紫外分光光度计测蛋白核酸及使用方法幻灯片.ppt

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1、紫外分光光度计测蛋白核酸及使用方法第1页，共23页，编辑于2022年，星期一2 2、实验原理、实验原理蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度呈正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。由于核酸在280nm波长也有光吸收，对蛋白质测量有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm。如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm的吸光度，才能通过计算测定溶液中的蛋白质浓度。第2页，共23页，编辑于2022年，星期一3 3、仪器与试剂

2、、仪器与试剂紫外可见光分光光计。未知蛋白质标准溶液，可用结晶牛血清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成12.5mg/mL 的溶液。0.9%NaCl溶液。第3页，共23页，编辑于2022年，星期一4 4、实验步骤、实验步骤在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得280nm和260nm两种波长的吸光度（A280和A260）。将A280及A260波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质弄高度C=1.45A280-0.74A260式中，C为蛋白质质量浓度（mg/ml）；本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂

3、的情况，这时用其他方法测定往往较困难。第4页，共23页，编辑于2022年，星期一5 5、实验记录及数据处理、实验记录及数据处理测定未知浓度蛋白质溶液的浓度第5页，共23页，编辑于2022年，星期一6 6、实验注意事项、实验注意事项（1）石英比色皿比较贵重，且易碎，使用时要小心。（2）测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面。第6页，共23页，编辑于2022年，星期一第7页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计测定核酸含量目的和要求目的和要求1、学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。2、掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法第8页，共23页，编辑于2022年，星期一实验原理实

4、验原理 DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处。紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的性质。用1cm光径的比色杯测定核酸的A260nm时，1ug/ml的DNA溶液吸光度为0.020，同样浓度的RNA吸光度为0.024.因此，可以用下列公式计算样品的核酸含量DNA浓度（ug/ml)=A 260/0.02RNA浓度（ug/ml)=A 260/0.024第9页，共23页，编辑于2022年，星期一实验器材实验器材紫外分光光度计实验材料及试剂实验材料及试剂RNA或DNA样品第10页，共23页，编辑于2022年，星期一实验步骤

5、实验步骤将样品配置成每毫升含550g的核酸溶液，于紫外分光光度计上测定260nm处的吸光度，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值：DNA浓度（ug/ml)=A 260/0.02RNA浓度（ug/ml)=A 260/0.024第11页，共23页，编辑于2022年，星期一实验记录及数据处理实验记录及数据处理测定未知浓度RNA溶液的浓度第12页，共23页，编辑于2022年，星期一第13页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计使用方法第14页，共23页，编辑于2022年，星期一认识 紫外分光光度计第15页，共23页，编辑于2022年，星期一认识 紫外分光光度计第16页，共23页，编辑于202

6、2年，星期一认识 紫外分光光度计第17页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计使用方法开机自检，预热第18页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计使用方法将对照及样品依次放入比色池中选择“光度测量”模式第19页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计使用方法输入测量所需的波长第20页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计使用方法比色池推到对照组对准光源，调100%透过率第21页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计使用方法比色池拉到样品组对准光源，测试。测量结果依次显示在屏幕上。记录数据。第22页，共23页，编辑于2022年，星期一紫外分光光度计使用方法切换波长，同样程序再测量其他波长处样品的光吸收值。第23页，共23页，编辑于2022年，星期一