血液细胞组织化学幻灯片幻灯片.ppt

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1、血液细胞组织化学幻灯片第1页，共64页，编辑于2022年，星期三概述 l细胞化学染色是在组织化学的基础上发展细胞化学染色是在组织化学的基础上发展起来的一个学科分支，是细胞学与化学相结起来的一个学科分支，是细胞学与化学相结合而形成的一门科学，研究细胞的化学成分，合而形成的一门科学，研究细胞的化学成分，在保存血液细胞形态的基础上，在细胞原位在保存血液细胞形态的基础上，在细胞原位显示化学反应的结果，根据化学反应的原理，显示化学反应的结果，根据化学反应的原理，研究细胞成分的化学性质。研究细胞成分的化学性质。第2页，共64页，编辑于2022年，星期三研究目的及临床应用 l研究正常血液细胞的活动与生理功能

2、l提高血液病的诊断和鉴别诊断水平确定急性白血病的类型有助于某些血液病的鉴别诊断观察疗效和估计预后l探索某些血液病的发病原理及治疗机制 第3页，共64页，编辑于2022年，星期三标本的选择lBM片、血片、淋巴结印片、脾印片等均可作组化染色。l用于酶染色的标本应尽可能新鲜。l用于非酶染色的标本可在室温下放置1个月，如PAS标本。第4页，共64页，编辑于2022年，星期三固定的目的及方法l l目的保持细胞生前的结构与化学成分，并使血膜在染色、冲洗过程中不易脱落损坏。l l常用化学固定方法常用化学固定方法甲甲醛醛蒸蒸汽汽固固定定：将滤纸平铺于染色缸底部，加入少许40%甲醛溶液。将涂片标本放入缸内，加盖

3、使甲醛蒸汽固定血膜5-105-10分钟，水洗后晾干。液体固定液体固定：常用的固定液为乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用两种或两种以上成分组成混合固定液。第5页，共64页，编辑于2022年，星期三显示方法l l纯化学方法金属沉淀法 偶氮偶联法偶氮偶联法联苯胺色素法 Schiff反应 普鲁士蓝反应普鲁士蓝反应l l类化学方法l l 物理学方法第6页，共64页，编辑于2022年，星期三复染方法 l复染是细胞内化学成分显色后，为了便于观察而进行的对比染色方法。细 胞 核 复 染 法：常 用 染 料 为 苏 木 精、甲 基 绿、核固红、沙黄等。细胞浆复染法：常用染料为伊红、光绿等第7页，共64页，编辑于2

4、022年，星期三过氧化物酶染色（Peroxidase stain,POX）第8页，共64页，编辑于2022年，星期三目的 l急性白血病的鉴别诊断 AML：阳性 ALL：阴性 第9页，共64页，编辑于2022年，星期三分布特点-1l l原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。反应。l l中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏强度递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。丹黑颗粒相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。l l 嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比

5、中性粒细胞的嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比中性粒细胞的 大，着色深。大，着色深。大，着色深。大，着色深。l l嗜碱粒细胞：阴性反应，在嗜碱粒细胞：阴性反应，在CML时可出现阳性时可出现阳性反应。反应。第10页，共64页，编辑于2022年，星期三分布特点-2l在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和增多与特殊颗粒增多与特殊颗粒 的出现和增多有平行关系。的出现和增多有平行关系。l单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核细胞呈弱阳性反应。阳性颗粒少而细小，弥细胞呈弱阳性反应。阳性颗粒少而细小，弥散分布，有的也可呈阴性反应。散分布，

6、有的也可呈阴性反应。l其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。有的吞噬细胞可呈阳性反应有的吞噬细胞可呈阳性反应 第11页，共64页，编辑于2022年，星期三第12页，共64页，编辑于2022年，星期三试剂配制l0.3%联苯胺酒精溶液：联苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亚硝 基铁氰化钠饱和水溶液1ml。可保存1-2年。l过氧化氢溶液配制：3%过氧化氢1滴+蒸馏水5ml，须每次用时新鲜配制。第13页，共64页，编辑于2022年，星期三染色步骤 l于新鲜涂片上滴加复方联苯胺染液38

7、滴，使涂片盖满。l12分钟后加入等量过氧化氢溶液。l48分钟后用水冲洗，空气中晾干。l用瑞氏染液复染，凉干后油镜观察。第14页，共64页，编辑于2022年，星期三染色原理 l粒细胞及部分单核细胞胞浆内的颗粒中含有过氧化物酶，该酶能分解过氧化氢，释放出新生态的氧。从而使无色的联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝。l联苯胺蓝是一种不稳定的中间产物，它可进一步氧化变成棕色的化合物 第15页，共64页，编辑于2022年，星期三结果判断 l阳性反应为蓝色或蓝棕色颗粒，定位于胞浆中。第16页，共64页，编辑于2022年，星期三临床意义 l lALL时，原始细胞的POX阳性小于阳性小于3%。l lAML时，原始细胞的

8、阳性3%3%。l l在多数的M1M1、绝大部分M2M2和和M3中，原始细胞的阳性中，原始细胞的阳性率大于率大于85%85%。M4M4和和M5时，原单有时可呈弱阳性，但绝大多数的原单是POXPOX阴性。M6，原粒和幼稚粒细胞是POXPOX阳性，幼红细胞是阳性，幼红细胞是POX阴性。在阴性。在M7M7，血小板POXPOX的活性只能在超微结构上证实。l lMDSMDS时，粒细胞白血病和感染所致的WBCWBC增高时，成熟中性粒细胞的POXPOX活性可能降低或消失。l lCML时，成熟中性粒细胞的POXPOX活性增强。活性增强。第17页，共64页，编辑于2022年，星期三注意事项 l已固定的血膜因为酶已

9、破坏不能再作过氧化物酶染色。l所用过氧化氢必须新鲜，加于血膜上应能发生泡沫。过量时红细胞可出现假阳性。l过氧化氢的浓度要适当加减，过量则颗粒色深，不足则颗粒色淡。l滴加过氧化氢液之后，最好将染片置于载物台上，用低倍镜观察，发现胞浆出现阳性颗粒时，立即水洗。第18页，共64页，编辑于2022年，星期三第19页，共64页，编辑于2022年，星期三糖原染色（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）第20页，共64页，编辑于2022年，星期三目的 l红白血病（+）与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断lMDS与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断l单 核 细 胞 白 血 病（+）与 组 织

10、 细 胞 病（MH）的鉴别诊断l淋巴肉瘤、何杰金病与急性淋巴细胞白血病的鉴别诊断l高歇病与尼曼-匹克病的鉴别诊断以上都是前者增高，后者降低或阴性。第21页，共64页，编辑于2022年，星期三试剂-1l l10g/L10g/L过碘酸液l lSchiff染液：染液：碱性品红0.5g0.5gDH2O100mlDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品红溶解，冷至红溶解，冷至50加入1M1M的盐酸20ml，混匀。待冷却至25加入偏重亚硫酸钠加入偏重亚硫酸钠0.5g，混合，置于带塞的棕色瓶中，放于暗处24小时。染液为无色，如为微红则加活

11、性炭1 12g2g，混合过滤，如过滤液仍有红色，应再加少许活性炭，至红色完全被吸收为止。制成后置于棕色瓶内保存在冰箱备用，如变为红色，则不能使用。第22页，共64页，编辑于2022年，星期三试剂-2 l l苏木素液：苏木素液：苏木素苏木素0.9g9595乙醇乙醇10ml10ml铵（钾）明矾20gDH2 2O200mlO200ml将苏木素溶于95的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞汞0.5g，迅速搅拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日，迅速搅拌，呈深紫色，迅速移入冷水中

12、，次日过滤，临用时取此液过滤，临用时取此液95ml加冰醋酸5ml5ml，可使细胞着色，可使细胞着色清楚。清楚。第23页，共64页，编辑于2022年，星期三染色步骤 l将新鲜血片或骨髓片用95乙醇固定10分钟。l10g/L过碘酸液作用20分钟lDH2O洗涤1分钟，晾干lSchiff染液，60分钟l用自来水洗涤15分钟（细水长流冲洗）l苏木素染液10分钟。l自来水冲洗15分钟，待干镜检。第24页，共64页，编辑于2022年，星期三染色原理 l过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，呈红色，定位于胞浆上。第25页，共64页，编辑于2022年，星期三结果判断 l

13、l正正常常BMBM：有核红细胞几乎均呈阴性反应，在AMLAMLM6M6，幼红细胞为，幼红细胞为PASPAS强阳性。l l中性粒细胞：原粒细胞多为阴性，早幼粒阶段开始呈PASPAS阳性，其后各阶段阳性逐渐增强。l l巨巨核核细细胞胞和和血血小小板板：不不含含糖糖原原，但但含含粘粘多多糖糖等等，故故巨巨核核细胞为细小弥散的阳性，细胞为细小弥散的阳性，PLT为粉红色。为粉红色。l lALLALL：可以是密集粗块状的颗粒，也能是细小弥散的颗粒，或是这两种颗粒的混合。ALL的PASPAS也可能为阴性，特别是L3L3时。l l单核细胞白血病，原单细胞常为阴性，幼单和成熟单，原单细胞常为阴性，幼单和成熟单可

14、有弱阳性或弥散阳性。可有弱阳性或弥散阳性。第26页，共64页，编辑于2022年，星期三注意事项 l1）Schiff液变红不能再用。l2）碱性品红的质量很重要，如碱性品红不合格，加活性炭，颜色也不被吸附。l如无苏木精复染液，可用1%甲绿复染25分替代。第27页，共64页，编辑于2022年，星期三第28页，共64页，编辑于2022年，星期三第29页，共64页，编辑于2022年，星期三第30页，共64页，编辑于2022年，星期三非特异性酯酶染色第31页，共64页，编辑于2022年，星期三原理原理 l非特异性酯酶是作用于短链脂肪的酶，当酯酶活性存在时，水解基质中的醋酸萘酚，与重氮盐偶联，生成不溶性的有

15、机产物，定位于胞浆上。第32页，共64页，编辑于2022年，星期三试剂试剂l甲醛：l基质液：1/15M的磷酸缓冲液 PH7.4 40mll10g/L 醋酸萘酚50丙酮液 0.8ml 重氮盐（Diazo blue B）40mg第33页，共64页，编辑于2022年，星期三方法方法 l新鲜涂片用甲醛蒸汽固定新鲜涂片用甲醛蒸汽固定5分钟。分钟。l流水冲洗流水冲洗5分钟，晾干。分钟，晾干。l置于基质液中置于基质液中371小时，水洗泡小时，水洗泡10分钟。分钟。l20g/L甲绿复染甲绿复染2030分钟。分钟。l水洗，晾干，镜检。水洗，晾干，镜检。第34页，共64页，编辑于2022年，星期三临床意义临床意义

16、 l单核细胞系统呈阳性，伴随着细胞的成熟而加强，对AL有鉴别诊断作用。第35页，共64页，编辑于2022年，星期三非特异性酯酶-氟化钠抑制试验 l同非特异性酯酶，只是在同非特异性酯酶，只是在1ml作用液中，加作用液中，加入入1.5mg 氟化钠，即可抑制单核细胞的酯氟化钠，即可抑制单核细胞的酯酶，故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。酶，故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。第36页，共64页，编辑于2022年，星期三第37页，共64页，编辑于2022年，星期三第38页，共64页，编辑于2022年，星期三第39页，共64页，编辑于2022年，星期三急性白血病中的组化染色 白血病白血病白血病白血病 P

17、OX NSE PASPOX NSE PASALL ALL +AML AML M0 M0 +M1 M1 +(3(3原始细胞原始细胞原始细胞原始细胞)M2M2 +M3 M3 +M4M4 +（原单细胞）（原单细胞）（原单细胞）（原单细胞）M5M5 /+/+/+/+M6M6 +（原粒细胞）（原粒细胞）（原粒细胞）（原粒细胞）+（幼红细胞）（幼红细胞）（幼红细胞）（幼红细胞）M7M7 +第40页，共64页，编辑于2022年，星期三中性粒细胞碱性磷酸酶染色（AKP）第41页，共64页，编辑于2022年，星期三目的l鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应l鉴别淋巴肉瘤（高）

18、和何杰金病鉴别淋巴肉瘤（高）和何杰金病l鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染 第42页，共64页，编辑于2022年，星期三分布 l血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的中性粒细胞，定位于胞浆中。中性粒细胞，定位于胞浆中。第43页，共64页，编辑于2022年，星期三原理 l细胞中的细胞中的AKP在在PH9.59.6缓冲液中能使基缓冲液中能使基质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者与一种稳定的重氮盐（常用有固紫与一种稳定的重氮盐（常用有固紫Fast-Garnet，GBC或固蓝或固蓝RR）偶联，生

19、成不溶）偶联，生成不溶性的偶氮染料，沉积于细胞上。性的偶氮染料，沉积于细胞上。第44页，共64页，编辑于2022年，星期三试剂 l l95%95%乙醇乙醇l l固酱紫固酱紫固酱紫固酱紫GBCGBCl lAS-BIAS-BI磷酸萘酚磷酸萘酚磷酸萘酚磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml12.5mg+DH2O100mll l0.2M tris缓缓冲冲液液：三三羟羟甲甲基基氨氨基基甲甲烷烷2.43g+DH2O2.43g+DH2O溶溶溶溶至至至至100ml100ml。l l0.05M 0.05M tris tris 缓缓冲冲液液（PH8.6-9.0）：0.2 M tris 缓缓冲冲液液25ml+0.

20、1M HCL 49ml25ml+0.1M HCL 49mll l贮贮存存液液：50ml 50ml AS-BIAS-BI磷磷磷磷酸酸酸酸萘萘萘萘酚酚酚酚+PH8.8 0.05Mtris缓缓冲冲液液50ml混匀，冰箱保存混匀，冰箱保存混匀，冰箱保存混匀，冰箱保存l l1%1%甲基绿甲基绿 第45页，共64页，编辑于2022年，星期三染色步骤 新鲜新鲜BM片及血片待干片及血片待干l95%乙醇固定乙醇固定10分钟分钟l固固酱酱紫紫1mg+2ml贮贮存存液液混混匀匀，立立即即滴滴加加数数滴滴在在血血片片或或BM片片上上，置置37孵孵箱箱孵孵育育30分分钟钟l用蒸馏水快冲用蒸馏水快冲 l放入放入1%甲绿中

21、复染甲绿中复染5分钟分钟l用蒸馏水快冲，待干，镜检用蒸馏水快冲，待干，镜检 第46页，共64页，编辑于2022年，星期三结果判断 l l 阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆 内。内。l l 计数方法，按碱酶活性强弱，分为计数方法，按碱酶活性强弱，分为0-4+共共5级。级。分数分数 特点特点 0 0 胞浆内无红色的颗粒胞浆内无红色的颗粒胞浆内无红色的颗粒胞浆内无红色的颗粒 1 弥散的红色，偶见颗粒弥散的红色，偶见颗粒弥散的红色，偶见颗粒弥散的红色，偶见颗粒 2 弥散的红色

22、，有中等量的颗粒弥散的红色，有中等量的颗粒 3 3 显著的红色，有较多的颗粒显著的红色，有较多的颗粒显著的红色，有较多的颗粒显著的红色，有较多的颗粒 4 4 显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒第47页，共64页，编辑于2022年，星期三计算积分分数分数 细胞数目细胞数目 积分积分 0 20 0 1 45 45 2 25 50 3 5 15 4 5 20总数总数 100 130=LAP积分积分 第48页，共64页，编辑于2022年，星期三临床意义临床意义 l l正正常常的的LAPLAP积积积积分分分分是是是是2020100100分分，但但因因为为计计数数的的主主观观

23、性性，很重要的是建立每个实验室自己的正常值。很重要的是建立每个实验室自己的正常值。临床诊断临床诊断 积分积分 正常正常正常正常 20100 CML 1313 类白血病类白血病类白血病类白血病 100100 真红真红 100100200 继发性红细胞增多继发性红细胞增多 1010100 第49页，共64页，编辑于2022年，星期三第50页，共64页，编辑于2022年，星期三铁粒染色铁粒染色第51页，共64页，编辑于2022年，星期三原理原理 l骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而

24、游离出来，不牢，经稀盐酸处理后而游离出来，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的含量。含量。第52页，共64页，编辑于2022年，星期三试剂试剂 l l酸性亚铁氰化钾溶液：酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液 5 5份份 浓盐酸浓盐酸浓盐酸浓盐酸 1 1份份 取取200g/L200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀

25、，再滴加盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加200g/L200g/L亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备用。止，备用。止，备用。止，备用。l l2g/L核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝10g10g加入加入加入加入100ml DH2O100ml DH2O再加入核固红再加入核固红再加入核固红再加入核固红EMER出品出品 0.2g0.2g，置于，置于，置于，置于3737水浴中水浴中1小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。小时，并经常振荡，

26、使溶解，过滤后使用。小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。第53页，共64页，编辑于2022年，星期三方法方法l选骨髓小粒丰富的骨髓涂片l玻片上滴加酸性亚铁氰化钾，染色30分钟。（可置于37）l用DH2O冲洗后用核固红染液复染1015分钟。l流水冲洗，晾干，油镜检查。第54页，共64页，编辑于2022年，星期三结果结果 l正常人细胞外铁：幼红细胞呈鲜红色，胞浆成淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。细胞外铁的判断用低倍镜观察涂片，特别时涂片尾部和骨髓小粒附近。第55页，共64页，编辑于2022年，星期三细胞外铁判断标准l无颗粒l有少数铁颗粒或偶见铁小珠l有较多的铁颗粒和

27、小珠l有很多的铁颗粒，小珠和少数小块状l有极多的铁颗粒，小珠并有很多的小块，密集成堆第56页，共64页，编辑于2022年，星期三第57页，共64页，编辑于2022年，星期三铁粒幼红细胞的分型l1型仅含一个铁颗粒l2型含25个铁颗粒l3型含69个铁颗粒l4型含10个以上的铁颗粒第58页，共64页，编辑于2022年，星期三第59页，共64页，编辑于2022年，星期三环形铁粒幼细胞 l含铁颗粒6个以上，其中2/3以上的铁颗粒围绕核周围排列成完全环形或不完全环形（围绕核周围指分布紧靠着细胞核或靠近细胞核的1/3胞浆内，铁颗粒增多时，可分布于外2/3的胞浆内。第60页，共64页，编辑于2022年，星期三

28、第61页，共64页，编辑于2022年，星期三临床意义临床意义 lIDA：骨骨髓髓细细胞胞外外铁铁和和内内铁铁显显著著减减少少或或消消失失，铁铁粒粒幼幼红红细细胞胞阳阳性性率率为为016，铁铁颗颗粒粒极极少少并并着着色色浅浅，以以1型型为为主主，2型型者者极极少少，3型型以以上上者者不不见见。经经铁铁剂剂治治疗疗后后细细胞胞外外铁铁和和内内铁铁可可迅迅速速增增多多，因因此此是是诊诊断断IDA和和指指导导铁铁剂剂治治疗的一种辅助方法。疗的一种辅助方法。第62页，共64页，编辑于2022年，星期三l l是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现数是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现数量不等的环状铁

29、粒幼红细胞，并且多见粗颗粒的量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见粗颗粒的3型和型和4型铁粒幼红细胞。型铁粒幼红细胞。第63页，共64页，编辑于2022年，星期三注意事项注意事项 l玻玻片片必必须须经经无无铁铁处处理理：将将新新玻玻片片经经清清洁洁液液浸浸泡泡24小小时时，取取出出后后反反复复水水洗洗浸浸入入95酒酒精精24小小时时，晾晾干干，再再浸浸泡泡在在5盐盐酸酸中中24小小时时，用用D2H2O反复洗玻片，取出烤干后备用。反复洗玻片，取出烤干后备用。l酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。l最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并作细胞外铁观察。作细胞外铁观察。第64页，共64页，编辑于2022年，星期三