【课件】实验：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳课件高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步目的基因的检测与鉴定前提 核心 关键 保证利用PCR获取和扩增目的基因、启动子、终止子、标记基因农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、感受态细胞转化法(微生物);分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。温故知新：基因工程的基本程序实验原理材料用具实验步骤DNA体外扩增的原理DNA片段电泳鉴定原理实验探究：DNA片段的扩增及电泳鉴定一、实验原理（一）DNA体外扩增的原理：PCR仪PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR

2、仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。一、实验原理（二）DNA片段电泳鉴定原理：电泳鉴定原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。琼脂糖凝胶电泳DNA 分子电泳二、材料用具（一）仪器：PCR仪微量离心管 电泳

3、装置 微量移液器自动控温，实现DNA的扩增实际上是进行PCR 反应的场所用于向微量离心管转移PCR配方中的液体包括电泳仪、电泳槽等二、材料用具（二）试剂：（1）无菌水、琼脂糖；（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂溴酚蓝）；（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。（5）PCR反应体系的配方材料 用量10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5L20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1L20mol/L的引物 2.5L20mol/L的引物 2.5LH2O 2833L1-5U/L的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）12U模板DNA（用

4、量为1pg-1g）510L移液离心扩增用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序 变性 复性 延伸预变性94,5min30 次 94,30s55,30s 72,1min最后一次94,1min55,30s 72,1min/可根据目的片段长度适当调整延伸时间预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。三、PCR方法步骤四、电泳方法

5、步骤配制琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀制备凝胶将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜加样将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。

6、待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究.实验注意事项为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。在进行操作时，一定要戴好一次性手套。PCR扩增不能随意加大试剂用量。结果分析与评价1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如

7、果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。DNA片段的扩增及电泳鉴定例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示

8、。据此做出分析不合理的是()A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰B 实战训练1.下列有关电泳的叙述，不正确的是（）A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定C 实战训练2多重PCR-电泳技术，是指同一个PCR反应体系中包含多对引物，各引物特异性地结合到相应的目的基因

9、上，扩增产生不同长度的片段，再通过电泳进行分离和识别，从而对病原体进行鉴别检测。下列相关叙述错误的是（）A多重PCR过程中，不同的引物之间不能互补BPCR和电泳都必须无菌条件下操作，防止外源DNA污染C该技术可同时进行多种病原微生物的检测D不同大小的DNA分子在电泳时，迁移的速率不同B 实战训练3带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。下列关于电泳的叙述，正确的是（）A电泳中带电粒子迁移速率只与所带电荷有关B电泳的过程要在一定的pH下进行，所以要使用缓冲液CDNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成连续的条带D切断电源后即可用肉眼观察到DNA条带在凝胶上的位置B 实战训练4下

10、列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，正确的是（）A利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可将DNA进一步纯化分离B在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的DNACPCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压蒸气灭菌处理DPCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，电泳时电泳缓冲液不能没过凝胶A 实战训练5.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增,下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是()A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所

11、用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换C1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（）2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链

12、DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸练习与应用（P83）一.概念检测D2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crt表示）参与-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crt基因转入水稻，使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。练习与应用（P83）二、拓展应用（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctr和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSY

13、N12424。该项研究的目的基因是_，标记基因是_，质粒pSYN12424的作用是_。ctr基因和psy基因pmi基因将目的基因送入水稻细胞（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？不能。限制酶可能将它切断。实战训练1.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原抗体特异性反应进行检测D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性A 实战训练2.科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性

14、基因)的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是（）A.过程合成人生长激素基因的过程 需要用到逆转录酶B.过程是将重组质粒溶于缓冲液后 与经Ca2处理的细菌B混合C.成功导入了重组质粒的细菌B在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长D.可采用抗原抗体杂交技术检测工程菌中生长激素基因是否成功表达C 实战训练3.目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是()A目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNAB可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译C可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的

15、基因是否翻译成相应蛋白质D抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测C 实战训练4.下图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图（其中ampr为抗氨苄青霉素基因）。下列叙述错误的是（）A过程中可利用目的基因作为探针对植株进行筛选B可同时选用限制酶PstI、SmaI对含目的基因的DNA进行剪切C过程可采用农杆菌转化法将含目的基因的表达载体导入受体细胞D质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达D 实战训练5.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是A.不必构建表达载体就可以直接导入B.此

16、方法可用于转基因动物C.受体细胞只能是植物的卵细胞D.有时可以取代农杆菌转化法D 实战训练A.图中是质粒，步骤需要用到限制酶和DNA连接酶B.图中是含目的基因的重组质粒，步骤是将重组质粒导入棉花细胞C.图中 是农杆菌，通过步骤将目的基因导入植物细胞D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达6.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是B 实战训练7.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（）将毒素蛋白注射到棉受精卵中；将编码毒素蛋白

17、的DNA序列注射到棉受精卵中；将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。A.B.C.D.B 实战训练8.科研人员以抗四环素基因为标记基因,通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的-珠蛋白,治疗鼠的镰状细胞贫血。下列相关实验设计中,不合理的是()A.构建的表达载体除了目的基因外,还需要启动子、终止子、复制原点、标记基因B.用含有四环素的培养基可以筛选出已经导入目的基因的大肠杆菌C.小鼠的-珠蛋白基因可以直接转给大肠杆菌进行表达得到-珠蛋白D.用Ca2+处理大肠杆菌后,表达载体易于导入大肠杆菌中C