黄曲霉毒素检测.ppt

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1、黄曲霉素检测黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止发现的毒性最大的真菌毒素。它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素十分耐热，加热至230才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易消除。黄曲霉毒素介绍黄曲霉毒素分布范围广黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果（特别是花生和核桃中）中。日常检验发现在大豆、谷物、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素（其中以花生和玉米污染最严重）。毒

2、性极强黄曲霉毒素进入人体后主要经消化道吸收，大部分分布在肝脏、肾脏。因此主要引发肝癌、胃癌等，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。黄曲霉毒素如不连续摄入，一般不在体内积蓄。一次摄入后约1周将大部分排出。只有严重霉变的粮食才可能会含有大量毒素，导致急性毒性。耐热性强在一般的烹调加工温度下，黄曲霉毒素被破坏的很少；即使是200高温加热，也不能完全正确破坏。一般黄曲霉毒素的裂解温度为280，黄曲霉毒素B1的裂解温度为268。黄曲霉毒素的种类迄今为止发现的黄曲霉毒素主要有4种：即B1、B2、C1、G2，其中B1被认为是主要的有毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2。其中黄曲霉毒素B1主

3、要存在于农产品，动物饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B1的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品，所以其危害性更大。中国食品中黄曲霉毒素的限量标准免疫分析法仪器分析法化学分析法生物鉴定法检测方法检测方法黄曲霉毒素的检测方法目前，测定食品中的黄曲霉毒素的方法有：薄层层析法薄层层析法、液相色谱法液相色谱法、放射免疫分析法、酶联免疫法酶联免疫法、亲和层析法亲和层析法、微柱筛选法微柱筛选法、金标

4、试纸法金标试纸法等。这些方法或多或少都具有如下不足之处：v（1）、在操作过程中，需要使用剧毒的黄曲霉毒素M1作为标定标准物，对操作人员造成巨大的沾v污危险，而且黄曲霉毒素M1标准物质购买十分困难。v（2）、操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。v（3）、仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。v（4）、灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。薄层色谱法（TLC）v其原理是:样品经提取、浓缩、薄层分离后,在365nm波长的紫外光照射下,黄曲霉毒素B1、B2产生紫色荧光,G1、G2产生绿色荧光,然后根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。v优点是:所用的试剂、设备简单,费用低廉,容

5、易掌握,适用大量样品的分离、筛选,一般的实验室均可开展,属于定性和半定量的功能。高效液相色谱法(HPLC)以C18柱为固定相,以水+异丙醇+乙腈(80+12+8)为流动相,用荧光检测器进行检测,其激发波长365nm,发射波长450nm,以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较大。样品用甲醇和水混合液进行萃取,随后进行衍生化处理,处理后溶解于流动相,进行液相色谱测定。酶联免疫吸附法(ELISA)v是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素，一

6、种是用双抗体夹心法，另一种是用竞争法。微柱法测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒素。金标试纸法金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法,可一步式检测AFT。一步式AFT快速检测纸法可在510min完成对样品中AFB1的定性测定,具有简单、快速、灵敏度高等特点,无须仪器设备配合测定,检测既可在实验室中进行,也可在农场、饲料混合车间等进行实地测定,对黄曲霉毒素定性检测准确度在85%以上,灵敏度为4ng/mL,可测出样品中20ng/g的黄曲霉毒素10。SunXiulan等合

7、成一种对AFB1具有特异性的抗体金标探针,该纳米金标探针用于免疫色谱法对AFB1分析,完成一个样品分析所需要的时间少于10min,比ELISA少610min,在标准品的对照下,最低检测限可达2.5ng/mL生物鉴定法利用AFT能影响微生物、水生动物及家禽等生物体的细胞代谢,来鉴定AFT的存在,其特点是待检样品不需很纯,主要用于定性鉴定,包括:抑菌试验;对微生物遗传因子影响试验;细菌发光试验;荧光反应;组织培养检测法;鸡胚试验;鸭胚试验;鳟鱼试验;植物试验;饲喂实验动物试验。这些方法专一性差,灵敏度低,一般只作为化学分析法的佐证。衍生方法可分为柱前衍生法和柱后衍生法。对黄曲霉毒素衍生的目的主要是

8、为了增加测定时的荧光强度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀盐酸法，柱后衍生法主要有溴法和碘法。柱后衍生需增加泵、校后反应器和控温箱等装量。在实践中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分别用氮气或直接吹气挥干。v最新国标方法“免疫亲和柱法”较好的解决了上面的不足，该种方法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可以和高效液相色谱法结合，解决标准物污染和操作过程繁复等问题。同时该种方法有着较好的权威性和通用性，且为国外多个组织认可，被列为标准方法，如：v美国公职分析化学家协会（AOAC）v美国农业部联邦谷物检测中心（FGIS）国际纯粹与应用化学协会（IUPAC）v美国食品

9、药品行政署（US-FDA）v美国农业部（USDA）v同时在国内被认证的机构：中国出入境检验检疫局（CIQ）、中华人民共和国国家标准（GB）为了开发一种简单、快速、灵敏、准确的分析方法,美国VICAM(维康)公司与哈佛大学、麻省理工学院、约翰霍普金斯大学、AOAC、FDA、FGIS、美国农业部等著名大学和政府机构通力合作，发明研制了一系列以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为检测工具的分析方法。该项技术有一下特点：v1、认证机构广泛，通用性强v2、分析速度快，一个样品只需1015分钟，其他传统的方法要做到定量分析需要几小时至几天的时间。3、灵敏度高，测定范围广泛（0300ppb）,用

10、荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素M1，用HPLC可以检测出10ppt的黄曲霉毒素M1。v4、采用单克隆免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。v5、仪器轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果，对实验操作人员要求不高，可以在小型实验场所使用。v6、不需要剧毒的黄曲霉毒素和其他真菌毒素标准物来标定，所以在整个实验过程中，绝对安全可靠。免疫亲和柱法(IAC-AFLATEST)黄曲霉毒素危害的预防v1、防霉：最好的预防方法是防止粮食等食物的霉变。黄曲霉菌产毒要求的温度为1242，最适温度为25.732。v2、去毒：黄曲霉毒素耐热，B1的分解温度为268左右黄曲霉毒素多存在食物的表面，最简单的方法就是直接丢弃明显生霉、破损的粮食，不要食用。