细胞悬浮培养.pptx

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1、会计学1细胞悬浮培养细胞悬浮培养5.1悬浮培养的方法 分批培养连续培养第1页/共74页 是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。（一）分批培养(batch culture)第2页/共74页 在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。分批培养的特点第3页/共74页一般是100250 ml三角瓶，每瓶中装有2075 ml培养基。分批培养所用的容器第4页/共74页 为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养

2、基中（大约稀释5倍）。第5页/共74页 滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长，而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长，而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。第6页/共74页 另外，如果缩短两次继代的时间间隔，例如，每另外

3、，如果缩短两次继代的时间间隔，例如，每2 23d3d即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长。即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长。据报道，加入条件培养基（据报道，加入条件培养基（即在其中曾培养过一段时间植物组织的培养基即在其中曾培养过一段时间植物组织的培养基）可以显著缩短滞后期的长度。）可以显著缩短滞后期的长度。第7页/共74页 如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。第8页/共74页提高细胞分散程度的方法1.尽可能使用易散碎的愈伤组织 愈伤组织的结构是受遗传因

4、子控制的，因而有时无论采用什么办法也难于使细胞充分分散。不过，一般来说，如果培养基的成分和继代方法选用得当，总有可能提高细胞的分散程度。如果把愈伤组织在半固体培养基上保存2-3个继代周期，其松散性常会增加。第9页/共74页 已知加入2,4-D，少量水解酶（如纤维素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的物质，都能促进细胞的分散。2.加入特殊物质（较少细胞之间的联系、减慢细胞分裂（较少细胞之间的联系、减慢细胞分裂的速度）的速度）第10页/共74页 如果每隔1d加一次新鲜培养基，使生物量与培养基容积之比保持为2，这样，悬浮培养细胞即可长期保持在对数生长晚期，于是就有可能使细胞最大程度分散。3.加新鲜培

5、养基第11页/共74页 在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注射器，但其在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细胞和小细胞团（进液口的孔径必须小到只能通过单细胞和小细胞团（(2-4(2-4个细胞），个细胞），而不能通过大的细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬浮液。而不能通过大的细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬浮液。4.选择单细胞和小细胞团进行继代 第12页/共74页但是必须记住，即使在分散程度最好的悬浮液中也存在着细胞团，每个细胞团由几个或几十个细胞组

6、成，只含有游离细胞的悬浮液是没有的。这是因为植物细胞具有集聚在一起的特性，由一个初始细胞经过分裂产生的若干个子细胞，不能像子代细菌那样各自分散在培养液中。第13页/共74页（二）连续培养（continuous culture）指在培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定，使培养液中的营养物质得到不断补充。第14页/共74页加入培养基排出培养基及其培养物连续培养图示：第15页/共74页连续培养的类型封闭型开放型第16页/共74页 排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，进出数量保持平衡。封闭型连续培养的特点 悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来之后，又被放回到培养

7、系统中。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。第17页/共74页 注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液及其中细胞的容积相等。开放型连续培养的特点 培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的恒定水平上（通过调节流入和流出的速度）。第18页/共74页 开放型培养又可分为两种主要方式：（控制生长速度的方法）一是化学恒定式；二是浊度恒定式。第19页/共74页5.2 细胞悬浮培养的培养基 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基，一般来说也同样适用于建立该物种的悬浮培养，只是琼脂当然要从中去掉。第20页/共74页条件培养基的使用方法 简便方法是把在液体培养基中培养了46周的高密度细胞滤掉，而用它的

8、培养基制成悬滴或薄层来培养单细胞或低密度细胞群体。条件培养基是在其中曾培养过一段时间植物组织的培养基。第21页/共74页培养基的振荡 首先，它可对细胞团施加一种缓和的压力使它们破碎成小细胞团和单细胞；其次，振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布。此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之间的气体交换。第22页/共74页在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动，可以使用各种类型的设计。(1)旋转培养(2)往返震荡培养(3)旋转震荡培养(4)搅动培养第23页/共74页 旋转培养器旋转培养器第24页/共74页液晶屏双层震荡培养器第25页/共74页磁力搅拌培养器第26页/共74页5.3 悬

9、浮培养细胞的同步化 同步培养是指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段(G1，S，G2和M)。同步性程度以同步百分数表示。第27页/共74页确定同步性的参数在某一时刻处于细胞周期某一点上的细胞的百分数；在一个短暂的具体时间内通过细胞周期中某一点的细胞的百分数；全部细胞通过细胞周期中某一点所需的总时间占细胞周期时间长度的百分数。第28页/共74页物理方法和化学方法。物理方法和化学方法。物理方法物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的控制，实现高度同步化，其中包括主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）

10、的控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小进行选择的方法和低温休克法等。按细胞团的大小进行选择的方法和低温休克法等。悬浮培养细胞同步化的方法有两类：悬浮培养细胞同步化的方法有两类：第29页/共74页化学方法化学方法的原理是使细胞遭受某种的原理是使细胞遭受某种营养饥饿营养饥饿，或是通过加人某种，或是通过加人某种生化抑制剂生化抑制剂阻止细胞完成其分裂周期。化学方法中常用的有阻止细胞完成其分裂周期。化学方法中常用的有饥饿法饥饿法和和抑制法抑制法两种。两种。第30页/共74页（一）饥饿法 在这种方法中，先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间

11、的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。第31页/共74页（二）抑制法（二）抑制法 使用使用DNADNA合成抑制剂如合成抑制剂如5-5-氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能进行到氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能进行到G1G1期为止，细胞都滞留在期为止，细胞都滞留在G1G1期和期和S S期的边界上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进期的边界上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分裂。同步分裂。应用这种方法取得的细胞

12、同步性只限于一个细胞周期。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期。第32页/共74页5.4 细胞增殖的测定 1.细胞鲜重 将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重（将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重（fresh weightfresh weight）。）。第33页/共74页2.细胞干重 用已知重量的干尼龙丝网依用已知重量的干尼龙丝网依1 1的方法收集细胞，在的方法收集细胞，在6060下干燥下干燥48 h48 h

13、或或8080下干燥下干燥36 h36 h，细胞干重恒定后，再称重。细胞干重（，细胞干重恒定后，再称重。细胞干重（dry dry weightweight）以每毫升培养物或每）以每毫升培养物或每101066个细胞的重量表示。个细胞的重量表示。第34页/共74页3.细胞密实体积 为了测定细胞密实体积（packed cell volume,PCV)，将一已知体积的均匀分散的悬浮液（1020 mL）放入一个刻度离心管（1550 mL）中，在2 0004 000 r/min下离心5 min。细胞密实体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。第35页/共74页 当悬浮液的当悬浮液的黏黏度较高时，常出现一

14、些细胞不沉淀的情况，度较高时，常出现一些细胞不沉淀的情况，此时可用水稀释至此时可用水稀释至2 2倍。但是，用水稀释后渗透压过于下降倍。但是，用水稀释后渗透压过于下降时，会出现细胞变形，将得不到真正的时，会出现细胞变形，将得不到真正的PCVPCV，所以用水稀释，所以用水稀释时尽可能最低限度进行，并且动作要迅速。时尽可能最低限度进行，并且动作要迅速。注意事项：所用离心机的转头，应是悬式水平转头，这样沉淀物表所用离心机的转头，应是悬式水平转头，这样沉淀物表面不会出现斜面，以便正确测定。面不会出现斜面，以便正确测定。在测定细胞体积时，有时也用这样的方法：使细胞自然沉淀，测定其体积，称为沉淀体积（set

15、tled cell volume)。第36页/共74页4.细胞计数 计算悬浮细胞数即细胞计数（计算悬浮细胞数即细胞计数（cell number)cell number)，通常用血球计数板。计算较大的细胞数量时，可以使用特制的计数盘（，通常用血球计数板。计算较大的细胞数量时，可以使用特制的计数盘（counting chamber)counting chamber)。第37页/共74页 由于在悬浮培养中总存在着大小不同的细胞团，因而通过由培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞计数。如果先用铬酸（由于在悬浮培养中总存在着大小不同的细胞团，因而通过由培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞计数。如果先用铬酸（5

16、 58 8）或果胶酶）或果胶酶(o.25%(o.25%）对细胞和细胞团进行处理，使其分散，解离成单细胞，则可提高细胞计数的准确性。）对细胞和细胞团进行处理，使其分散，解离成单细胞，则可提高细胞计数的准确性。第38页/共74页StreetStreet及其同事用以计数假挪威槭细胞的方法是：把及其同事用以计数假挪威槭细胞的方法是：把1 1份培养物加入到份培养物加入到2 2份份8 8三氧化铬溶液中，在三氧化铬溶液中，在7070下加热下加热2 2 15 min15 min，然后将混合物冷却，用力振荡，然后将混合物冷却，用力振荡10 min10 min，用血球计数板进行细胞计数。，用血球计数板进行细胞计数

17、。用这些物质处理时，有时细胞会被破坏，或者出现变形，所以对每种材料应研究其最适宜的处理方法。第39页/共74页5.5 由悬浮细胞再生植株 在所用培养基适当、继代培养及时的情况下，悬浮培养细胞能保持相当长时间的植株再生能力。如水稻悬浮细胞每3d继代一次，悬浮培养18个月后，其植株再生率仍高达90%。第40页/共74页由悬浮培养细胞再生植株的途径有两种：一种是由悬浮细胞直接形成体细胞胚，如在胡萝卜的细胞悬浮培养中，在含有2,4-D的MS液体培养基中进行悬浮振荡培养，悬浮培养细胞团能够高频率(80%）直接形成体细胞胚。第41页/共74页另一种是先将悬浮培养细胞（团）转移到半固体或固体培养基上，使其增

18、殖形成愈伤组织，然后再由愈伤组织再生植株。第42页/共74页 在后一种情况下，如果悬浮培养中的细胞较大，则可将培养瓶短时间静置令细胞团自然沉降后，用吸管将细胞团转到半固体培养基上培养。这种培养基的组成基本上与继代培养基一致，但也须视情况做些调整，特别是在激素组成方面做些调整。第43页/共74页 对于单细胞、低密度悬浮细胞、或是过于细小的细胞团，则不宜直接把它们转到半固体培养基上培养，而是要参照原生质体或单细胞培养方法，先对它们进行液体浅层培养或看护培养，待形成较大的细胞团后，再转到半固体培养基上诱导愈伤组织。第44页/共74页5.6 影响细胞悬浮培养的因素 1.基本培养基的组成(1)氮源 在具

19、有功能NH4+和NO3-利用系统的培养中，氮吸收常取决于培养基的pH值和培养物的年龄。例如，矮牵牛悬浮细胞在pH4.85.6下培养起始吸收的NO3-比NH4+多，可是在许多情况下，NH4+只能在低pH值的培养基中被利用。低浓度的总氮通过刺激细胞分裂导致大量小细胞的形成，而高浓度的总氮往往利于细胞生长。第45页/共74页（2)2)磷磷 植物细胞以各种方式吸收磷，其浓度常常是细胞分裂和生长的限制因子，它与由核苷酸库（植物细胞以各种方式吸收磷，其浓度常常是细胞分裂和生长的限制因子，它与由核苷酸库（ATP,ADP,AMP)ATP,ADP,AMP)所引起的能量水平以及所引起的能量水平以及RNARNA和和

20、DNADNA合成直接相关合成直接相关。磷通常抑制游离氨基酸的积累。磷通常抑制游离氨基酸的积累。第46页/共74页(3)硫 硫的缺失使所有蛋白质的合成自动停止。如果含硫氨基酸不能继续产生，它们便不能参加蛋白质的合成。用硫代硫酸盐、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸和谷胱甘肽代替无机盐，能使烟草悬浮细胞充分生长；而D-半胱氨酸、D-甲硫氨酸和DL-高半胱氨酸只能使烟草悬浮细胞的生长减少程度保持最低。第47页/共74页(4)镁、钾、钙 到目前为止，几个报道已经表明，这些大量元素是绝对必要的。有关这些元素如K的最适浓度（胡萝卜为l mmol/L,矮牵牛和烟草为20 mmol/L)的研究认为，不同培养物在吸收能

21、力方面存在差异。例如，在大豆等植物的培养中，在培养期间几乎所有的K都被培养细胞所吸收；相反，在烟草的细胞培养中，发现到了培养末期仍有最初浓度（20 mmol/L）的一半的K留在培养基中未被利用（Kato等，,1977)。第48页/共74页(5)氯 Cl一通常影响光系统II的酶类及液泡形成体的ATP酶的活动，干扰细胞的渗透调节（osrnoregulation)。在许多情况下，C1一可由Br一和I一所代替。第49页/共74页(6)微量元素 微量元素的影响与所用的材料密切相关。例如，锰微量元素的影响与所用的材料密切相关。例如，锰对对RutagraveolensRutagraveolens是必需的，而

22、对水稻无影响，对胡萝卜是必需的，而对水稻无影响，对胡萝卜悬浮细胞的生长有促进作用。缺铁常导致细胞生长的中途悬浮细胞的生长有促进作用。缺铁常导致细胞生长的中途停止，而高浓度的铁（停止，而高浓度的铁（1 mmol/L1 mmol/L）通常又有抑制作用）通常又有抑制作用(Mizukami(Mizukami等，等，1977)1977)；在大多数情况下，铁浓度以；在大多数情况下，铁浓度以0.05-0.05-0.2 mmol/L0.2 mmol/L为宜。同时，我们应该考虑各种元素之间对吸为宜。同时，我们应该考虑各种元素之间对吸收的互作效应。例如，极少量的钛收的互作效应。例如，极少量的钛(Ti(Ti）有助于

23、所有大量元）有助于所有大量元素和微量营养成分的吸收。硼特别影响葡萄糖的吸收。素和微量营养成分的吸收。硼特别影响葡萄糖的吸收。第50页/共74页2.有机成分(1)氨基酸类 除精氨酸和赖氨酸外，添加作为氮源NO3-的替代物的氨基酸，通常抑制细胞的生长。实际上，在某些情况下，精氨酸能够补偿其他氨基酸的抑制作用；相反，在颠茄的愈伤组织培养中，精氨酸又是一种抑制剂；但以NH4+作为氮源时却没有抑制作用。此外，不同氨基酸之间是相互影响的。在烟草细胞悬浮培养中，半胱氨酸的吸收受L-亮氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸和L-脯氨酸的抑制。第51页/共74页(2）维生素类 对维生素类的需求因植物而异。硫胺素通常是需要

24、的（0.1 30 mg/L）。在Convolvulus arvensis悬浮培养中，硫胺素缺乏能够诱导细胞显著分裂。在Acer pseudoplatanus悬浮培养中，如果硫胺素、吡哆酸、半胱氨酸、胆碱、肌醇都缺乏，则悬浮细胞的生长显著下降；但如果仅缺乏其中的一种，则无影响。在少数情况下，发现添加烟酸和吡哆醇能刺激细胞生长。第52页/共74页3.碳源(1)碳水化合物 培养物对各种碳水化合物的反应取决于所培养的植物种类和碳水化合物浓度（表6-3、表6-4）。例如，有些培养物在仅加葡萄糖时便能正常生长，而有些培养物需要在培养基中加人果糖或蔗糖（23%）才能正常生长。肌醇对各种培养物都是必需的。第5

25、3页/共74页(2)CO2 通常，细胞生长随着CO2 质量分数的增加而增加，但也有例外。为了维持细胞生长以及使光自养培养物完全绿化，需要连续提供2一5的CO2。第54页/共74页4.植物激素(1)生长素类 生长素类的影响因所用植物种类及生长素种类不同而不同。2,4-D特别有利于薄壁细胞的生长，所以在植物细胞悬浮培养中，常加人适宜浓度的2,4-D。第55页/共74页(2)细胞分裂素 细胞分裂素的效果受多种因素的影响，因所选用的植物种类、激素种类及浓度不同而不同。植物细胞中的细胞分裂素可被细胞分裂素氧化酶钝化。在烟草中，细胞分裂素的降解似乎受到外源细胞分裂素的调控，后者导致细胞分裂素氧化酶的迅速增

26、加。细胞分裂素诱导细胞分裂。有关细胞分裂素的作用位点及作用机理目前所知甚少。第56页/共74页(3)乙烯 内源乙烯生产是旺盛分裂细胞的特征，因此其生产受到生长素(IAA,NAA,2,4-D）的促进。在非光合培养物中，乙烯同其他激素协同作用。乙烯诱导细胞壁增厚。用2-氯一乙烯一磷酸处理释放出乙烯，结果由于液泡体积减小，从而导致致密的细胞发育。第57页/共74页 pH值对铁吸收以及悬浮细胞的生活力的影响很大。H浓度的变化常常影响特定酶反应。在有些培养中，悬浮细胞生活力的下降可通过添加椰子汁(10%）或聚乙烯吡咯烷酮(PVP，1%）来改善，这是因为它们具有缓冲作用。5.培养基的pH值及渗透压第58页

27、/共74页6.振荡频率（shaking frequency,stirring frequency）振荡频率对悬浮培养中的细胞团大小、细胞生活力和生长均有影响。例如，玫瑰细胞在30 r/min下仍能存活而且不被损伤，可是烟草细胞只能耐受最大150 r/min的振荡。第59页/共74页7.培养条件 光的波长及光照强度对悬浮培养细胞具有影响。据报道，高光照强度能够提高烟草的绿色愈伤组织由来的单细胞植板效率，但抑制无叶绿素的培养物的细胞生长。一般来说，(26士3)的温度适合于植物生长。过高、过低的温度均不利于悬 浮细胞的增殖。第60页/共74页5.7 细胞悬浮培养主要应用1、植物有用物质的生产2、诱发

28、和筛选突变体3、原生质体培养和细胞分离4、食品生产。第61页/共74页5.8 5.8 植物细胞大规模培养及有用物质生产植物细胞大规模培养及有用物质生产植物细胞大规模培养及有用物质生产植物细胞大规模培养及有用物质生产n n（一）（一）概述概述n n（二）植物细胞规模化培养体系的建立（二）植物细胞规模化培养体系的建立n n（三）生物反应器的类型及特点（三）生物反应器的类型及特点n n（四）利用细胞培养生产有用物质（四）利用细胞培养生产有用物质（四）利用细胞培养生产有用物质（四）利用细胞培养生产有用物质第62页/共74页n n（一）（一）（一）（一）概述概述概述概述n n植物体中次生代谢物植物体中次

29、生代谢物植物体中次生代谢物植物体中次生代谢物(Secondary metaboites)(Secondary metaboites)的产生和分的产生和分的产生和分的产生和分布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性，同布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性，同布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性，同布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性，同时，受到环境中各种因素的影响。人们利用次生代谢产时，受到环境中各种因素的影响。人们利用次生代谢产时，受到环境中各种因素的影响。人们利用次生代谢产时，受到环境中各种因素的影响。人们利用次生代谢产物作为药材、香料、化工及食品的历史十分悠久，

30、在人物作为药材、香料、化工及食品的历史十分悠久，在人物作为药材、香料、化工及食品的历史十分悠久，在人物作为药材、香料、化工及食品的历史十分悠久，在人类防病治病历史上，次生代谢物也一直发挥着重要作用。类防病治病历史上，次生代谢物也一直发挥着重要作用。类防病治病历史上，次生代谢物也一直发挥着重要作用。类防病治病历史上，次生代谢物也一直发挥着重要作用。n n随着对次生代谢产物了解的不断深入，其功能越来越多随着对次生代谢产物了解的不断深入，其功能越来越多随着对次生代谢产物了解的不断深入，其功能越来越多随着对次生代谢产物了解的不断深入，其功能越来越多地被人们所了解，应用越来越广泛，人类对其需求量也地被人

31、们所了解，应用越来越广泛，人类对其需求量也地被人们所了解，应用越来越广泛，人类对其需求量也地被人们所了解，应用越来越广泛，人类对其需求量也越来越大。而越来越大。而越来越大。而越来越大。而野生植物中次生代谢物产量十分有限野生植物中次生代谢物产量十分有限野生植物中次生代谢物产量十分有限野生植物中次生代谢物产量十分有限，因，因，因，因此，通过细胞大规模培养技术来生产植物次生代谢物受此，通过细胞大规模培养技术来生产植物次生代谢物受此，通过细胞大规模培养技术来生产植物次生代谢物受此，通过细胞大规模培养技术来生产植物次生代谢物受到广泛关注。到广泛关注。到广泛关注。到广泛关注。第63页/共74页n n与其它

32、的方法相比与其它的方法相比与其它的方法相比与其它的方法相比,应用植物细胞培养技术生产应用植物细胞培养技术生产应用植物细胞培养技术生产应用植物细胞培养技术生产次生代谢产物具有以下次生代谢产物具有以下次生代谢产物具有以下次生代谢产物具有以下优点优点优点优点:n n(1)(1)能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、均匀生产均匀生产均匀生产均匀生产,不受病虫害、地理和季节等各种环境不受病虫害、地理和季节等各种环境不受病虫害、地理和季节等各种环境不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的

33、影响因素的影响因素的影响因素的影响;n n(2)(2)可以在生物反应器中进行大规模培养可以在生物反应器中进行大规模培养可以在生物反应器中进行大规模培养可以在生物反应器中进行大规模培养,并通过并通过并通过并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物;n n(3)(3)所获得的产物可从培养体系内直接提取所获得的产物可从培养体系内直接提取所获得的产物可从培养体系内直接提取所获得的产物可从培养体系内直接提取,并快并快并快并快速、高效的回收与利用速、高效的回收与利用速、高效的

34、回收与利用速、高效的回收与利用,简化了分离与纯化的步简化了分离与纯化的步简化了分离与纯化的步简化了分离与纯化的步骤骤骤骤;第64页/共74页n n(4)有利于细胞筛选、生物转化有利于细胞筛选、生物转化,合成新的有效成分合成新的有效成分;n n(5)有利于研究植物的代谢途径有利于研究植物的代谢途径,还可以利用某些基因工程手段还可以利用某些基因工程手段探索与创造新的合成路线探索与创造新的合成路线,得到得到价值更高的产品价值更高的产品;n n(6)节省大量用于种植原料的农节省大量用于种植原料的农田田,以便进行粮食作物的生产。以便进行粮食作物的生产。第65页/共74页n n1 1、若干有用物质的生产、

35、若干有用物质的生产、若干有用物质的生产、若干有用物质的生产:如生物碱、苷类物质、醌类物质、蛋白质、食品如生物碱、苷类物质、醌类物质、蛋白质、食品如生物碱、苷类物质、醌类物质、蛋白质、食品如生物碱、苷类物质、醌类物质、蛋白质、食品添加剂、农药等。添加剂、农药等。添加剂、农药等。添加剂、农药等。n n2 2、存在的问题：、存在的问题：、存在的问题：、存在的问题：在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢物产量低等问细胞生长缓慢、不耐剪切

36、力及代谢物产量低等问细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢物产量低等问细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢物产量低等问题又成为其实现规模化生产的瓶颈题又成为其实现规模化生产的瓶颈题又成为其实现规模化生产的瓶颈题又成为其实现规模化生产的瓶颈 。第66页/共74页n n3、技术要求：、技术要求：充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系（细充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系（细充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系（细充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系（细胞遗传稳定，细胞生长和生物合成快，次生代谢胞遗传稳定，细胞生长和生物合成快，次生代谢胞遗传稳定，细胞生长和生物合成快，次生代谢胞遗传稳定，细胞生长和生物合

37、成快，次生代谢产物易积累而不宜分解）、深入研究特定代谢产产物易积累而不宜分解）、深入研究特定代谢产产物易积累而不宜分解）、深入研究特定代谢产产物易积累而不宜分解）、深入研究特定代谢产物的生物合成途径、对培养条件进行优化等等。物的生物合成途径、对培养条件进行优化等等。物的生物合成途径、对培养条件进行优化等等。物的生物合成途径、对培养条件进行优化等等。n n所以，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应所以，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应所以，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应所以，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应器是解决这些问题的根本途径。器是解决这些问题的根本途径。器是解决这些问题的根

38、本途径。器是解决这些问题的根本途径。第67页/共74页n n（二）植物细胞规模化培养体系的建立（二）植物细胞规模化培养体系的建立（二）植物细胞规模化培养体系的建立（二）植物细胞规模化培养体系的建立n n1 1、高产细胞系的选择、高产细胞系的选择、高产细胞系的选择、高产细胞系的选择 （1 1）准确选择生产目的化合物的植物种类）准确选择生产目的化合物的植物种类）准确选择生产目的化合物的植物种类）准确选择生产目的化合物的植物种类 （2 2）尽量选择自然状态下产生天然产物的）尽量选择自然状态下产生天然产物的）尽量选择自然状态下产生天然产物的）尽量选择自然状态下产生天然产物的 组织器官作为外植体组织器官

39、作为外植体组织器官作为外植体组织器官作为外植体 （3 3）高产种子细胞克隆的方法）高产种子细胞克隆的方法）高产种子细胞克隆的方法）高产种子细胞克隆的方法 先建立单细胞培养先建立单细胞培养先建立单细胞培养先建立单细胞培养 ，产生愈伤组织，一份，产生愈伤组织，一份，产生愈伤组织，一份，产生愈伤组织，一份进行含量测定，一份保留培养。进行含量测定，一份保留培养。进行含量测定，一份保留培养。进行含量测定，一份保留培养。第68页/共74页n n2 2、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养n n3 3、大规模生产体系的建立、大规模生产

40、体系的建立、大规模生产体系的建立、大规模生产体系的建立 分批培养分批培养分批培养分批培养 连续培养连续培养连续培养连续培养 半连续培养半连续培养半连续培养半连续培养第69页/共74页n n（三）生物反应器的类型及特（三）生物反应器的类型及特点点n n1、机械搅拌式培养系统、机械搅拌式培养系统n n2、气压式搅拌培养系统、气压式搅拌培养系统n n3、旋转式培养系统、旋转式培养系统n n4、固定化培养系统、固定化培养系统第70页/共74页n n（四）利用细胞培养生产有用物质（四）利用细胞培养生产有用物质（四）利用细胞培养生产有用物质（四）利用细胞培养生产有用物质n n1 1、一般程序：、一般程序：

41、、一般程序：、一般程序：n n（1 1）选材）选材）选材）选材 a a、对其有效成分有充分了解、对其有效成分有充分了解、对其有效成分有充分了解、对其有效成分有充分了解 b b、有测定有效成分的可靠方法、有测定有效成分的可靠方法、有测定有效成分的可靠方法、有测定有效成分的可靠方法 c c、市场短缺与价格、市场短缺与价格、市场短缺与价格、市场短缺与价格 d d、取有效成分的部位，且该部位易形成愈伤组织、取有效成分的部位，且该部位易形成愈伤组织、取有效成分的部位，且该部位易形成愈伤组织、取有效成分的部位，且该部位易形成愈伤组织第71页/共74页n n（2 2）、细胞体系的建立）、细胞体系的建立）、细胞体系的建立）、细胞体系的建立n n（3 3）、大量培养）、大量培养）、大量培养）、大量培养n n（4 4）、产品的提取与纯化）、产品的提取与纯化）、产品的提取与纯化）、产品的提取与纯化第72页/共74页n n2、提取有用物质生产效率的技、提取有用物质生产效率的技术因素术因素：n n（1）筛选高产细胞系）筛选高产细胞系n n（2）两步培养法）两步培养法n n（3）培养基中加入有用物质的）培养基中加入有用物质的前体前体n n（4）培养基中激素的作用）培养基中激素的作用n n（5）培养条件）培养条件n n（6）采用固定化培养系统）采用固定化培养系统第73页/共74页