基因表达和基因重组.pptx

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1、 基因重组和基因工程基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第 十十 四四 章章基因重组基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段重组重组DNA技术发展史技术发展史pSC101EcoRIBoyer 和和Cohen的实验的实验Boyer 和和Cohen的实验的实验pRpR6-56-5大肠杆菌大肠杆菌pSC101pRpR6-56-5抗四环素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉抗卡那霉素基因素基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子分子培养平皿四环素

2、平板四环素平板卡那霉素基因卡那霉素基因四环素四环素 卡那霉素基因卡那霉素基因大肠杆菌大肠杆菌人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg-5050万只羊脑万只羊脑基因工程9 9升大肠杆菌升大肠杆菌 培养液 SSSS基因基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表SS第第 一一 节节DNA的重组的重组 DNA RecombinationDNADNA重组重组接合作用接合作用(conjugation)(conjugation)转化作用转化作用(transformation)(transformation)转导作用转导作用(transduction)(transducti

3、on)转转 座座(transposition)(transposition)同源重组同源重组(homologous recombination)(homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)(site-specific recombination)发发 生生 在在 同同 源源 序序 列列 间间 的的 重重 组组 称称 为为 同同 源源 重重 组组(homologous(homologous recombination)recombination)，又又称称基基本本重重组组。是是最最基基本本的的DNADN

4、A重重组组方方式式，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNADNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。一、同源重组一、同源重组二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNADNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌）的的DNADNA转转移移称称为为接接合合作作用用(conjugation)(conjugation)。可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)质粒质

5、粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子（二）转化作用（二）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNADNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称称为为转转化作用化作用(transformation)(transformation)。例：溶菌时，裂解的例：溶菌时，裂解的DNADNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。（三）转导作用（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞

6、与与受受体体细细胞胞 之之 间间 的的 DNADNA转转 移移 及及 基基 因因 重重 组组 即即 为为 转转 导导 作作 用用(transduction)(transduction)。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)例例第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique n相关概念相关概念nDNA克隆克隆n工具酶工具酶n目的基因目的基因n基因载体基因载体n基本原理基本原理 n重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要内容本

7、节主要内容一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或

8、或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分 子子，也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA(recombinant DNA)。生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获

9、得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切

10、割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DN

11、A 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周周围围切切割双链割

12、双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H作用作用与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haem

13、ophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口同功异源酶同功异源酶来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGG

14、ATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A同尾酶同尾酶（三）目的基因（三）目的基因目的基因目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构

15、和功能的关系研究某基因与疾病的关系 按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。某功能蛋白某功能蛋白宿主细胞宿主细胞重组体重组体目的基因目的基因目的基因目的基因 cDNA：经反转录合成的、与经反转录合成的、与mRNA互补的互补的DNA链。链。基因组基因组DNA：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。序列。（四）（四）基因载体基因载体定义：定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。克隆载体克隆载体(cloning vector)-为使插入的外

16、源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体表达载体(expression vector)-为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。常用载体常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 宿主细胞宿主细胞基因载体基因载体基因载体基因载体载体的选择标准载体的选择标准n n能自主复制；n n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；n n有克隆位点（外源DNA插入点）即多个单一酶切位点；n n分子量小，以容纳较大的外源DNA。存在于细菌染色体外的存在于细菌染色体外的小型小型环状环状DNA分子。分子。具有具有自我复制自我复制功能。功能。带有抗性基因及表型识别等带有抗性基因

17、及表型识别等遗传性标记物遗传性标记物。经改造后具有经改造后具有多克隆位点多克隆位点。举例：举例：pBR322质粒质粒质粒质粒宿主细胞宿主细胞 ori ori抗抗AmpAmp宿主细菌宿主细菌含含Amp培养基培养基多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点+多种酶切口多种酶切口多克隆位点多克隆位点限制性内切酶限制性内切酶单一酶切口单一酶切口多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记AmpAmppolylinker基因载体基因载体噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基

18、因组克隆）噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列 粘性质粒粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体

19、菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)（见第（

20、见第22章）章）*化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合*从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因 cDNA文库文库 以以 mRNA 为模板，利用反转录酶合成与为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的互补的DNA，再复

21、制成双链，再复制成双链 cDNA，与适当载体，与适当载体连接后转入受体菌，即获得连接后转入受体菌，即获得cDNA文库。文库。DNAmRNAmRNA反转录酶反转录酶cDNAmRNA的提取与纯化从mRNA制备cDNA逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNA杂化双链杂化双链cDNA文库法cDNA基因重组转化转化核酸探针核酸探针cDNA文库 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）目的基因目的基因目的基因目的基因基因载体基因载体基因载体基因载体重组体重组体（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(

22、1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶

23、切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上

24、同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体4.4.人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘

25、性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式导入方式转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker res

26、cue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择 互补互补 互互补补的的检检测测原原位位杂杂交交Southern印迹印迹鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤

27、技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达1.原核表达体系原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）表达体系

28、最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操

29、作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）生（二）生物制药物制药

30、 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克

31、隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失或插入等突变。失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片

32、断标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)1.产前诊断产前诊断2.携带者测试携带者测试3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防欲以基因工程方法高效表达人胰岛素，请设欲以基因工程方法高效表达人胰岛素，请设计实验方案。计实验方案。