亲和纯化.ppt

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1、亲和纯化亲和纯化亲和纯化亲和纯化高等生物分离工程高等生物分离工程一、亲和层析一、亲和层析 (一一)亲和层析的原理亲和层析的原理 (二二)亲和层析的特点亲和层析的特点 (三三)亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念 (四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作 (五五)亲和层析的应用与实例亲和层析的应用与实例二、金属鳌合层析二、金属鳌合层析三、亲和膜三、亲和膜本章主要内容本章主要内容n酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等）酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等）n抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体）凝集

2、素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体）n核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）n细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。亲和层析亲和层析AffinityChromatography许多物质都具有和某化合物发生特异性许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性可逆结合的特性 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物 质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接质可逆性特异结合的化合物（称配

3、体或配基）连接质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接 到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大 分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其分

4、子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其 他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生 物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离 提纯的目的。提纯的目的。提纯的目的。提纯的目的。（一）亲和层析的原理（一）亲和层析的原理配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联

5、体交联体杂质杂质游离配体游离配体杂质杂质n亲和的一对分子中的一方以共价亲和的一对分子中的一方以共价 键形式与不溶性载体相连，作为键形式与不溶性载体相连，作为固定相吸附剂固定相吸附剂n当含有混合组份的样品当含有混合组份的样品(流动相流动相)通过此固定相时，只有和固定相通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出和力的无关组份就随流动相流出 n然后改变流动组成份，将结合的然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和物洗脱下来(一一)亲和层析的原理亲和层析的原理亲和结合包括以

6、下几个方面的相互作用亲和结合包括以下几个方面的相互作用:n静静电电作作用用 亲亲和和作作用用分分子子对对的的结结合合部部位位上上带带有有相相反反电电荷荷时时,产产生生静静电电引力引力。n氢氢键键 如如果果亲亲和和作作用用分分子子对对的的一一方方分分子子中中含含有有氧氧原原子子或或氮氮原原子子,结结合合部位之间可以产生氢键作用部位之间可以产生氢键作用。n疏疏水水性性相相互互作作用用 如如果果亲亲和和作作用用分分子子对对的的一一方方分分子子上上含含有有芳芳香香环环或或烃烃基基链链等等疏疏水水基基,另另一一方方的的结结合合部部位位上上也也含含有有疏疏水水区区,则则两两者者之之间间可可发发生疏水性相互

7、作用生疏水性相互作用。n配配位位键键 如如果果亲亲和和作作用用分分子子对对均均与与同同一一金金属属原原子子配配位位,则则两两者者之之间间可可以通过金属配位键间接结合以通过金属配位键间接结合。n弱共价键弱共价键 结合力较弱的可逆共价键结合力较弱的可逆共价键。(一一)亲和层析的原理亲和层析的原理(二二)亲和层析的特点亲和层析的特点纯化过程简单、迅速，且分离效率高纯化过程简单、迅速，且分离效率高3 1纯化倍数大，产物纯度高纯化倍数大，产物纯度高3 3必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件条件3 4特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差

8、的生物大分子特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3 2亲和层析载体的选择亲和层析载体的选择n具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过n具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速n具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有惰性，尽量减少非专一性吸附n具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和偶联偶联n在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性(三三)亲和层析的基本

9、概念亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体纤维素纤维素纤维素葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃珠多孔玻璃珠多孔玻璃珠1 1）纤维素：）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。

10、目前主要用于间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质。分离与核酸有关的物质。2 2）琼脂糖凝胶：）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。功能基团，结构疏松孔径大，流速快。常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择3 3）葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶：与与琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶相相比比孔孔径径太太小小，特特别别是是经经配配基基偶偶联联后后，凝凝胶胶膨膨胀胀度度会

11、会进进一一步步变变小小，所所以以应应用用受受到到限限制。制。4 4）聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶：碳碳碳碳骨骨架架，由由丙丙烯烯酰酰胺胺和和甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺聚聚合合而而成成，具具有有网网状状三三维维空空间间结结构构。注注意意避避免免接接触触强强氧氧化化剂剂，配配基基偶偶联联后后会会使使它它的的网网格格缩缩小小，在在一一定定程程度度上限制了它的应用。上限制了它的应用。常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择 5 5）多孔玻璃珠：）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不但化学和物理稳定性好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能

12、耐受高温灭菌和较剧烈的能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白反应条件。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。改良方法：用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性并增加化改良方法：用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性并增加化学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在胞，在DNADNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNADNA和和RNARNA

13、聚合酶。聚合酶。常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择n纯化对象和配体之间必须有较强的亲和力纯化对象和配体之间必须有较强的亲和力n但亲和力太高也是有害的，因为在解离配体复合物时所需但亲和力太高也是有害的，因为在解离配体复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性n配体必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配体与生配体必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配体与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配体与生物分子之间的亲和力响配体与生物分子之

14、间的亲和力亲和层析配体的性质与选择亲和层析配体的性质与选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的性质与选择亲和层析配体的性质与选择配体的偶连配体的偶连配体的偶连配体的偶连酸酐法酸酐法酸酐法酸酐法酸酐法酸酐法N-N-N-取代羟基琥珀酰亚胺法取代羟基琥珀酰亚胺法取代羟基琥珀酰亚胺法叠氮化作用叠氮化作用叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成还原性烷基化合物（西夫碱）的形成还原性烷基化合物（西夫碱）的形成1,非特异性洗脱非特异性洗脱n通常采用改变通常采用改变pHpH、离子强度、离子种类或者温度等使与固离子强度、离子种类或者温度等使与固定配体结合的生物

15、大分子的构象发生变化，降低其亲和力，定配体结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。n非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配体形成复象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配体形成复合物，使固定化的配体对相应的生物大分子的亲和力降低合物，使固定化的配体对相应的生物大分子的亲和力降低。(四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作 洗脱类型洗脱类型(一一)2,特异性洗脱特异性洗脱n使用特异的配体作为洗脱剂使用特异的配体作

16、为洗脱剂n使用含有与亲和配体或目标产物具有亲和作用的小分子化使用含有与亲和配体或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配体或目标产物的竞争性合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配体或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物结合来洗脱目标产物(四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作3,特殊性洗脱特殊性洗脱n亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配体亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配体与载体的连接键，获得的配体与载体的连接键，获得的配体-蛋白络合物后，再除去配体。蛋白络合物后，再除去配体。实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法。实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性

17、洗脱方法。(四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作 洗脱方式洗脱方式(二)1,一步洗脱一步洗脱u 属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂 的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下 来，就可得到较纯的分离物。来，就可得到较纯的分离物。u 非选择性洗脱主要受洗脱液的非选择性洗脱主要受洗脱液的pHpH、离子强度、温度、离子强度、温度 和介电常数等因素的影响，有效的洗脱液既能改变和介电常数等因素的影响，有效的洗脱液既能改变 被吸附蛋白质的构象以降低蛋白质与配基之间的亲被吸附蛋白质的构象以降低蛋白质与配基之

18、间的亲 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。2,分步洗脱：分步洗脱：u属属于于选选择择性性洗洗脱脱方方法法，应应用用于于基基团团特特异异性性吸吸附附剂剂，亲亲和和吸吸附附 剂剂上上吸吸附附有有特特异异性性不不尽尽相相同同的的多多组组分分样样品品，用用几几种种不不同同的的洗洗脱条件分几步洗脱，可以将亲和力大小不同的组分分开。脱条件分几步洗脱，可以将亲和力大小不同的组分分开。3,梯度洗脱：梯度洗脱：u属属于于选选择择性性洗洗脱脱方方法法，利利用用洗洗脱脱液液的的浓浓度度梯梯度度变变化化，即即解解吸吸附附能能力力逐逐渐渐增增强强，对对吸吸附附性性质质相

19、相同同、特特异异性性程程度度不不同同的的酶酶和和同同工工酶酶有有效效地地洗洗脱脱。梯梯度度洗洗脱脱比比分分步步洗洗脱脱更更有有可可能能得得到到较较纯纯的的分分离离对对象象。此此方方法法需需要要有有梯梯度度混混合合仪仪来来实实现现洗洗脱脱液液的的梯梯度度变化。变化。(四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作(四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作1温度温度温度温度2抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质3离子强度离子强度离子强度离子强度pHpH4影响亲和层析的主要因素影响亲和层析的主要因素(三)5鳌合剂鳌合剂1离子强度离子强度离子强度离子强度n 如如果果亲

20、亲和和作作用用主主要要源源于于静静电电引引力力,则则提提高高离离子子强强度度 无疑会减弱甚至完全破坏亲和作用无疑会减弱甚至完全破坏亲和作用。n 氢氢键键的的形形成成同同样样基基于于静静电电引引力力,因因此此提提高高离离子子强强度度也会降低或消除氢键作用也会降低或消除氢键作用。n 疏水性相互作用随离子强度提高而增大疏水性相互作用随离子强度提高而增大。n 许许多多亲亲和和吸吸附附的的目目标标蛋蛋白白可可用用高高浓浓度度盐盐溶溶液液洗洗脱脱,说明静电引力在亲和作用中占有重要地位说明静电引力在亲和作用中占有重要地位。由于温度升高使得分子和原子的热运动加剧由于温度升高使得分子和原子的热运动加剧,结合部位

21、的静电作用结合部位的静电作用、氢键以及金属配位键减弱、氢键以及金属配位键减弱,但可使疏水性相互作用增强但可使疏水性相互作用增强。温度温度温度温度2抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质3脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成。但是。但是,脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂,高浓度下容易高浓度下容易引起蛋白质的变性失活。引起蛋白质的变性失活。pHpH4n 蛋蛋白白质质多多为为两两性性电电解解质质,含含有有许许多多解解离离基基团团,不不同同解解离基团的解离常数不同离基团的解离常数不同。n 如如果果静静电电引引力力

22、对对亲亲和和作作用用的的贡贡献献较较大大,则则pH将将严严重重影影响响亲亲和和作作用用,即即在在适适当当的的pH下下亲亲和和作作用用效效果果较较强强,而而在其他在其他pH下亲和结合作用减弱或完全消失。下亲和结合作用减弱或完全消失。n 在亲和分离操作中在亲和分离操作中,溶液溶液pHpH值的选择是非常重要的。值的选择是非常重要的。5鳌合剂鳌合剂鳌合剂鳌合剂 如如果果亲亲和和作作用用源源于于分分子子与与金金属属离离子子形形成成的的配配位位键键,则则加加入入乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸(EDTA)(EDTA)等等鳌鳌合合剂剂可可去去除除金金属属离离子子,使得亲和作用消失使得亲和作用消失。1,抗原和抗体抗原

23、和抗体利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为的方法又称为免疫亲和层析免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。(五五)亲和层析的应用亲和层析的应用抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数10108 8-10-101212 M M，所以洗脱时是比较困难的，通常需要所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。较强烈的洗脱条件。2,激素和受体蛋白激素和受体蛋白激激素素的的受受体体蛋蛋白白属属于于膜

24、膜蛋蛋白白，利利用用去去污污剂剂溶溶解解后后的的膜膜蛋蛋白白往往往往具具有有相相似似的的物物理理性性质质，难难于于用用通通常常的的层层析析技技术术分分离离。但但去去污污剂剂溶溶解解通通常常不不影影响响受受体体蛋蛋白白与与其其对对应应激激素素的的结结合合。所所以以利利用用激激素素和和受受体体蛋蛋白白间间的的高高亲亲和和力力(1010-6-6 _ _10101212M M)而而进进行行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目目前前已已经经用用亲亲和和层层析析方方法法纯纯化化出出了了大大量量的的受受体体蛋蛋白白，如如乙乙酰酰胆胆碱碱、肾肾上上腺腺素素、生生长长激激素素、

25、吗吗啡啡、胰胰岛岛素素等等等等多多种种激激素的受体。素的受体。(五五)亲和层析的应用亲和层析的应用3,凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。(五五)亲和层析的应用亲和层析的应用用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。4,多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸利利用用p

26、oly-U作作为为配配体体可可以以用用于于分分离离mRNA以以及及各各种种poly-U结结合合蛋蛋白白。poly-A可可以以用用于于分分离离RNA聚聚合合酶酶以以及及其其它它poly-A结合蛋白。结合蛋白。以以DNA作作为为配配体体可可以以用用于于分分离离各各种种DNA结结合合蛋蛋白白、DNA聚合酶、聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。(五五)亲和层析的应用亲和层析的应用5,辅酶辅酶核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲

27、和力可以对多种酶类进行分离纯化。类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。(五五)亲和层析的应用亲和层析的应用6,分离病毒、细胞分离病毒、细胞利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。作为配体都可以用于细胞的分离

28、。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。(五五)亲和层析的应用亲和层析的应用实例实例1:1:亲和层析法制备谷胱甘肽亲和层析法制备谷胱甘肽S-S-转移酶转移酶(GST)(GST)nGST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用。nGST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽肽（GSH）的亲核基团的亲核基团GS反应，中和它们的亲电部位，使反应，中和它们的亲电部位，使产物水溶性

29、增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。酸，被排出体外，从而达到解毒目的。n亲和层析利用亲和层析利用GST和其底物和其底物GSH的特异性结合来进行的特异性结合来进行GST的分离纯化的分离纯化。n缓缓冲冲液液A：0.025 mol/L磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，pH7.4，含含3mmol/L二二硫硫苏苏糖糖醇醇（DTT），1mmol/LEDTA，0.2mol/LNaCln缓缓冲冲液液B：0.025 mol/L磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，pH7.4，含含3mmol/LGSH，2mmol/LDTT 注注：根根据据酶酶

30、的的性性质质在在分分离离纯纯化化过过程程中中需需要要加加入入适适量量的的金属鳌合剂、还原剂等，以保持酶的活性。金属鳌合剂、还原剂等，以保持酶的活性。所需试剂所需试剂1.1.亲和层析介质亲和层析介质Sepharose4B-GSH的制备：的制备：Sepharose4B在在碱碱性性条条件件下下，加加入入环环氧氧氯氯丙丙烷烷和和二二氧氧六六环环活活化化将将GSH偶联到载体上，制成专一吸附剂。偶联到载体上，制成专一吸附剂。2.亲和层析柱的准备：亲和层析柱的准备：装装柱柱:柱柱床床体体积积约约4-6mL（柱柱高高约约2-3cm），连连接接蛋蛋白白监监测测系系统统，用用BufferA平衡（约平衡（约10-2

31、0mL），），至记录仪基线平稳。至记录仪基线平稳。3.上柱样品的准备：上柱样品的准备：(1)按按照照两两组组4g兔兔肝肝，剪剪碎碎，加加入入约约10倍倍组组织织重重的的BufferA，用用组组织捣碎机匀浆。织捣碎机匀浆。(2)匀匀浆浆液液先先用用低低速速离离心心机机离离心心10min，弃弃沉沉淀淀，上上清清再再次次离离心心（4，100000g，40min），弃沉淀，滤纸过滤上清液。），弃沉淀，滤纸过滤上清液。实验步骤实验步骤4.4.亲和层析柱分离亲和层析柱分离GSTGST：(1)(1)上柱：将滤液上柱，流速约上柱：将滤液上柱，流速约 4 4-5-5秒秒1 1滴。滴。(2)(2)平衡：用平衡：用

32、Buffer ABuffer A洗去杂蛋洗去杂蛋 白至柱中介质变白，记录仪白至柱中介质变白，记录仪 回到基线回到基线(3)(3)洗脱：用洗脱：用Buffer BBuffer B洗脱，流洗脱，流 速约速约4 4-5-5秒秒1 1滴，收集洗脱峰滴，收集洗脱峰 (约约5 5mLmL)分装冷冻。分装冷冻。上样上样平衡平衡洗脱洗脱亲和层析分离亲和层析分离GST示意图示意图 实例实例2:2:色素亲和层析色素亲和层析u三三嗪嗪类类色色素素配配基基的的特特点点是是化化学学稳稳定定性性高高,价价格格便便宜宜,适适用用范范围围广广,亲亲和和结结合合力力适适中中,蛋蛋白白质质容容量量大大。因因此此,色色素亲和层析的

33、操作成本低廉素亲和层析的操作成本低廉,有很高的实用价值。有很高的实用价值。u基基于于色色素素的的蛋蛋白白质质结结合合作作用用与与盐盐浓浓度度的的关关系系,色色素素亲亲和层析的吸附操作通常在和层析的吸附操作通常在低盐溶液低盐溶液中进行中进行。u用用相相同同的的低低浓浓度度盐盐溶溶液液清清洗洗后后,通通过过逐逐次次或或线线性性提提高高盐浓度的梯度洗脱法洗脱目标产物盐浓度的梯度洗脱法洗脱目标产物。色素亲和层析纯化脱氢酶色素亲和层析纯化脱氢酶:1)1)取取3 L3 L 菌体细胞抽提液菌体细胞抽提液,用低浓度盐溶液用低浓度盐溶液A A清洗清洗,除去未除去未吸附的杂蛋白吸附的杂蛋白。2)2)逐次用高浓度盐

34、溶液逐次用高浓度盐溶液B B和辅酶和辅酶溶液溶液C C洗脱洗脱,分别获得羟分别获得羟基酪酸脱氢酶基酪酸脱氢酶(3-HDH)(3-HDH)和苹果酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶(MDH)(MDH)活性峰活性峰。3)3)收集收集3-HDH3-HDH活性部分超滤浓缩到活性部分超滤浓缩到200 200 mLmL 后透析脱盐。后透析脱盐。4)4)再加入到另一个色素亲和柱再加入到另一个色素亲和柱,二次纯化二次纯化。经过两次纯化经过两次纯化,3-HDH,3-HDH比活提高比活提高213213倍倍,第一步第一步34.434.4倍倍,第二步第二步6.26.2倍倍,最终收率为最终收率为78%78%。(孙彦孙彦生物分离工程生

35、物分离工程P209)P209)利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配 基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相 上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨 酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异

36、螯合作用酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用 而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。金属螯合层析金属螯合层析(MetalChelatingChromatography)金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离n用基因工程的手段表达蛋白质，必需经过纯化才能实现最用基因工程的手段表达蛋白质，必需经过纯化才能实现最终目的。终目的。n不同性质的蛋白质纯化条件各不相同太难摸索，这一

37、点和不同性质的蛋白质纯化条件各不相同太难摸索，这一点和核酸相差甚远，所以将目的蛋白和一个核酸相差甚远，所以将目的蛋白和一个亲和纯化标签融合亲和纯化标签融合表达表达，通过亲和纯化，通过亲和纯化TagTag蛋白来纯化目的蛋白，就成为常蛋白来纯化目的蛋白，就成为常用的迂回手段。用的迂回手段。实例实例2:2:His-Tag融合蛋白融合蛋白6组氨酸与组氨酸与Ni-NTA的结合是不受构象影响的的结合是不受构象影响的,在天然或变形的在天然或变形的条件下进行一步纯化条件下进行一步纯化,使用的是温和的洗脱液环境，结合、洗使用的是温和的洗脱液环境，结合、洗涤和洗脱步骤不会对蛋白结构产生影响涤和洗脱步骤不会对蛋白结

38、构产生影响.6组氨酸标签比普通的标签组氨酸标签比普通的标签(Tag)要小得多，纯化后蛋白可以要小得多，纯化后蛋白可以直接进行下游操作。直接进行下游操作。6组氨酸可以用于任何表达系统，包括组氨酸可以用于任何表达系统，包括:细菌、杆装病毒和哺细菌、杆装病毒和哺乳动物。乳动物。6组氨酸标签在生理溶液组氨酸标签在生理溶液pH下不带电荷，标签不会干涉重组下不带电荷，标签不会干涉重组蛋白的结构和功能。蛋白的结构和功能。6组氨酸标签免疫原性差，重组蛋白可以不需要除去标签直组氨酸标签免疫原性差，重组蛋白可以不需要除去标签直接作为抗原进行免疫。接作为抗原进行免疫。利用利用Xa因子蛋白酶可以方便地将因子蛋白酶可以

39、方便地将6组氨酸标签有效地切除组氨酸标签有效地切除,去去除标签的蛋白可以用作晶体成像或者核磁共振研究。除标签的蛋白可以用作晶体成像或者核磁共振研究。His-TagHis-Tag的独特优势的独特优势nNi-NTANi-NTA亲和层析纯化亲和层析纯化His-TagHis-Tag融合蛋白融合蛋白NH2NH2NiHisHisHisHisproteinn该通用系统可在温和、非变性条件，或存在该通用系统可在温和、非变性条件，或存在6 M 6 M 胍或尿素条件下胍或尿素条件下纯化蛋白。最终在纯化蛋白。最终在2.5 2.5 mLmL的介质中可获得高达的介质中可获得高达20 mg20 mg的目的蛋白的目的蛋白。

40、纯化基本步骤纯化基本步骤n His Tag His Tag 序列（序列（6,86,8或或1010个连续的组氨酸残基个连续的组氨酸残基)与固定与固定His.BindHis.Bind树树 脂上的二价阳离子脂上的二价阳离子NiNi2+2+结合。并回收目标蛋白。结合。并回收目标蛋白。HisHis结合树脂可以结合树脂可以 再生并重复利用数次。再生并重复利用数次。n His His结合树脂是通过一步法来快速纯化带有结合树脂是通过一步法来快速纯化带有HisHis序列的金属螯和序列的金属螯和 介质介质。n 螯合螯合NiNi作为填充材料具有作为填充材料具有10 mg/10 mg/mLmL的蛋白结合能力。树脂与高

41、的蛋白结合能力。树脂与高 达达1.0 1.0 mMmM的的THPTHP（一种比（一种比DTTDTT更加稳定有效的还原剂）相容。更加稳定有效的还原剂）相容。内容：包括两个分支内容：包括两个分支内容：包括两个分支内容：包括两个分支n n亲和膜分离：制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离亲和膜分离：制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离亲和膜分离：制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离亲和膜分离：制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离n n亲和亲和亲和亲和-错流膜过滤：将水溶性或非水溶性的高分子亲和载体与错流膜过滤：将水溶性或非水溶性的高分子亲和载体与错流膜过滤：将水溶性或非水溶性的

42、高分子亲和载体与错流膜过滤：将水溶性或非水溶性的高分子亲和载体与 产物进行特异性反应，然后进行错流过滤产物进行特异性反应，然后进行错流过滤产物进行特异性反应，然后进行错流过滤产物进行特异性反应，然后进行错流过滤亲和膜亲和膜(AffinityMembrane)膜亲和过滤法是传统膜分离技术与亲和分离膜亲和过滤法是传统膜分离技术与亲和分离膜亲和过滤法是传统膜分离技术与亲和分离膜亲和过滤法是传统膜分离技术与亲和分离 技术的集成技术的集成技术的集成技术的集成,是一种十分有效的分离方法。是一种十分有效的分离方法。是一种十分有效的分离方法。是一种十分有效的分离方法。n n分离膜的改性分离膜的改性分离膜的改性

43、分离膜的改性通过化学改性，在载体表面连接上一条通过化学改性，在载体表面连接上一条通过化学改性，在载体表面连接上一条通过化学改性，在载体表面连接上一条 “手臂链手臂链手臂链手臂链”（大于三个碳原子）；（大于三个碳原子）；（大于三个碳原子）；（大于三个碳原子）；n n亲和膜制备亲和膜制备亲和膜制备亲和膜制备选用合适的配基选用合适的配基选用合适的配基选用合适的配基(LigandLigandLigandLigand)，与手臂链相连，与手臂链相连，与手臂链相连，与手臂链相连，构成带有亲和配基的分离介质；构成带有亲和配基的分离介质；构成带有亲和配基的分离介质；构成带有亲和配基的分离介质；n n亲和络合亲和

44、络合亲和络合亲和络合将混合物缓慢地通过膜，使要分离的物质与亲和将混合物缓慢地通过膜，使要分离的物质与亲和将混合物缓慢地通过膜，使要分离的物质与亲和将混合物缓慢地通过膜，使要分离的物质与亲和 配基产生特异性作用，形成配基与配位物配基产生特异性作用，形成配基与配位物配基产生特异性作用，形成配基与配位物配基产生特异性作用，形成配基与配位物 （LigateLigateLigateLigate）的复合体；）的复合体；）的复合体；）的复合体；n n 洗脱洗脱洗脱洗脱改变条件（洗脱液组成、改变条件（洗脱液组成、改变条件（洗脱液组成、改变条件（洗脱液组成、pHpHpHpH、离子强度、温度等）、离子强度、温度等

45、）、离子强度、温度等）、离子强度、温度等）使复合物解离；使复合物解离；使复合物解离；使复合物解离；n n亲和膜再生亲和膜再生亲和膜再生亲和膜再生 洗涤、再生、平衡，以备下次操作使用。洗涤、再生、平衡，以备下次操作使用。洗涤、再生、平衡，以备下次操作使用。洗涤、再生、平衡，以备下次操作使用。亲和膜分离技术亲和膜分离技术n n亲和超滤过程亲和超滤过程亲和超滤过程亲和超滤过程（分离目标物的同时，浓缩其他成分）（分离目标物的同时，浓缩其他成分）亲和膜分离操作方式亲和膜分离操作方式n n微孔亲和过滤过程（微孔亲和过滤过程（微孔亲和过滤过程（微孔亲和过滤过程（仅分离目标物）仅分离目标物）亲和膜分离操作方式亲和膜分离操作方式实例实例3:3:亲和膜过滤纯化伴刀豆蛋白亲和膜过滤纯化伴刀豆蛋白A A的实验装置的实验装置思考题思考题:1.请简述请简述His-Tag融合蛋白分离纯化的原理融合蛋白分离纯化的原理,并查找并查找文献举一例说明文献举一例说明。