奶粉菌落总数测定教学教材.ppt

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1、奶粉菌落总数测定Contents实验目的实验目的实验器材实验器材培养基、试剂和样品培养基、试剂和样品实验进度表实验进度表123ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.45 实验步骤培养基、试剂和样品培养基、试剂和样品磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液A.2.1成分成分磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g蒸馏水蒸馏水500mLpH7.2A.2.2制法制法贮存液：称取贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水蒸馏水中，用大约中，用大约175mL的的1mol/L氢

2、氧化钠溶液调节氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，分装于适宜容器中，121高压灭菌高压灭菌15min 培养基、试剂和样品培养基、试剂和样品无菌生理盐水无菌生理盐水A.3.1成分成分氯化钠氯化钠8.5g蒸馏水蒸馏水1000mLA.3.2制法制法称取称取8.5氯化钠溶于氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，蒸馏水中，121高高压灭菌压灭菌15min。试验进度表试验进度表 实验步骤实验步骤1.样品的稀释样品的稀释固体和半固体样品：称取固体和半固

3、体样品：称取25g样品置盛有样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000r/min均质均质1min2min，或放入盛有，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打打1min2min，制成，制成1:10的样品匀液。的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制

4、成分混匀，制成1:10的样品匀液。的样品匀液。用用1mL无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液样品匀液1mL，沿管壁缓慢，沿管壁缓慢注于盛有注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成成1:100的样品匀液。的样品匀液。按上面程序，制备按上面程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次次1mL无菌吸管无菌吸管或吸头。或吸头。实验步骤

5、实验步骤2.平板接种与培养平板接种与培养根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择2个个3个适宜稀释度个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀倍递增稀释时，吸取释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。菌平皿内作空白对照。(适宜稀释度为适宜稀释度为10-2,10-3)及时将及时将15mL20mL冷却至冷却至46的平板计数琼脂培养基的平板计数琼脂培养基（可放置于

6、（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养培养48h2h。水。水产品产品301培养培养72h3h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），），凝固后翻转平板，按凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。条件进行培养。实验步骤实验步骤3菌落计数菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀

7、释可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。）表示。选取菌落数在选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落的平板记录具体菌落数，大于数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应其中一个平板有

8、较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。单链作为一个菌落计数。实验步骤实验步骤4.落总数的计算方法落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计若只有一个稀释度平板上的菌落

9、数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（按公式（1）计算：）计算：（1）式中：式中：N样品中菌落数；样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；第二稀释度（高稀释倍数）平板

10、个数；d稀释因子（第一稀释度）。稀释因子（第一稀释度）。实验步骤实验步骤若所有稀释度的平板上菌落数均大于若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落

11、生长，则以小于则以小于1乘以最低稀释倍数计算。乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板若所有稀释度的平板菌落数均不在菌落数均不在30CFU300CFU之间，其中一部分小于之间，其中一部分小于30CFU或大于或大于300CFU时，则以最接近时，则以最接近30CFU或或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算的平均菌落数乘以稀释倍数计算 实验步骤实验步骤5.菌落总数的报告菌落总数的报告菌落数小于菌落数小于100CFU时，按时，按“四舍五入四舍五入”原则修约，以整原则修约，以整数报告。数报告。菌落数大于或等于菌落数大于或等于100CFU时，第时，第3位数字采用位数字采用“四舍五四舍五入入”原则修约后

12、，取前原则修约后，取前2位数字，后面用位数字，后面用0代替位数；也代替位数；也可用可用10的指数形式来表示，按的指数形式来表示，按“四舍五入四舍五入”原则修约后，原则修约后，采用两位有效数字。采用两位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以为单位报告，体积取样以CFU/mL为单为单位报告。位报告。实验结果实验结果 皿次皿次原液原液10-110-210-3空白空白12平均平均计数稀释计数稀释度度菌量菌量【CFU/g(ml)】L/O/G/OL/O/G/OThankYou!结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！17