组织化学技术教程 (2).ppt

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1、组织化学技术教程组织化学技术教程第一章绪论 组织化学（组织化学（histochemistry）是运）是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学，是介于这些学定位和定量研究的科学，是介于这些学科之间的一门边缘科学。组织化学自出科之间的一门边缘科学。组织化学自出现以来，已取得了长足的发展。这与相现以来，已取得了长足的发展。这与相关学科的发展是分不开的，其中细胞生关学科的发展是分不开的，其中细胞生物学、生物化学以及分

2、子生物学是组织物学、生物化学以及分子生物学是组织化学形成和发展的基础。化学形成和发展的基础。一、组织化学发展简史一、组织化学发展简史组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，它的历史相当悠久。早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应。如法国植物学家（1826）介绍了植物花和果受精过程中的碘淀粉反应；M.Perls（1867）用普鲁士蓝显示出铁；A.N.F.Millon(1844)叙述了蛋白质反应；R.Frnrohr（1850）论述了纤维素的氯锌碘法；Klebs(1868)Klebs(1868)和和H.Stuve1872)H.Stuve1872)用愈创木酯用愈创木

3、酯酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化物酶的存在；物酶的存在；P.Ehrlich(1885)P.Ehrlich(1885)发现了细发现了细胞色素氧化酶；胞色素氧化酶；R.Heidenhain(1868)R.Heidenhain(1868)指指出动质（出动质（ergastoplasmergastoplasm）核糖核酸是一核糖核酸是一种嗜硷性物质，可被醋酸沉淀；种嗜硷性物质，可被醋酸沉淀；F.F.Miescher(1873)Miescher(1873)利用甲绿对核染色质的选利用甲绿对核染色质的选择性亲和力，分离出核染色质。择性亲和力，分离出核染色质。自自A.A.

4、Bencke(1862)Bencke(1862)将将苯苯氨氨染染料料用用于于组组织织学学领领域域，许许多多研研究究者者在在组组织织中中应应用用了了染染色色反反应应，相相继继各各种种蛋蛋白白质质被被染染色色出出来来。到到1919世世纪纪末末，胶胶原原蛋蛋白白染染色色，脂脂肪肪的的苏苏丹丹染染色色以以及及组组织织中中金金属属盐盐类类的的显显色色等等技技术术方方法法得得到到发发展展。但但是是由由于于化化学学知知识识的的贫贫乏乏和和显显微微镜镜技技术术的的停停滞滞在在一一定定时期限制了组织化学的发展。时期限制了组织化学的发展。20 20世纪世纪3030年代，随着生物化学的发展和年代，随着生物化学的发展

5、和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时代。自从了复兴时代。自从E.TakamatsuE.Takamatsu（高松（高松英雄）和英雄）和G.Gomori 1939G.Gomori 1939年同时证明了年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的3030年间，酶组织化学得到了飞速发展，高年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、松证明了磷酰胺酶、ATPATP酶；酶；GomoriGomori设计设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。证明法。此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，

6、此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法（偶氮色素四唑盐法（tetrazolium salts tetrazolium salts methodmethod）以及磷酸化酶组织化学证明法等）以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是相继问世。特别是H.ScheldonH.Scheldon和和D.D.BrandesBrandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（酸酶，奠定了电镜酶组织化学（electron electron microscope enzy

7、me histochemistrymicroscope enzyme histochemistry）基）基础。础。后来后来A.M.Seligman(1967)A.M.Seligman(1967)提出提出锇锇黑黑化法（化法（Osmification methodOsmification method）进进一步一步阐阐述述了了电镜组织电镜组织化学的基本原理和反化学的基本原理和反应过应过程。程。1950 1950年年A.H.CoonsA.H.Coons等人提出了荧光抗体等人提出了荧光抗体法，从而把免疫学引入组织化学实验中，法，从而把免疫学引入组织化学实验中，后来后来P.K.NakaneP.K.Nak

8、ane，S.Avrameas S.Avrameas 和和L.L.A.SternbergerA.Sternberger等人以辣根过氧化物酶等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察，创立了酶标抗为标记物对酶进行观察，创立了酶标抗体法，从而为组织化学开辟了新途径。体法，从而为组织化学开辟了新途径。随着分子生物学的发展，随着分子生物学的发展，19691969年人年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上，开始探索原位杂交技术，经胞标本上，开始探索原位杂交技术，经过过3030年不断应用、完善和发展，特别是年不断应用、完善和发展，特别是探针制备与标记物两大关键技术的突

9、破，探针制备与标记物两大关键技术的突破，目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫学和发育生物学等各个领域，显示出巨学和发育生物学等各个领域，显示出巨大的应用潜力。大的应用潜力。现代组织化学已经渗透和应用于生现代组织化学已经渗透和应用于生命科学的许多学科，经过近几十年的发命科学的许多学科，经过近几十年的发展，产生了许多分支，如核酸与核蛋白、展，产生了许多分支，如核酸与核蛋白、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化合物与粘蛋白及粘多糖

10、、无机物组织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。总之，现代组学和放射自显影技术等。总之，现代组织化学的概念已经远远超过了原有范围，织化学的概念已经远远超过了原有范围，无论从理论、内容、技术手段、研究范无论从理论、内容、技术手段、研究范围都比过去更广泛、更深入。围都比过去更广泛、更深入。二、组织化学技术的基本要求二、组织化学技术的基本要求 1 1尽尽可可能能地地保保持持组组织织和和细细胞胞生生前前的的形形态态

11、结结构构、化化学学成成分分和和酶酶的的活活性性。为为此此必必须须选选择择适适当当的的固固定定液液和和恰恰当当的的处处理理方方法法，如如冷冷冻冻干干燥燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。2 2化学反应要求在细胞或组织内进行，须化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。和条件，使反应的产物不移位，不弥散。3 3反应物须有显色性和定量的可能性，即必须反应物须有显色性和定量的可能性，即必须 是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续

12、、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度 要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关 系。系。4 4反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研 究和验证。究和验证。5 5反应物有灵敏性和特异性反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。以利于对比观察。6 6反应产物有对照，否则难以判断其结果的可反应产物有对照，否则难以判断其结果的可 靠性。靠性。第二章第二章 组织化学基本理论组织化学基本理论 组组织织化化学学是是运运用用物物理理和和化化学学的的原原理理、技技术术研研究究组组织织与与细细胞胞内内

13、的的化化学学成成分分及及其其反反应应，对对这这些些化化学学成成分分进进行行定定性性、定定位位及及其其定定量量并并研研究究其其变变化化规规律律的的科科学学。它它是是介介于于组组织织学学、细细胞胞学学与与生生物物化化学学之之间间的的一一门门边边缘缘科科学学。人人们们对对生生物物组组织织的的研研究究沿沿着着两两条条主主要要途途径径发发展展：一一条条途途径径是是对对显显微微镜镜下下可可分分辨辨的的越越来来越越细细小小的的形形态态结结构构进进行行描描述述；另另一一条条途途径径是是着着力力分分离离和和描描述述具具有有重重要要生生物物学学意意义义的的物物质质，如如核核酸酸、蛋蛋白白质质、脂脂类类及及碳碳水水

14、化化合合物物等等。由由此此进进一一步步了了解解生生命命活活动动的的本本质质规规律律。两两条条途途径径的的研研究究结结果果互互相相处处近近，互互相相补补充充，并并在在细细胞胞、亚亚细细胞胞乃乃至至分分子子水水平平上上统统一一起起来，就形成了现代组织化学。来，就形成了现代组织化学。组组织织化化学学源源于于组组织织学学、细细胞胞学学和和生生物物化化学学；但但也也有有别别于于这这些些学学科科。组组织织化化学学与与组组织织学学不不同同：组组织织学学的的着着眼眼点点是是组组织织与与细细胞胞的的形形态态结结构构，组组织织学学技技术术的的要要求求是是尽尽可可能能保保持持组组织织和和细细胞胞的的微微细细结结构构

15、。而而组组织织化化学学的的着着眼眼点点是是组组织织与与细细胞胞内内化化学学成成分分的的组组成成，组组织织化化学学技技术术的的基基础础是是已知的化学反应。已知的化学反应。组组织织化化学学与与生生物物化化学学也也有有区区别别：虽虽然然二二者者都都着着眼眼于于组组织织与与细细胞胞内内的的化化学学组组成成成成分分及及其其含含量量，但但生生物物化化学学研研究究常常将将组组织织破破坏坏、制制成成匀匀浆浆、然然后后进进行行化化学学成成分分的的测测定定，其其化化学学反反应应主主要要在在试试管管内内进进行行故故其其定定位位性性能能差差；而而组组织织化化学学技技术术则则要要求求尽尽可可能能在在原原位位显显示示化化

16、学成分，故其定位、定位性能好。学成分，故其定位、定位性能好。组织化学的发展借助了许多物理学技组织化学的发展借助了许多物理学技术，特别是显微镜技术、电镜组织化学、电术，特别是显微镜技术、电镜组织化学、电镜细胞化学、荧光组织化学以及定量组织化镜细胞化学、荧光组织化学以及定量组织化学等，都是基于物理学技术发展起来的组织学等，都是基于物理学技术发展起来的组织化学分支。化学分支。一、组织化学的特征一、组织化学的特征 组织化学是应用物理的和化学的方组织化学是应用物理的和化学的方法来查明细胞组织的化学成分；是用组法来查明细胞组织的化学成分；是用组织学、化学、物理学原理研究细胞组织织学、化学、物理学原理研究细

17、胞组织的结构、功能与化学的关系；是对细胞的结构、功能与化学的关系；是对细胞组织成分的勘察、定位、定性、定量的组织成分的勘察、定位、定性、定量的特征来认识细胞组织结构与功能的关系。特征来认识细胞组织结构与功能的关系。因此，它具有较强的特征性。因此，它具有较强的特征性。1.1.组织化学的要求组织化学的要求 组织化学是建立在组织细胞形态学、生物物组织化学是建立在组织细胞形态学、生物物理学、生物化学及分子生物学学科基础上的一门理学、生物化学及分子生物学学科基础上的一门边缘学科，因此组织化学研究具有如下要求：边缘学科，因此组织化学研究具有如下要求：（1 1）要求形态结构真实完整。）要求形态结构真实完整。

18、（2 2）要求显色全过程均属于化学反应。）要求显色全过程均属于化学反应。（3 3）要求化学反应在组织细胞的原位被显示）要求化学反应在组织细胞的原位被显示（4 4）要求弄清化学成分与形态结构及空间的关）要求弄清化学成分与形态结构及空间的关 系。系。2 2研究方法研究方法 组组织织化化学学的的研研究究方方法法随随着着现现代代物物理理、化化学学技技术术的的发发展展而而不不断断更更新新，不不断断增增多多。总总体体说说来来，可可分分为为两两大大类类：一一类类是是分分离离分分析析法法，另一类是原位分析法。另一类是原位分析法。（1 1）分离分析法）分离分析法 分离分析法是将组织细胞分离分析法是将组织细胞的微

19、小器官从器官、组织、细胞内原位分离的微小器官从器官、组织、细胞内原位分离出来，测定其化学成分和分析化学组成与组出来，测定其化学成分和分析化学组成与组织细胞的关系。其中包括织细胞的关系。其中包括匀浆超速离心匀浆超速离心及及分分层分析法层分析法和和显微解剖分析显微解剖分析，即组织切片的微，即组织切片的微量化学分析法。量化学分析法。（2 2）原位分析法）原位分析法 组组织织细细胞胞在在器器官官原原位位上上不不经经分分离离，用用化化学学试试剂剂与与组组织织细细胞胞内内的的某某些些物物质质进进行行化化学学反反应应，最最终终在在局局部部呈呈现现有有色色反反应应，通通过过显显微微镜镜及及其其他他仪仪器器，如

20、如分分光光光光度度计计、荧荧光光显显微微镜镜等等组组织织细细胞胞内内的的化化学学反反应应进进行行定定位位、定定性性和和定定量量研研究究。常常用用的的方方法法包包括括：组组织织细细胞胞吸吸收收光光谱谱分分析析法法。荧荧光光分分析析法法。放射自显影术。放射自显影术。二、组织化学实验的基本条件二、组织化学实验的基本条件 组织中的各种物质可籍特殊的化学组织中的各种物质可籍特殊的化学反应被勘定。组织化学需要各种化学试反应被勘定。组织化学需要各种化学试剂，许多著名的组织化学研究室均有合剂，许多著名的组织化学研究室均有合成化学试剂的实验室，以保证创建或改成化学试剂的实验室，以保证创建或改进组织化学的技术方法

21、。良好的组织化进组织化学的技术方法。良好的组织化学方法必须具备下列条件：学方法必须具备下列条件：1 1、反应要具有专一性。、反应要具有专一性。2 2、高度稳定性、重复性。、高度稳定性、重复性。3 3、必须保持组织结构的完整性。、必须保持组织结构的完整性。4 4、能够作对照实验。、能够作对照实验。5 5、反应产物必须呈现颜色。、反应产物必须呈现颜色。6 6、反应结果必须是不溶性的有色沉积。、反应结果必须是不溶性的有色沉积。7 7、必须已知化学反应的全过程及影响反应的、必须已知化学反应的全过程及影响反应的 理化因素。理化因素。8 8、必须了解制片的过程对组化反应的影响。、必须了解制片的过程对组化反

22、应的影响。三、组织化学的基本原理三、组织化学的基本原理 研研究究组组织织细细胞胞的的化化学学及及其其化化学学反反应应机机制制是是为为了了了了解解机机体体器器官官、组组织织、细细胞胞生生理理和和病病理理功功能能的的一一种种必必要要方方法法。组组织织化化学学是是用用物物理理学学和和化化学学技技术术研研究究组组织织与与细细胞胞内内的的化化学学成成分分，并并观观察察这这些些化化学学成成分分的的定定性性、定定位位、定定量量与与变变化化规规律律的的科科学学。它它的的理理论论基基础础是是在在已已知知的的化化学学反反应应基基础础上上，严严格格控控制制其其化化学学反反应应过过程程的的科科学学。诸诸如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、碳碳水水化化合合物物、脂脂类类、无无机机盐盐及及酶酶类类等等（具具体体的的反反应应原原理理见见第第4 4、5 5、6 6章）。章）。