T_CAQI 239-2021 粮油中黄曲霉毒素B1的快速测定 便携式液相色谱法.docx

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1、T/CAQI239-2021粮油中黄曲霉毒素B1的快速测定便携式液相色谱法1范围本文件描述了采用便携式液相色谱仪测定粮油中黄曲霉毒素B1（以下简称AFTB1）的原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、结果计算、精密度、检出限与定量限以及确证检测的方法。本文件适用于食品（农产品）检测实验室、快检实验室和移动实验室等场所，进行谷物及其制品、豆类及其制品、油脂及其制品中AFTB1的快速测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB5009

2、.22食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理用乙醇-水溶液提取试样中的AFTB1，固相净化柱法或免疫磁珠法净化，液相色谱分离，柱后衍生，经荧光检测器检测，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1试剂4.1.1乙腈(CH3CN)：色谱纯。4.1.2乙醇(C2H5OH)：色谱纯。4.1.3氯化钠(NaCl)。4.1.4磷酸氢二钠(Na2HPO4)。4.1.5磷酸二氢钾(KH2PO4)。4.1.6氯化钾(KCl)。4.1.7盐酸(HCl)。4.2试剂配制4.2.1乙醇水溶液量取

3、70mL乙醇（4.1.8），用水稀释至100mL。4.2.2磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液）称取8.00g氯化钠（4.1.3）、1.20g磷酸氢二钠（4.1.4）、0.20g磷酸二氢钾（4.1.5）、0.20g氯化钾（4.1.6），用900mL水溶解，用盐酸（4.1.7）调节pH至7.4，用水定容至1T/CAQI239-20211000mL。4.3标准品采用经国家认证并授予标准物质证书的AFTB1标准物质，浓度为10.0g/mL。4.4标准储备液准确移取AFTB1标准溶液(4.3)1.00mL至100mL容量瓶中，乙腈（4.1.1）定容。该储备液浓度为100ng/mL，此溶液密封后避光-20下保存

4、，有效期三个月。4.5标准工作溶液准确移取浓度为100ng/mLAFTB1标准溶液0.50mL于50mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，浓度为1ng/mL。4.6材料4.6.1黄曲霉毒素免疫磁珠前处理试剂盒：回收率85%，对于不同批次的试剂盒在使用前需进行质量验证。4.6.2黄曲霉毒素固相净化柱：5mL，含有极性、非极性及离子交换等多种类型基团的吸附剂，适用于粮食、食用油样品基质净化的固相净化柱，回收率80%。4.6.3玻璃纤维滤纸。4.6.4液相色谱进样针。4.6.5筛网：1mm-2mm试验筛孔径。5仪器和设备5.1便携式液相色谱仪（配备柱后衍生和荧光检测器），或黄曲霉毒素检测仪（配备液相

5、色谱系统和黄曲霉毒素检测器），或液相色谱仪（配备柱后衍生和荧光检测器）。5.2分析天平：感量为0.01g。5.3涡旋混合器。5.4高速粉碎机。5.5磁棒和磁棒套或含有磁棒套的全自动净化仪。6分析步骤警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光（直射阳光）、具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。6.1试样制备6.1.1液体样品将适量液体样品在一个容器中充分混合均匀，储存于样品瓶中备用。6.1.2固体样品将适量固体样品用粉碎机粉碎至全部通过筛网，充分混合均匀，储存于样品瓶中备用。6.2试样前处理6.2.1提取准确称取2.5

6、0g（精确到0.01g）制备后样品于50mL离心管中，加入10mL提取液2时间（min）流动相A（%）:水流动相B（%）:乙腈07030260404.530706.5703087030T/CAQI239-2021（4.2.1），涡旋提取3min，静置或用玻璃纤维滤纸过滤，上清液（或滤液）用固相净化柱或免疫磁珠法净化。6.2.2净化6.2.2.1固相净化柱法移取4mL上清液（或滤液），过黄曲霉毒素固相净化柱（4.6.2）净化，取1mL净化后液体，经0.45m滤膜过滤后，置于液相色谱进样瓶中自动进样或注射器吸取手动进样测定。6.2.2.2免疫磁珠法（移取1mL上清液（或滤液）于20mL离心管中，加

7、入8mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）4.2.2），加入10mg黄曲霉毒素免疫磁珠，涡旋振荡反应3min，磁吸分离，磁珠转移至10mL离心管中，加入1mL甲醇（4.1.2）涡旋振荡洗脱1min，磁吸分离，收集洗脱的净化液，经0.45m滤膜过滤后，置于液相色谱进样瓶中自动进样或注射器吸取手动进样测定。注1：使用不同厂商的免疫磁珠时在操作方面可能有所不同，应按照其使用说明要求进行操作。注2：全自动免疫磁珠净化仪可优化操作参数后使用。6.3仪器测定6.3.1液相色谱参考条件液相色谱参考条件包括：a)色谱柱：C18柱，4.6mm150mm，粒径5.0m，或性能相当者；b)流动相：A为水，B为乙腈（4.1.1

8、），梯度洗脱程序见表1；c)流速：1.0mL/min；d)柱温：40；e)进样量：50L；f)荧光检测波长：激发波长360nm；发射波长440nm。表1流动相梯度洗脱程序6.3.2标准工作溶液的测定3T/CAQI239-2021将浓度为1ng/mL标准工作溶液（4.5）进样测定。6.3.3试样溶液的测定将待测试样净化液（6.2.2）溶液进样测定。6.3.4定性和阳性样品确认试样液相色谱图与标准物质色谱图比较，根据保留时间（见附录A）进行定性判定是否检出AFTB1。7.结果计算按以下公式计算测定结果。计算公式：X=cV1000m1000（1）式中：X试样中AFTB1的含量，单位为微克每千克（mg

9、/kg）；c进样溶液中AFTB1的浓度，按照标准溶液浓度乘于进样溶液与标准溶液峰面积比计算，或仪器软件自动计算，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V试样提取液体积，单位为毫升(mL)；m试样的称样量，单位为克（g）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，保留至小数点后两位。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。9检出限与定量限本文件AFTB1的检出限为0.04g/kg，AFTB1的定量限为0.1g/kg。10确证检测为保证检测结果的准确性，当检测结果为阳性时，应采用GB5009.22第一法进行测定确证。4T/CAQI239-2021附录A（资料性附录）黄曲霉毒素B1液相色谱图黄曲霉毒素B1柱后光化学衍生法检测色谱图见图A.1。图A.1黄曲霉毒素B1柱后光化学衍生法检测色谱图（1ng/mL标准溶液）5