细菌内毒素检查.pptx

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1、实验原理实验原理利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。定的一种方法。阳性结果阳性结果v细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。第1页/共30页实验试剂实验试剂鲎试剂鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。第2页/共30页实

2、验试剂实验试剂细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品 系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。细菌内毒素工作标准品细菌内毒素工作标准品 系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水 指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。第3页/共30页试验器具试验器具 刻度吸管、凝集管（1075mm）、三角瓶、小试管（16100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉

3、、吸水纸、剪刀砂轮。耐热器皿常用干热灭菌法（250、30 分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热原的一次性用品）。第4页/共30页检查方法概述检查方法概述凝胶法凝胶法 限量试验 半定量试验光度测定法光度测定法 浊度法（终点浊度法和动态浊度法）显色基质法（终点显色法和动态显色法）凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法 对干扰相对不敏感。较光度测定法不灵敏第5页/共30页供试品溶液的制备供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。溶液。一般要求供试品溶液

4、的一般要求供试品溶液的pH 值在值在6.08.0 的范围内。的范围内。可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。值。第6页/共30页内毒素限值的确定内毒素限值的确定一般按公式：L=K/M 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示。K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂K=5EU/（kgh），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kgh），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kgh）。M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品使用说明书，临床用药须知确定。例：例：某产品M为14.3mg/kg，L=

5、5/14.3=0.35EU/mg 假如此产品的浓度为100mg/ml，那么，L=0.35100=35EU/ml第7页/共30页最大有效稀释倍数的确定最大有效稀释倍数的确定 最大有效稀释倍数（最大有效稀释倍数（MVD）指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD=cL/式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU/ml 表示时，则c 等于1.0ml/ml，当L以EU/mg 或EU/U 表示时，c 的单位需为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L；

6、为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。第8页/共30页鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核目的目的 考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。细菌内毒素标准溶液的准备细菌内毒素标准溶液的准备 1、取细菌内毒素工作标准品（或国家标准品）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。第9页/共30页鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核 2、按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，

7、用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即 2、0.5和0.25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度）四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 秒钟。v示例 某待复核鲎试剂的灵敏度标示值为0.25EU/ml，细菌内毒素工作标准品规格为150 EU/ml，将细菌内毒素工作标准品用1ml细菌内毒素检查用水溶解，再稀释制备成浓度为0.50 EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml和0.06EU/ml的细菌内毒素标准溶液。第10页/共30页鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核细菌内毒素标准溶液的制备图示：细菌内毒素标准溶

8、液的制备图示：第11页/共30页鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核待复核鲎试剂的准备待复核鲎试剂的准备 取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，每支加入0.1ml检查用水使溶解备用（规格大于 0.1ml支的鲎试剂，按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按0.1ml/管分装到凝聚管中，至少准备18管）。加样加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。其中4支4列分别加入0.1ml的2、0.5和0.25的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。第12页/共30页鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻

9、轻振动混匀，垂直放入371恒温器中，保温602分钟。结果观察结果观察 将试管轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。阳性阴性第13页/共30页鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核计算计算 当最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果。c=lg-1（X/4）式中 X 为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。第14页/共30页鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核

10、例子：例子：结果判断结果判断 当c 在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。第15页/共30页干扰实验干扰实验 目的目的 确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须

11、进行干扰试验。任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验。第16页/共30页干扰实验干扰实验进行干扰试验一般步骤进行干扰试验一般步骤 供试品限值确定供试品限值确定 根据鲎试剂的灵敏度确定根据鲎试剂的灵敏度确定MVD范围范围（供试品溶液浓度范围）预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度 正式干扰试验正式干扰试验干扰实验预实验干扰实验预实验 目的目的 初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据,避免干扰试验的盲目性。第17页/共30页干扰实验干扰实验操作

12、方法操作方法 1、将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD=CL/0.03（0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。2、使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2浓度）。另取2支细菌内毒素检查用水作阴性对照，2支加入2浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。例 制备稀释倍数为4的供试品阳性对照溶液：0.3ml4.0EU/ml的内毒素标准液+0.3ml稀释倍数为2的供试品稀释液0.6ml含2EU/ml内毒素标准液的稀释倍数为4的供试品稀释液 3、保温602分钟，观察并

13、记录结果。第18页/共30页干扰实验干扰实验 4、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。5、当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释倍数（不得超过MVD=CL/0.03），或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。6、当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最

14、大不干扰浓度（即稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或活性单位/ml表示。第19页/共30页干扰实验干扰实验举例举例 某注射液限值为2.5EU/ml，按MVDCL/计算出灵敏度为0.03EU/ml下的MVD为83倍，将供试品溶液进行一系列稀释，用灵敏度为0.25 EU/ml的鲎试剂预实验，结果如下：稀释倍数原液510204080供试品溶液 供试品阳性对照 +由以上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰试验。第20页/共30页干扰实验干扰实验正式干扰实验正式干扰实验 制备内毒素标准对照溶液制备内毒素标准对照溶液 取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释

15、成4个浓度的标准溶液即2、0.5、0.25。制备含内毒素的供试品溶液制备含内毒素的供试品溶液 将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2、0.5、0.25的含内毒素的供试品溶液。鲎试剂的准备鲎试剂的准备 取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，备用。第21页/共30页干扰实验干扰实验 加样加样 准备好的36支鲎试剂放在试管架上，按下图加样。0.1ml内毒素标准液0.1ml检查用水0.1ml含内毒素的供试品液 0.1ml供试品液加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入371恒温器中，保温602分钟，观察并记录结果。第22页/共

16、30页干扰实验干扰实验 实验结果计算实验结果计算 如两组最大浓度2.0均为阳性，最低浓度0.25均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。Es=lg-1（Xs/4）Et=lg-1（Xt/4）式中 Xs、Xt 分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。第23页/共30页干扰实验干扰实验 当Es 在0.52（包括0.和2）及Et 在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用，可在该浓

17、度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当Et不在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如可将供试品进行更大倍数稀释（不超过MVD）。建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号的供试品。用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号的供试品。用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。试剂进行干扰实验。第24页/共30页供试品细菌内毒素检查供试品细菌内毒素检查在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。供试品溶液的制

18、备供试品溶液的制备 根据内毒素限度值，计算MVD=CL/。然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD。一般稀释至MVD；如样品有干扰作用，选择符合干扰试验要求的第二浓度作为日常检查浓度。阳性对照溶液的制备阳性对照溶液的制备 用检查用水将内毒素标准品稀释制成2浓度的内毒素标准溶液。第25页/共30页供试品细菌内毒素检查供试品细菌内毒素检查供试品阳性对照溶液的制备供试品阳性对照溶液的制备 用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2浓度的内毒素溶液。阴性对照阴性对照 即细菌内毒素检查用水。鲎试剂的准备鲎试剂的准备 取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，每支加入0.1ml检查用水使溶解备用。

19、加样加样 8支管中2支加入0.ml供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管,2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入371水浴或适宜恒温器中，保温602分钟。第26页/共30页供试品细菌内毒素检查供试品细菌内毒素检查结果判断结果判断 当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为均为阳性，应认为不符合规定；如2管中1管阳性，1管阴性，则另取4支供试品管复试，4

20、管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将稀释至MVD。第27页/共30页供试品细菌内毒素检查供试品细菌内毒素检查例例 某葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。MVD=CL/=0.5/0.125=4 将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。供试品供试品阳性对照阳性对照阴性对照+结果是否有效有效结果判断该葡萄糖注射液内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定。第28页/共30页结束，谢谢！第29页/共30页感谢您的观看！第30页/共30页