(1.13.2)--中国枣树干腐病菌群体遗传多样性的ISSR分析遗传学.pdf

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1、中国枣树干腐病菌（Botryosphaeria dothidea）群体遗传多样性的ISSR分析摘要：【目的】从分子水平上揭示我国枣树干腐病菌群体的遗传特点，探究其遗传变异的规律。【方法】采用正交实验设计的方法，对影响ISSR-PCR扩增的4个因素进行研究。采用ISSR分子标记，对161株供试病原菌进行PCR扩增，通过PopGene和Arlequin软件对其群体遗传多样性和遗传分化情况进行分析。【结果】从40条ISSR引物中筛选到10条扩增多态性良好的引物，建立了适合枣树干腐病菌ISSR-PCR扩增的体系。采用该体系共在132个位点扩增出条带，其中多态性位点129个，多态性位点百分率为97.93

2、%。PopGene结果显示，在物种水平上，供试病原菌的基因多样性指数和Shannon信息指数分别为0.256 3和0.397 8。分子方差分析表明，不同地理种群间的遗传变异占总变异量的7.94%，不同地理种群内的各自然种群间的遗传变异占总变异量的24.46%，自然种群内各分离株的遗传变异占总变异量的67.58%。聚类分析结果表明，在遗传相似系数为0.19时，可将9个病原菌自然种群划分为6个不同的聚类群。【结论】我国枣树干腐病菌（B.dothidea）群体具有丰富的遗传多样性，群体内多样性大于群体间多样性。自然种群内各分离株的遗传变异是我国枣树干腐病菌遗传变异的主要来源。我国枣树干腐病菌的各自然

3、种群之间的遗传亲缘关系与其地理来源无明显相关性。关键词：枣树干腐病；ISSR-PCR扩增；正交设计；群体遗传中图分类号：S665.1文献标志码：A文章编号：1009-9980（2017）08-0977-11收稿日期：2017-03-06接受日期：2017-06-26基金项目：国家自然科学基金青年项目（No.31301609）；旱区作物逆境生物学国家重点实验室开放基金（CSBAA2015008）；河南现代农业产业技术体系（S2014-11-G03）作者简介：冯慧静，硕士，研究方向为植物病害综合治理。Tel：18703635116，E-mail：*通信作者Author for correspond

4、ence.Tel：13721446172，E-mail：Population genetic diversity analysis of Chinese jujube branch cankerpathogens(Botryosphaeria dothidea)in China using ISSR markersFENG Huijing1,WEN Caiyi1,YIN Xinming2,HONG Kunqi1,ZANG Rui1*(1College of Plant Protection,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,Henan

5、,China;2Xinyang Agriculture and Forestry University,Xinyang 464001,Henan,China)Abstract:【Objective】The Chinese jujube branch canker,caused by Ascomycete Botryosphaeria dothideawas a catastrophic branch disease in China and caused significant yield loses.An investigation of the disease incidence show

6、ed that the average disease incidence of Lizao grafted by Junzao,Huizao or Suanzaoreached 48.65%in Jiaocheng county of Shanxi province.Because of the lack of the researches on thepathogenic fungal population genetic characteristics,there was no commercial disease-resistant varietywhich could be used

7、 in the agricultural production practice.The jujube branch canker pathogen(B.dothidea)was found at the molecular level.【Methods】The DNA of different B.dothidea isolates obtainedfrom different Chinese producing areas in North China were extracted by using the Cetyltrimthylammonium bromide(CTAB)method

8、.The DNA quality and concentration were detected by NanoDrop 1000 ultraviolet and visible spectrophotometer and 1%agarose electrophoresis.The ISSR primers were screened byregular PCR using five B.dothidea isolates from Shandong and Henan provinces,the PCR annealing tem果树学报第34卷perature was set accord

9、ing to the primersTm temperature.The orthogonal designed experiments wereused to screen the optimal inter simple sequence repeat amplification protocol at three levels of four factors.The four factors included dNTP,primers,Mg2+and Taq enzyme,which could deeply affect the DNAfragment number of ISSR-P

10、CR amplification.The DNA of 161 B.dothidea isolates was used as the template in the ISSR-PCR amplification.If the particular size DNA fragment appeared,1 was used to standfor its appearance.If the fragment did not appear,0 was used to stand for the deficiency.The DNA fragments of ISSR-PCR amplificat

11、ion with all screened primers were transformed into a 1 or 0 matrix.Thepopulation genetic diversity and genetic variation were analyzed by using POPGENE Version 1.32.Thefrequency of the same DNA fingerprint was detected by using DCFA Version1.1 software.The analysis ofmolecular variance(AMOVA)progra

12、m in the Arlequin Version3.11 software was used to detect the population genetic variation source.The dendrogram relationship of different natural populations was analyzedby using the unweighted pair-group mean average(UPGMA)method in the SHAM module on the basis ofgenetic distance data.The dendrogr

13、am of different natural populations was generated by the tree-plotmodule in NYSTS Version2.10.【Results】The agarose electrophoresis results showed that the DNA bandis bright and integral,and there is no significant degradation in the DNA samples.The phenomenon indicated that the DNA quality is good e

14、nough to be used in the ISSR-PCR amplification reaction.Ten ISSRprimers which can amplify more polymorphic loci were screened from 40 ISSR primers.An optional PCRamplification protocol was established according to the results of the orthogonal designed experiments.Itwas described as 0.30 mmolL-1dNTP

15、,0.4 molL-1ISSR primer,2.00 mmolL-1Mg2+and 0.25 U Taqenzyme in the volume of the 25.0 L reaction.The protocol and primers were used to amplify the testedisolatesDNA.Totally,132 loci were detected of which 129 loci were polymorphic;the polymorphic locipercentage was 97.93%.The POPGENE analysis result

16、s showed that the Nei s gene diversity index(H)and Shannon s information index(I)were 0.256 3 and 0.397 8 at the species level.The Shannon s information index of the Henan geographical population was 0.386 4,it is the maximum value,which indicatedthat there was abundant genetic diversity in this geo

17、graphical population.There were significant differences among the geographical population on the parameters of the polymorphic loc percentage.The value ofNm(Number of migrants per generation)showed that the gene flow existed between any two geographicalpopulations.The Nm value between Henan and Shan

18、dong was 3.605 2,which showed that the gene flowbetween the two geographical populations was the strongest.The AMOVA results revealed that the geneticvariations among geographical groups and within geographical groups were respectively 7.96%and24.16%,and about 67.58%of the total variation located wi

19、thin populations.The dendrogram based onISSR markers showed that the nine natural populations can be clustered into six clusters at the thresholdof the genetic similar coefficient 0.19.The Xinzheng and Liulin natural populations located in cluster,similarly,Lingbao,Zhucheng and Yangling shared the s

20、ame cluster.This phenomenon showed that thenatural populations from different geographical populations can be clustered into the same cluster.【Conclusion】The ISSR-PCR was a very useful and strong tool to detect the pathogenic fungal population genetic diversity.The populations of Chinese jujube bran

21、ch canker pathogens(B.dothidea)in North Chinapossessed abundant genetic diversity.The intra-populational genetic diversity was much more abundantthan the inter-populational variation.The main genetic variation came from the isolates within the samenatural populations.There was no significant correla

22、tion between the genetic relationships and their geographical originals among the natural populations.These finding will pave the way for insight into thepathogenic epidemic rules and establishing an effective disease control strategy in the future.Key words:Chinese jujube branch canker;ISSR-PCRampl

23、ification;Orthogonaldesign;Populationgenetic978，等：群体遗传多样性的ISSR分析第8期大枣（Ziziphus jujuba Mill.）是我国最具代表性的特色水果之一1。近年来，随着人们对大枣营养价值和药用价值认识的深入，大枣的市场需求越来越大，大枣的种植面积也不断扩大。然而，由于单一高产枣树品种的大面积推广，枣树病害问题日益突出，已经成为制约大枣产业可持续发展的重要因素之一。其中，枣树枝干干腐病以分布广、危害重、防治难而备受关注2-3。据调查，2009 年山西省定植 56 a（年）的以骏枣、灰枣、酸枣等为砧木的梨枣，初始发病率即高达 48.65

24、%1。经过形态学观察和分子鉴定，将其病原鉴定为七叶树壳梭孢（Fusicoccum aesculi Corda），其有性态为茶藨子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea Ces.&de Not）1。目前，对于该病害主要采用化学药剂进行防治，筛选到了世高、凯润、多菌灵和爱因思等药剂3。然而，杀菌剂的大量使用不仅污染了环境，而且在一定程度上会增强病菌的抗药性，同时果实上农药残留的问题，对消费者的身体健康也会造成一定的影响。培育抗病品种是解决植物病害最为经济和有效的途径4。对病原菌的群体组成进行研究，不仅有利于枣树抗性育种工作的顺利开展，同时也可以为更深入地了解病害发生规律和制定高

25、效的病害防治策略奠定基础。ISSR（inter-simple sequence repeat）技术，即简单重复序列区间扩增技术，以稳定性好、DNA用量少、引物设计简单、操作简便、灵敏度高、重复性强的优点成为微生物群体研究中普遍使用的一种技术。由于SSR在真核生物中的普遍存在，并且具有进化变异速度快的特点，所以锚定引物的ISSR技术可以灵敏地检测到基因组中发生差异的位点5。而且，由于ISSR技术能提供较大数目的DNA片段，可以对基因组内的多态位点进行扫描，因而是一种用于分析物种、种群、不同品系、甚至个体间遗传差异的理想方法5-6。Zhou等7用ISSR方法成功区分了Botryosphaeria

26、sp.相关的无性型真菌。赵嘉平8采用ISSR方法，不仅成功鉴定出引起杨树溃疡的B.dothidea、B.rhodina、B.parva、B.obtusa和B.stevensii等多种病原菌，而且发现B.dothidea种内存在一定的遗传分化。目前，我国枣树干腐病的相关研究刚刚起步，对于病原菌的群体遗传规律还缺乏相应的研究，笔者拟采用ISSR分子标记的方法，对我国不同地区枣树干腐病病原菌（B.dothidea）群体的遗传多样性进行研究，以期揭示我国枣树干腐病菌群体遗传结构特点及其与地理来源之间的关系，为后期病害流行规律的研究和防治策略的制订，以及抗病育种工作的顺利开展奠定理论基础。1材料和方法1

27、.1供试菌株20142015年分别从河南、陕西、山西和山东省大枣的主产区采集具有典型干腐病症状的枣树病枝，采用组织块分离法，获得枣树干腐病菌的纯培养分离株。并从纯培养分离株菌落边缘截取菌饼（直径为5 mm），然后将其放入5%水琼脂（WA）平板中央，25 黑暗培养23 d，在显微镜下挑取单菌丝，放入马铃薯葡萄糖平板（PDA）中央，25 黑暗培养3 d，获得病原菌的单菌丝纯培养物。本研究共获得枣树干腐病菌单菌丝分离株161株（表1），现保存于河南农业大学植物保护学院生物防治研究室-80 超低温冰箱中。表1枣树干腐病菌的采集地点和数目Table 1 The samples collected loc

28、ation and isolates numberof Chinese jujube branch canker fungi used in this study省份Provinces河南 Henan陕西 Shaanxi山西 Shanxi山东 Shandong县（市）County新乡 Xinxiang新郑 Xinzheng灵宝 Lingbao杨凌 Yangling彬县 Binxian太谷 Taigu柳林 Liulin沂水 Yishui诸城 Zhucheng分离株数目Isolates number791791114156551.2供试的ISSR引物供试的ISSR引物参考Wang等9和Burges

29、s等10发表的ISSR引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成。具体的引物序列见表2。1.3病原菌营养体的培养和收集按照无菌操作法要求，用无菌接种针挑取保存于20%甘油中的枣树干腐病菌菌饼，放入PDA平板中央，25 黑暗培养3 d后，用直径为5 mm的打孔器在菌落边缘截取菌饼，将所获得的菌饼放入盛有50 mL PD培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL）的150 mL三角瓶中，每瓶中放入5块菌饼，25 黑暗条件下静置培养35 d，待菌丝体长满液面时，用无菌的纱布过滤收集菌丝体，多余的水分冯慧静，等：中国枣树干腐病菌（Botryosphaeria dothidea）群体

30、遗传多样性的ISSR分析979果树学报第34卷用无菌滤纸吸干。吸干水分的菌丝体用无菌的2mL离心管收集约250 mg，然后用Paraflim封口膜封住离心管管口，用接种针在封口膜上扎约10个小孔，最后将离心管插入离心管板，放入冷冻干燥机（-80，12 h）中进行冷冻干燥，干燥的菌丝可以用于病菌DNA的提取。1.4病菌DNA基因组的提取病原菌DNA采用CTAB（cetyltrimthylammoniumbromide）法11提取，DNA的完整性采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，DNA的浓度和纯度采用NanoDrop 1000微量紫外可见分光光度计进行检测。1.5ISSR-PCR扩增引物的筛选以

31、来自河南新郑（3株）和山东沂水（2株）的5株枣树干腐病菌分离株DNA为模板，根据各条引物的Tm值2 的方法初步确定其进行ISSR-PCR扩增的退火温度。扩增体系采用25.0 L的体系，其中包括 10 Taq buffer 2.50 L，25 mmolL-1MgCl22.0L，10 mmolL-1dNTP 0.25 L，10 molL-1ISSR引物1.0 L，Taq DNA聚合酶（5 UL-1）0.25 L，DNA模板为 1.0 L（=100 ng），用无菌的去离子水补足25.0 L。每个分离株2次重复。PCR的扩增程序为：94 预变性4 min，接着进行35个循环：94 变性1 min，根据

32、Tm值确定退火温度退火 1 min，72 延伸 3 min。72 终延伸 10min，于4 保存。ISSR-PCR扩增完成后，取扩增产物10 L，于120 V电压下，在2%的琼脂糖凝胶中电泳60 min，经EB染色液染色10 min，用蒸馏水漂洗2次，然后在凝胶照相系统中进行观察照相。以扩增结果稳定、多态性条带多的引物作为枣树干腐病菌群体遗传分析的引物。1.6ISSR-PCR扩增体系的优化利用L9（34）正交设计表，对影响ISSR-PCR扩增的主要因素（dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度和Taq酶量）在3个不同水平上进行正交组合形成不同的扩增体系，确定适合枣树干腐病菌进行ISSR-PCR的最

33、佳扩增体系（表3）。ISSR-PCR扩增体系采用25.0 L的扩增体系，除了前述 4 种影响因素外，还包括 10Taq buffer表 2供试 ISSR 引物序列及其退火温度Table 2 The sequences and annealing temperature of inter-simple sequence repeat（ISSR）primers used in this study引物名称Primers nameVCA01VCA02VCA03VCA04VCA05VCA06VCA07VCA08VCA09VCA10VCA11VCA12VCA13VCA14VCA15VCA16VCA17V

34、CA18VCA19VCA20引物序列Primerssequences(5-3)(CA)6AC(GT)6CC(CA)6GT(GA)6GG(AG)8TA(CT)8TG(TG)8GT(CT)8GC(AG)8TC(CT)8AC(GA)8T(AC)8T(AG)8S(AG)8YT(AG)8YC(AC)8YC(AC)8YT(TG)8RC(CT)8RT(AT)8STTm值Tm value/47.150.047.150.052.755.055.057.355.055.052.252.254.653.956.256.253.956.253.936.8退火温度Annealingtemperature/50.054.

35、050.054.054.054.054.054.052.054.052.052.052.054.055.053.054.054.052.040.0引物名称Primers nameVCA21VCA22VCA23VCA24VCA25VCA26VCA27VCA28VCA29VCA30VCA31VCA32VCA33U01U02U03U04U05U06U07引物序列Primerssequences(5-3)(GTC)6(GTG)6(AAT)6(CAA)6(CAC)4GC(GAG)4GC(CTC)4GC(GTA)6(AAG)6(GACA)4(GATA)8(GAGT)8(GGGT)4DDB(CCA)5DHB

36、(CGA)5YHY(GT)5GHVH(GTG)5NDB(CA)7CNDV(CT)8HBDB(GACA)4Tm值Tm value/61.961.934.548.255.955.955.948.248.251.556.967.261.860.360.348.159.956.256.157.8退火温度Annealingtemperature/59.059.040.050.053.053.053.050.050.051.054.059.058.057.057.050.058.054.054.057.0注：D=G或A，B=G或T，H=A或C，R=G或A，S=G 或C，Y=T或C。Note：D=G or

37、A，B=G or T，H=A or C，R=G or A，S=G or C，Y=T or C.980，等：群体遗传多样性的ISSR分析第8期2.50 L，DNA模板1.0 L（=100 ng）。对PCR影响较大的4个因素，按照表3中的量进行加样，最后用无菌的去离子水补齐扩增体系中不足的部分。试验中每种组合2次重复。ISSR-PCR扩增程序为：94 预变性4 min，接着进行35个循环：94 变性1 min，52 退火1 min，72 延伸3 min。72 终延伸10 min，于4 保存。PCR扩增产物的电泳、拍照方法同1.5。1.7ISSR-PCR扩增及其扩增条带的统计分析用1.6所建立的PC

38、R扩增体系，对分离自我国不同大枣产区的161株枣树干腐病菌分离株进行ISSR-PCR扩增。扩增结束后通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用凝胶照相系统进行拍照，采用人工读带法进行条带的统计。在谱带分析中，对于同一引物的扩增产物，每条清晰的条带都作为一个遗传位点进行统计。首先确定条带的大小，然后根据条带的有无，有记为1，无记为0，构建0、1二元矩阵，从而将图像信息转化为数据信息，并将其保存成Excel文件格式。然后利用POPGENE version 1.32软件计算病菌群体遗传多样性和遗传分化等指数12-14。通过 DCFA1.1 软件计算枣树干腐病菌不同群体的ISSR各种指纹类型出现的频率。并用

39、Arlequin3.11软件中的AMOVA（analysis of molecular variance）程序对病原菌群体遗传变异进行分析。最后再次通过POPGENE软件计算不同种群的遗传距离，并用NTsys-2.0 软 件 中 的 UPGMA（unweighted pair-groupmean average）方法对其进行聚类分析，通过Tree plot模块生成聚类图14-15。2结果与分析2.1总DNA提取由图1可以看出，通过CTAB法提取的枣树干腐病菌总量DNA主带清晰，无明显的RNA带，基本无M123456789102 000 bp5 00 bpM.DL2000 DNA标准分子质量；泳

40、道110.B.dothidea分离株。M.DL2000 DNA marker；Lane 1-10.B.dothidea isolates.图 1枣树干腐病菌总量 DNA 琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 The total DNA of some B.dothidea isolates on the agarose gel降解，完整性较好，可以满足 ISSR-PCR 扩增的需要。2.2ISSR-PCR扩增引物的筛选以不同地理来源的B.dothidea分离株DNA为模板，经过PCR扩增，共从40条ISSR引物中，筛选到10条PCR扩增条带亮、多态性条带多的引物。即VCA09、VCA13、VCA16、

41、VCA21、VCA22、VCA25、VCA26、VCA27、U01和U02（图2）。2.3ISSR-PCR扩增体系的优化正交实验的扩增结果（图3）显示，由4个因素在3个水平上的9种不同浓度组合形成的PCR扩增体系，其扩增产物是不同的。由图3可知，第1、2、3组合在dNTP浓度不变的情况下，随着引物浓度、Mg2+浓度以及Taq酶量的不断增加，PCR扩增产物的条带越来越少，越来越暗。但第2种组合，扩增条带虽然模糊，但是数目较多，可以满足ISSR分析的需要，表 3ISSR-PCR 正交试验设计表（L9（34）Table 3 ISSR-PCR of orthogonal designed tables

42、according to L9（34）序号No.123456789因素 Factorsc(dNTP)/(mmolL-1)0.20.20.20.30.30.30.40.40.4c(引物)Primers/(molL-1)0.20.30.40.20.30.40.20.30.4c(Mg2+)/(mmolL-1)234342423Taq酶量Taq enzyme/U0.1250.2500.5000.5000.1250.2500.2500.5000.125冯慧静，等：中国枣树干腐病菌（Botryosphaeria dothidea）群体遗传多样性的ISSR分析981果树学报第34卷是一种备选组合。第4、5、

43、7组合由于扩增出的条带少，且扩增条带清晰度较差，不能满足ISSR-PCR扩增的要求。第8、9组合扩增的条带虽然较亮，但其条带数目较少，不能满足 ISSR-PCR 统计的要求。第6种组合，扩增的条带较亮，条带数目较多，可以满足ISSR-PCR扩增的需要，是备选组合。第2和第6组合相比，组合6扩增出的条带不但清晰，而且多态性和重复性好，是理想的组合。因此，确定组合6为枣树干腐病菌ISSR-PCR扩增的最佳组合，即25L 的 PCR 反应体系中含 0.30 mmolL-1dNTP、0.4molL-1ISSR引物、2.00 mmolL-1Mg2+和0.25 U的Taq酶。2.4中国不同地区枣树干腐病菌

44、群体遗传多样性分析利用正交实验筛选到的ISSR-PCR扩增体系和10条多态性较好的引物，对供试的161株病原菌单菌丝分离株进行了PCR扩增。经PCR扩增，共从基因组的132个位点扩增出条带，其中多态性的位点129 个，多态性位点百分率为 97.73%。从引物VCA13和VCA21对部分病菌的ISSR-PCR扩增结果中可以看出，VCA13 的第 2、7、8、9、10、11、12、13、19、20、23 和 24 泳道，VCA21 的第 1、2、3、4、9、10、11、15、17、20泳道的PCR扩增条带带型和其他泳道明显不同。此种现象表明，我国的枣树干腐病菌存在丰富的遗传多样性（图4，图5）。通

45、过Popgene软件对我国河南、陕西等4个省份M12345678910CK5 000 bp1 000 bp500 bpM.DL2000 DNA标准分子质量；CK.阴性对照；泳道110.B.dothidea分离株HNXZav12、HNXZz42、HNXZa14、SDYSc017、SDYSc027，每个分离株2次重复。M.DL2000 DNA marker；CK.Negative control with no DNA template；Lane 1-10.B.dothidea isolates HNXZav12,HNXZz42,HNXZa14,SDYSc017，SDYSc027,two repe

46、ats of every isolates.图 2引物 U02 的 ISSR-PCR 扩增分析Fig.2 The ISSR-PCR amplified profile using U02 primerM112233445566778899CK5 000 bp1 000 bp500 bpM.DL2000 DNA标准分子质量；泳道19.正交设计9种不同的处理；CK.阴性对照。M.DL2000 DNA marker；Lane 1-9.Nine different treatments in the orthogonal design experiment;CK.Negative control.图

47、3正交实验设计的 ISSR-PCR 反应体系扩增分析Fig.3 The ISSR-PCR amplification profile based on the orthogonal design experiment982，等：群体遗传多样性的ISSR分析第8期枣树干腐病病原菌群体遗传多样性分析的结果（表4）显示，我国4个省份枣树干腐病病原菌群体有效等位基因数（Ne）差异较小，但不同地理种群的基因多样性指数（H）、多态性位点数（NP）和多态性位点百分率存在较大差异。河南群体的基因多样性指数最高，而山东群体的基因多样性指数最低。在物种M12345678910111213 141516 17 18

48、19 20212223 243 000 bp1 000 bp500 bpM12345678910 111213 141516 171819 20212223 243 000 bp1 000 bp500 bpM.100 bp DNA marker；泳道124.来自不同省份的B.dothidea分离株。M.100 bp DNA marker;Lane 1 to 24:B.dothidea isolates from different provinces.图 4引物 VCA13 对我国不同地区枣树干腐病菌分离株的 ISSR-PCR 扩增分析Fig.4 The ISSR-PCR amplificat

49、ion of 24 B.dothidea isolates using the primer VCA13M.100 bp DNA marker；泳道124.来自不同省份的B.dothidea分离株。M.100 bp DNA marker;Lane 1 to 24:B.dothidea isolates from different provinces.图 5引物 VCA21 对我国不同地区枣树干腐病菌分离株的 ISSR-PCR 扩增分析Fig.5 The ISSR-PCR amplification of 24 B.dothidea isolates using the primer VCA2

50、1表 4中国 4 省份枣树干腐病菌的群体遗传多样性分析Table 4 The population genetic diversity of B.dothidea isolates from four Chinese jujube producing provinces地理群体GeographicalPopulation河南 Henan陕西Shaanxi山西Shanxi山东Shandong群体平均水平Population average level物种水平Species level菌株数IsolatesNo.10525211040161等位基因观测数Observednumber ofallel