第八章酶的非水相催化.pptx

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1、非 水 相 酶 催 化 反 应人类认识的进步长期以来，人们认为酶只能在水相中进行催化，而有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中催化反应建立起来的传统的酶学理论认为，有机溶剂是酶的变性剂、失活剂，酶在非水相中不具有催化能力20 世纪初，Bourquelot 等人将乙醇、丙酮等有机溶剂加入到酶的水溶液中，发现当含水量很高时，酶仍具有一定催化活力，但比水相中低很多1936 年，Sym（波兰）报道了酯酶在有机溶剂中的催化作用，但一直存在争议，未能引起科学界的重视第1页/共51页人类认识的进步Sym E.A.,Biochemical Journal,1936,30:609-617第2页/共51页 人类认识的

2、进步1966 年，Dostoli 和 Siegel 分别报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活力19751983 年间，Buckland 和 Martinek 等对游离酶和固定化酶在有机溶剂中合成类固醇及甾醇转化中的应用进行了大量的探索1977 年，Klibanov 等人报道了在水/氯仿两相体系中脂肪酶催化 N-乙酰-L-色氨酸与乙醇的酯化反应，在水中收率极低，而在两相体系中竟达到 100%1984 年，Zaks 和 Klibanov 在 Science 杂志上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的文章，他们指出，只要条件适合，酶可以在非水体系中表现出活性，并催

3、化天然或非天然的底物发生转化，这一报道引起了全球科学界的关注第3页/共51页引起全球关注的“非水相酶催化”的报道Porcine pancreatic lipase catalyzes the trans-esterification reaction between tributyrin and various primary and secondary alcohols in a 99 p e r c e n t o r g a n i c m e d i u m.U p o n f u r t h e r dehydration,the enzyme becomes extremely t

4、hermo-stable.Not only can the dry lipase withstand heating at 100 degrees C for many hours,but it exhibits a high catalytic activity at that temperature.Reduction in water content also alters the substrate specificity of the lipase:in c o n t r a s t t o i t s w e t c o u n t e r p a r t,t h e d r y

5、enzyme does not react with bulky tertiary alcohols.Zaks A.,and Klibanov A.M.,Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees C,Science,1984,224:1249-1251(DOI:10.1126/science.6729453)第4页/共51页人类认识的进步1984 年之后，非水相中的酶催化研究开始活跃起来。近年来，人们对非水介质中的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学等进行了大量研究，建立起非水酶学（non-aqueous enzymology）。

6、同时人们还对酶催化的介质进行了大量研究，开发出各种非水介质和新的酶促反应体系，发展出了介质工程（medium engineering），拓宽了酶催化反应的应用范围，使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的合成方法。第5页/共51页第一节 酶的非水相催化概论非水相酶催化的优势增加某些底物的溶解度改变反应平衡改变或提高酶的选择性第6页/共51页酶非水相催化的几种类型有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之

7、一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。功能。气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。中的催

8、化作用有明显的不同特点。第7页/共51页超临界介质中的酶催化超临界介质中的酶催化 酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。温度和压力超过某物质超临界点的流体。离子液介质中的酶催化离子液介质中的酶催化 酶在离子液中进行的催化作用。酶在离子液中进行的催化作用。离子液（离子液（ionic ionic liquidsliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。，挥发性低、稳定性好。

9、酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。立体选择性、键选择性等显著特点。第8页/共51页第二节 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响有机溶剂中酶分子存在形式固态酶：以固体形式存在于有机相中冷冻干燥的酶粉固定化酶结晶酶 今后的热点可溶解酶水溶性大分子共价修饰酶非共价修饰的高分子/酶复合物表面活性剂/酶复合物微乳液中的酶第9页/共51页微水介质体系（micro-aqueous media system）由有机溶剂和微量水组成的反应体系，即通常所说的有机介质体系大部分的微量水以酶分子的结合水形式存在，

10、对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要；另一部分水分配在有机溶剂中酶以固态的形式悬浮于有机介质中与水溶性有机溶剂组成的均一体系水/极性有机溶剂混溶体系，水和有机相的比例都很大，酶和底物以溶解的状态存在于此体系中强极性有机溶剂对酶的结构和活力影响较大，适用的酶较少例：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）在此类介质中能催化酚类或芳香胺的聚合常见有机介质反应体系 第10页/共51页与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系由水和疏水有机溶剂组成两相或多相体系游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底物或产物溶于有机相，固定化酶则悬浮于两相的界面；催化反应在两相界面进行胶束体

11、系正胶束体系（normal micelles system）水为主体，表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，酶在液相主体中，反应在胶束两相界面进行反胶束体系（reverse micelles system）有机溶剂为主体，表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，酶在反胶束内部的水相中，反应在胶束两相界面进行第11页/共51页常见的有机介质体系 胶束体系示意图第12页/共51页有机介质中水对酶催化反应的影响微水有机介质中水的分布和形态结合水与酶粉水合的结合水、固定载体和其他杂质的结合水自由水溶于有机溶剂中与酶结合的水量，以及水在酶分子中的位置是影响酶的活力、稳定性以及专一性的决定因素水对于酶催化活

12、性构象的获得与保持是必须的，但水也与许多酶的失活过程有关，即水对酶催化反应具有双重作用第13页/共51页水分子直接或间接地通过氢键、疏水键、范德华力等非共价相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象酶分子周围水的存在（水化层），能降低酶分子中极性氨基酸残基之间的相互作用，防止产生不正确的构象必需水（essential water）定义：维持酶分子完整的空间构象所必须的最低水量，通常是与酶分子紧密结合的一层左右的水分子，即水化层不同酶与必需水结合的紧密程度，以及所结合的必需水数量是不同的必需水是维持酶分子间次级键所必需的，是维持酶构象的“润滑剂”第14页/共51页水对酶催化反应速率的影响典型的非水酶

13、体系中水含量通常只占 0.01%，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变最适含水量：在酶催化反应速率达到最大时的水含量酶含水量 最适含水量，酶构象过于“柔性”，因变构而失活同一种酶，反应系统的最适含水量与有机溶剂的种类、酶的纯度、固定化酶的载体性质和修饰性质等因素有关第15页/共51页水活度（water activity）为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling 建议用“水活度”描述有机介质中酶催化活力与水的关系水活度（Aw）体系中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比，近似等于体系中水的蒸气压与相同条件下纯水的蒸气压之比最适含水量与溶剂极性成正比，而最佳水活度与溶剂极性大小无关，故

14、采用水活度作参数更确切Aw 值较小有机溶剂中键合到酶上的水量与在空气中键合到酶上的水量非常相似，表明有机溶剂没有直接影响水与酶紧密结合Aw 值较大有机溶剂使酶结合的水量减少（溶剂与键合位点的水分子发生直接竞争）第16页/共51页有机溶剂对酶催化反应的影响有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用，直接或间接影响酶的活性和稳定性有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用(1)有机溶剂与酶直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活(2)有机溶剂和能扩散的底物/反应产物相互作用，影响正常反应的进行(3)有机溶剂直接和酶分子周围的水相互作用第17页/共51页对酶分子表

15、面结构的影响酶分子与溶剂的直接接触，其表面结构发生不可忽视的变化例：枯草杆菌蛋白酶在乙腈中，有 12 个乙腈分子结合到酶分子中，其中有 4 个是原来水分子结合的位点对酶活性中心结合位点的影响减少整个活性中心的数量，活性中心数目丧失的多少取决于溶剂的疏水性强弱溶剂分子能渗透入酶的活性中心，与底物竞争酶活性中心的结合位点，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力例：甲醇可进入辣根过氧化物酶的活性中心，与铁卟啉配位结合第18页/共51页对酶活性的影响溶剂极性与酶活力的关系溶剂对底物和产物分配的影响酶的“必需水”层是底物、产物分布的中介有机溶剂能改变酶分子“必需水”层中底物或产物的浓度有机溶剂极性小

16、，疏水性强，疏水性底物难于进入“必需水”层有机溶剂极性强，亲水性强，疏水性底物在有机溶剂中溶解度太低第19页/共51页底物专一性有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变，致使酶的底物特异性发生改变解释：疏水性的相对强弱第三节 酶在有机介质中的催化特性第20页/共51页不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物易反应极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物易反应第21页/共51页对映体选择性对映体选择性（enantioselectivity）是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水性强的有机

17、介质中对映体选择性较差第22页/共51页区域选择性区域选择性（regioselectivity），即酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应化学键选择性键选择性（chemoselectivity），即同一个底物分子中有两种以上化学键可与酶反应，酶对其中一种优先反应键选择性的意义：可在不需要基团保护的情况下对特定部位的基团进行衍生化第23页/共51页热稳定性许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的好部分酶在有机介质中能耐受高热有机溶剂中酶的热稳定性还与介质中水含量有关水含量高，稳定性低第24页/共51页pH 特性“pH 记忆”（pH imprinting）现象在有机介质中，酶所处

18、的 pH 环境与酶在冻干、溶剂沉淀或吸附到载体上之前所使用的缓冲液的 pH 相同，也称“pH 印迹”原因“必需水”在有机溶剂中酶分子表面的“必需水”只要在特定的 pH 和离子强度下，酶分子活性中心周围的基因才能处于最佳的离子化状态，当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在有机介质中第25页/共51页第四节 有机介质中酶催化反应的条件及其控制 酶的选择依据酶活力高低 反应速率和反应时间酶的稳定性 可重复使用的次数酶催化的选择性 产物中某种异构体的产率和纯度底物的选择和浓度控制底物的极性与溶解度底物专一性的变化底物的可接近程度 底物在溶剂与“必需水”中的分配情况底物的抑制情况

19、第26页/共51页有机溶剂的选择溶剂极性判据 介电常数（）疏水性参数（lgP）溶剂极性应适中与水混溶的有机介质含量第27页/共51页含水量的控制水活度的控制：向干燥的反应器中直接加入某种高水合盐可获得恒定的水活度原理高水合盐在初始阶段释放结合水到体系中，供给酶必需水，本身变为低水合盐反应后期，此低水合盐结合反应产生的水变为高水合盐，保持了体系的水活度第28页/共51页温度的控制温度升高，最适温度变化？温度升高，立体选择性变化？pH 和离子强度的控制最适 pH 值酶在冷冻干燥过程中，pH 状态发生变化 冷冻干燥保护剂在酶液冻干之前或催化过程采取保护措施，可加有机相缓冲液调节反应时的 pH 值第2

20、9页/共51页有机介质酶催化反应的优点水分子含量少，酶分子的构象更具有“刚性”引起酶变性的很多因素，与水的存在有关，有机溶剂可增加稳定性降低了有水参加的副反应省略产物分离萃取过程，提高收率第30页/共51页第五节 酶非水相催化的应用常见部分酶在非水相催化中的应用酶酶催化的反应催化的反应应应 用用脂肪酶脂肪酶肽键的生成肽键的生成青霉素青霉素 G 前体肽合成前体肽合成酯合成、转酯化酯合成、转酯化各种酯类化合物的生产各种酯类化合物的生产聚合聚合二酯的选择性聚合二酯的选择性聚合酰基化酰基化甘醇的酰基化甘醇的酰基化水解水解植物油脱胶（去除磷脂）植物油脱胶（去除磷脂）氨解氨解苯甘氨酸甲酯的拆分苯甘氨酸甲酯

21、的拆分蛋白酶蛋白酶肽合成肽合成合成多肽合成多肽酰基化酰基化糖类酰基化糖类酰基化羟基化酶羟基化酶氧化氧化甾体药物生物转化甾体药物生物转化过氧化物酶过氧化物酶聚合聚合酚类、胺类化合物的聚合酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶多酚氧化酶氧化氧化芳香族化合物的羟基化芳香族化合物的羟基化醇脱氢酶醇脱氢酶酯化酯化有机硅醇的酯化有机硅醇的酯化第31页/共51页手性技术领域 手性药物 手性（手性（chirality）化合物，是指化学组成化合物，是指化学组成相同，而其立体结构互相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体为对映体的两种异构体化合物。化合物。手性药物，是指只手性药物，是指只含单一对映体的药物。含单一对映体

22、的药物。第32页/共51页手性药物对映体的药效差异对映体对映体 A对映体对映体 B实实 例例疗效显著疗效显著疗效很弱或无效疗效很弱或无效S-(+)-neproxen（萘普生）的疗效是（萘普生）的疗效是 R-(-)-neproxen 的的28倍倍具有疗效具有疗效毒副作用毒副作用R-thalidomide（反应停）具有镇静作用；而（反应停）具有镇静作用；而 S-thalidomide 却能导致婴儿畸胎却能导致婴儿畸胎具有药效具有药效 A具有相反药效具有相反药效 A5-(二甲丁基二甲丁基)-5-乙基巴比妥左旋体乙基巴比妥左旋体对神经系统对神经系统有镇静作用；而其有镇静作用；而其右旋体右旋体却有兴奋作

23、用，但比却有兴奋作用，但比左旋体的镇静作用弱得多左旋体的镇静作用弱得多具有药效具有药效 A具有药效具有药效 B（与（与A无关）无关）S-trtoquinol（喘速宁）具有扩张支气管的药效；（喘速宁）具有扩张支气管的药效；而而 R-trtoquinol 具有抑制血小板凝集的作用具有抑制血小板凝集的作用具有药效具有药效 A具有互补性药效具有互补性药效 AS-propranolol（心得安）（心得安）具有阻断具有阻断 -受体的作受体的作用，而用，而 R-propranolol 具有抑制具有抑制 Na+通道的作通道的作用，因此外消旋体用药效果更好用，因此外消旋体用药效果更好第33页/共51页1960

24、年代“反应停”事件 反应停是抗妊娠反应的镇静药沙利度胺的俗反应停是抗妊娠反应的镇静药沙利度胺的俗称。孕妇在怀孕一二个月之间，服用了反应停的称。孕妇在怀孕一二个月之间，服用了反应停的母亲生出畸形儿。这种婴儿手脚比正常人短，甚母亲生出畸形儿。这种婴儿手脚比正常人短，甚至根本没有手脚。截至至根本没有手脚。截至 1963 年，在世界各地由年，在世界各地由于服用该药物而诞生了于服用该药物而诞生了 12000 多名畸形婴儿。这多名畸形婴儿。这种药物的种药物的(R)-构型是安全有效的，而构型是安全有效的，而(S)-构型被构型被妊娠妇女服用后却能造成短肢畸胎。妊娠妇女服用后却能造成短肢畸胎。第34页/共51页

25、例1：环氧丙醇衍生物的酶法拆分重要的 C3 手性合成中间体，用于合成 -受体阻断剂类药物、HIV 蛋白酶抑制剂、抗病毒药物等采用猪胰脂肪酶（PPL）在有机溶剂中进行拆分第35页/共51页例2：布洛芬（ibuprofen）的酶法拆分采用脂肪酶，在 80%异辛烷与 20%甲苯组成的混合溶剂中，可以得到较高 e.e.值的(S)-布洛芬添加少量极性溶剂如 DMF，e.e.值可提高至 91%第36页/共51页手性聚合物制备手性聚合物，亦称“旋光性聚合物(optically active polymer)”，其分子中存在构型或构象上的不对称结构，因此具有旋光性质聚合物旋光性的来源手性单体聚合得到：如 氨基

26、酸 蛋白质聚合物分子的手性构象：如 DNA 双螺旋手性聚合物具有特殊的光、电、磁性等特征，可作为特殊的功能性材料使用采用脂肪酶可在有机介质中通过转酯化反应合成手性聚合物第37页/共51页可降解高分子可降解高分子是指在一定条件下，能被生物体侵蚀或代谢而降解的聚合物材料可降解高分子用途广泛领域领域应应 用用领域领域应应 用用医疗医疗外科手术缝合线外科手术缝合线伤口涂料伤口涂料人造血管制品人造血管制品药物缓释控释体系药物缓释控释体系骨骼替代品和固定物骨骼替代品和固定物工业工业无污染、可降解包装材料无污染、可降解包装材料除锈剂、抗菌剂载体除锈剂、抗菌剂载体农业农业可降解农用薄膜可降解农用薄膜肥料、杀虫

27、剂、除草剂控释材肥料、杀虫剂、除草剂控释材料料第38页/共51页可降解高分子内酯的开环聚合第39页/共51页可降解高分子聚糖酯的合成第40页/共51页光电功能材料辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP，）HRP 是一种糖蛋白，在辣根中该酶的含量很高，故名HRP 以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物生成自由基，并引发自由基聚合第41页/共51页光电功能材料HRP 催化酚的聚合自由基聚合阶段自由基聚合阶段自由基链传递阶段自由基链传递阶段第42页/共51页光电功能材料发光聚合物 聚对苯基苯酚的合成 酶法合成的聚酚具有较高酶法合成的聚酚具有较高的三阶

28、非线性光学系数的三阶非线性光学系数 X(3)，是重要的非线性光学材料。是重要的非线性光学材料。第43页/共51页光电功能材料导电聚合物 聚酚胺的合成酶法合成的聚酚胺类物质具有 电子共轭结构，通过掺杂表现出一定的导电性HRP 能够以过氧化氢为电子受体，专一地催化氨基酚类物质的过氧化反应，并引发聚合第44页/共51页食品添加剂生产食品乳化剂甘油单酯的生产食用香料香兰素的合成第45页/共51页食品添加剂生产甜味剂阿斯巴甜（AsPartame）的合成“阿斯巴甜”即 L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，是人造甜味剂，甜度是蔗糖的 150200 倍主要添加于饮料、维他命含片或口香糖，代替糖的使用；许多糖尿病患

29、者、减肥人士都以阿斯巴甜做为糖的代用品由嗜热蛋白酶催化 L-苯丙氨酸甲酯与 L-天冬氨酸缩合产生第46页/共51页甾体药物转化甾体药物的一般结构第47页/共51页甾体药物转化甾体药物在水中溶解度小，在水相中的转化率很低，采用有机相催化可以大大提高转化率例：可的松（cortisone）转化为氢化可的松（hydrocortisone）11-羟化酶：又称细胞色素 P450 11B1，催化甾体母核 11 位上的 -羟基化反应第48页/共51页生物柴油生产柴油（diesel）：石油提炼后的一种油质的产物，主要成分是含 C10C22 的脂肪烷烃烷、环烷烃或芳烃生物柴油（biodiesel）：由动物、植物或

30、微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯生物柴油的生产即甘油酯的醇解反应，一般利用废弃的动、植物油生产生物柴油第49页/共51页生物柴油生产生物柴油的优点可使用于任何柴油机，热值高，燃点高，使用安全可生物降解，无毒性，对环境无害，并可以从可再生资源中提取使用生物柴油可降低 90%的空气毒性，患癌率可降低 94%在所有的燃油中，生物柴油的能量衡算最高：在生产生物柴油的过程中，每消耗一个单位的矿物能量就能获得 3.2 个单位的能量使用中存在的问题成本偏高，比普通柴油高出 1530%燃烧残留物具有微酸性，且残留的甲醇与甘油对发动机寿命存在潜在影响第50页/共51页感谢您的观看！第51页/共51页