访，进行细菌培养或 NAAT。如果 NAAT 结果为阳性，则需要对感染标本进行细菌培养。所有治疗性诊断细菌培养阳性的患者还需要继续进行药敏试验，ESwab 系统有可能成为一个不错的选择。迄今为止，关于 NAAT 监测淋病患者的合理时间的研究仍然较少，因此仍然需要开展更多的相关研究，进一步明确淋病患者接受治疗后合理的回访时间。值得注意的是，上述研究纳入的多数患者已经表现出明显的与淋病相关的临床症状。因此，对于口咽、眼睑等部位存在的感染，无明显临床症

32、状及同时感染 CT、UU 的患者，如何更有效地运用 NAAT 进行诊断，如何制定合理的治疗性诊断监测时间等问题仍然有待解决。4NAAT 在淋病诊疗中应用的展望NAAT 检测 NG 具有高敏感性和特异性。但是，由于致病 138 中国性科学2018 年 11 月第 27 卷第 11 期The Chinese Journal of Human SexualityNovember，2018Vol27 No11微生物的复杂性、感染部位的多样性和耐药的严重性，临床上尚需要开发新的 NAAT 技术，使其既可以满足同时检测多种致病微生物，又可以检测全身不同部位 NG 的感染，通过检测 NG菌株基因位点的变化确

33、定对不同抗生素的耐药性，以更好地指导临床治疗。此外，还需要探索合理的诊断性治疗监测时间，为选择合理的治疗方案提供可靠保障，减少抗生素的滥用，节约宝贵的医疗资源。参考文献 1卓卫.CTB 与 FQ-PC 对女性淋球菌感染的鉴别诊断意义 医学理论与实践，2017，30(19):2927-2928 2胡跃华，李镒冲，刘世炜，等 中国 20 年间淋球菌、性传播衣原体、梅毒螺旋体的发病情况及其疾病负担 疾病监测，2015，30(11):904-910 3Llata E，Bernstein KT，Kerani P，et al Management of pelvic inflam-matory disea

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