蛋白定量法.ppt

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1、LOGO蛋白质定量法蛋白质定量法2023/4/23BiochemistryExperiments2一实验目的一实验目的掌握蛋白质定量法的分类、原理;掌握紫外分光光度法和Folin酚试剂法掌握标准曲线绘制;掌握分光光度计的使用;2023/4/23BiochemistryExperiments3二常用测定方法与原理二常用测定方法与原理1.凯氏微量定氮法凯氏微量定氮法2.紫外分光光度法紫外分光光度法3.双缩脲法双缩脲法4.Folin酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)5.考马氏亮蓝考马氏亮蓝-G2502023/4/23BiochemistryExperiments4 可见紫外分光光度法可见紫外分光光度

2、法(UV-visSpectrophotometry)2023/4/23BiochemistryExperiments5分光光度法 根据根据物质的吸收光谱及光的物质的吸收光谱及光的吸收定吸收定律律，对物质进行，对物质进行定性定性、定量定量分析的分析的一种方法。一种方法。2023/4/23BiochemistryExperiments6LambertBeer 定律定律:当入射光强度一定时，溶液当入射光强度一定时，溶液吸光度吸光度只与液层只与液层厚度和厚度和溶液浓度溶液浓度有关有关.2023/4/23BiochemistryExperiments7 分光光度计仪器型号很多，但其基本原理相似，其主要部

3、件用方框图示意如下光光源源 单色光器单色光器 吸收吸收池池 检测器检测器 讯号处讯号处理理 及显示器及显示器 分光光度计分光光度计2023/4/23BiochemistryExperiments8可见分光光度计是以可见光可见光(钨灯钨灯)为光源，而紫外分光光度计是以氢灯氢灯作光源，经单色器分光后提供所需的波长进入被测溶液。2023/4/23BiochemistryExperiments9(一一)紫外分光光度法紫外分光光度法蛋白质分子中蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有残基的苯环含有共轭共轭双键双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收

4、高峰在峰在280 nm波长处。波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。呈正比关系，可用作定量测定。优点优点:简单快速、不消耗样品、低浓度盐无干扰简单快速、不消耗样品、低浓度盐无干扰;缺点缺点:准确度差准确度差,受核酸影响。受核酸影响。2023/4/23BiochemistryExperiments10试剂管号012345678蛋白质标准溶液（1mg/ml）0.51.01.52.02.53.04.01.0(待测)蒸馏水4.03.53.02.52.01.51.003.0蛋白质浓度0.1250.2500.3750.5

5、000.6250.7501.00？光密度值（记录）0A1A2A3A4A5A6A7A82023/4/23BiochemistryExperiments11(二二)FolinFolin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法)Step 1碱性条件下碱性条件下蛋白质与铜蛋白质与铜作用生成蛋作用生成蛋白质铜复白质铜复合物合物蛋白质蛋白质铜复合物铜复合物使磷钨酸使磷钨酸磷钼酸磷钼酸还原还原显色反应，蓝色。显色反应，蓝色。A650在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。Step 22023/4/23BiochemistryExperiments12Fol

6、in酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)优点优点缺点缺点操作简便操作简便灵敏度高灵敏度高(25-250(25-250g)费时间较长，要精确费时间较长，要精确控制操作时间，标准控制操作时间，标准曲线不是严格的直线曲线不是严格的直线形式，专一性较差，形式，专一性较差，干扰物质较多干扰物质较多可检测的最低蛋白质量达可检测的最低蛋白质量达5 g/ml，通常测定范围，通常测定范围是是25250 g/ml 2023/4/23BiochemistryExperiments13实验操作实验操作（取（取7 7支干净的大试管编号操作）支干净的大试管编号操作）0 01 12 23 34 45 56 6牛血清白蛋白溶液

7、0.20.40.60.81.0待测样品1.0蒸馏水1.00.80.60.40.20.0试剂甲5555555混匀后室温10分钟试剂乙0.50.50.50.50.50.50.5立刻混匀,室温30min,0管调零,650nm比色Pr含量(g)？吸光度(A)2023/4/23BiochemistryExperiments14标准曲线法标准管对照法FolinFolin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法)2023/4/23BiochemistryExperiments15取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处(通常为max)，用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，标准

8、溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线标准曲线（工作曲线）。标准曲线法定量标准曲线法定量2023/4/23BiochemistryExperiments16理想标准曲线的特点理想标准曲线的特点过原点的直线;A在0.051.0之间；mgmg280nmA0.1250.250.3750.50.6252023/4/23BiochemistryExperiments17三实验操作注意事项三实验操作注意事项定量要求准确度高定量要求准确度高,吸量要保证准确吸量要保证准确,尤其是标尤其是标准蛋白准蛋白;FolinFolin酚试剂法加酚试剂后要迅速摇匀酚试剂法加酚试剂后要迅速摇匀;752752分光光度计使用时分光光度计使用时,注意保护石英杯注意保护石英杯,使用使用时不要离开桌面时不要离开桌面,不要对着试管敲打不要对着试管敲打.2023/4/23BiochemistryExperiments18四实验报告四实验报告题目实验原理实验标本实验结果与分析结论管号1234567A原始数据原始数据标准曲线标准曲线