抗体的精制.ppt

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1、抗体的精制免疫球蛋白的分离纯化的含义以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。体的血清蛋白。因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分

2、离和免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白纯化免疫球蛋白。球蛋白（球蛋白（IgGIgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的约占全部免疫球蛋白的 7575，因此，抗体的分，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化离纯化主要是分离纯化 IgGIgG。免疫球蛋白的主要成分对免疫球蛋白的分离纯化有两方面的含义：对免疫球蛋白的分离纯化有两方面的含义：一是从理化性质上提取均质的免疫球蛋白部分，一是从理化性质上提取均质的免疫球蛋白部分，去除杂质蛋白、提高免疫球蛋白的含量。去除杂质蛋白、提高免疫球蛋白的含量。二是从免疫学角度上提取对某种特定抗原的特异二是从免

3、疫学角度上提取对某种特定抗原的特异性抗体，这种特异性抗体可以是几类免疫球蛋白性抗体，这种特异性抗体可以是几类免疫球蛋白(IgGIgG，IgMIgM，IgIgE)E)的混合物。的混合物。免疫球蛋白的分离纯化的含义抗体分离纯化的方法在在血血清清中中的的抗抗体体活活性性是是相相对对稳稳定定的的，因因此此要要根根据据实实验验的的要要求求，减减少少不不必必要要的的纯纯化化过过程程，保保证证抗体的活性和避免抗体绝对量的损失。抗体的活性和避免抗体绝对量的损失。中中性性盐盐沉沉淀淀法法是是抗抗体体分分离离和和纯纯化化的的首首选选方方法法，但但利利用用盐盐析析法法提提取取的的免免疫疫球球蛋蛋白白，不不能能得得到

4、到纯纯净的免疫球蛋白。净的免疫球蛋白。欲欲获获得得较较纯纯净净产产品品，还还需需要要结结合合其其他他方方法法，如如凝凝胶胶过过滤滤、离离子子交交换换、亲亲和和层层析析、区区带带电电泳泳等等进行进一步分离纯化。进行进一步分离纯化。盐析法(中性盐沉淀法)盐析的原理溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水，发生凝集而沉淀析出。水，发生凝集而沉淀析出。不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成同，可利

5、用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。免疫球蛋白的盐析条件许许多多中中性性盐盐都都能能使使蛋蛋白白质质盐盐析析，如如硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠、硫硫酸酸镁镁、氯氯化化钠钠和和磷磷酸酸盐盐等等。最最常常用用的的为为硫硫酸酸铵铵，因因它它具具有有溶溶解解度度高高且且受受温温度度影影响响较较小的优点，在室温或冰箱小的优点，在室温或冰箱(4(4)内均可进行。内均可进行。一一般般认认为为在在 pH7.0pH7.0时时，5050硫硫酸酸铵铵饱饱和和度度可可将所有的免疫球蛋白都沉淀出来。将所有的免疫球蛋白都沉淀出来。3333饱和度时，大部分饱和度

6、时，大部分 IgGIgG 可沉淀出来。可沉淀出来。4040饱饱和和度度时时，沉沉淀淀物物的的得得率率最最高高，但但含含 IgMIgM，IgAIgA 等等 球蛋白部分增多。球蛋白部分增多。注意事项温度：温度：抗体对温度比较敏感，长时间暴露在室抗体对温度比较敏感，长时间暴露在室温可以使抗体失活，因此提取免疫球蛋白最好温可以使抗体失活，因此提取免疫球蛋白最好在在 2-42-4条件下进行。条件下进行。等电点：等电点：蛋白质在等电点时的溶解度最低，兔蛋白质在等电点时的溶解度最低，兔 IgGIgG 的等电点为的等电点为 p pI I 8.08.0，操作时应该避开使用操作时应该避开使用等电点附近的缓冲溶液。

7、等电点附近的缓冲溶液。蛋白质的浓度：蛋白质的浓度：蛋白质的浓度过高时，会出现蛋白质的浓度过高时，会出现欲分离的蛋白与其它蛋白质一起共沉的现象因欲分离的蛋白与其它蛋白质一起共沉的现象因此蛋白质浓度应在此蛋白质浓度应在 2.5-3%2.5-3%为宜。浓度过高时为宜。浓度过高时应用应用 PBSPBS稀释。稀释。离子交换法离子交换的原理同等电聚焦电泳一样，离子交换剂以自身所带相同等电聚焦电泳一样，离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷相结合，蛋白质进入离反电荷与蛋白质的净电荷相结合，蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。被洗脱

8、下来。余下的蛋白质均结合在树脂上，由于其蛋白质表余下的蛋白质均结合在树脂上，由于其蛋白质表面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同。面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同。利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。到分离、纯化蛋白质的目的。阴阳离子交换标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链，和不溶标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链，和不溶性的树脂结合而成。性的树脂结合而成。DEAEDEAE等阴离子交换树脂侧链电荷为正。等阴离子交换树脂侧链电荷为正。CMCM等阳离子交换树脂侧链电荷为负。等阳离子交换树脂侧链电荷为负。若蛋白质所

9、带净电荷为负，则需用阴离子交换树若蛋白质所带净电荷为负，则需用阴离子交换树脂进行纯化，反之则使用阳离子交换树脂。脂进行纯化，反之则使用阳离子交换树脂。免疫球蛋白的离子交换采用采用 DEAE-DEAE-纤维素对抗体进行精制，特别是经纤维素对抗体进行精制，特别是经过初步纯化后的过初步纯化后的 IgIg 的纯化，效果尤为显著。的纯化，效果尤为显著。IgGIgG 的等电点为的等电点为 p pI I=8.0=8.0，IgMIgM，IgAIgA 的等电的等电点为点为 pIpI7.07.0，7.47.4，在在 pH8.0pH8.0时时 IgGIgG 带正电荷，带正电荷，不能被不能被 DEAE-DEAE-纤维

10、素吸附而被洗脱下来。纤维素吸附而被洗脱下来。被被 DEAE-DEAE-纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中增加洗脱液中 离子浓度的方法将其逐一洗脱，离子浓度的方法将其逐一洗脱，或降低或降低 pHpH使之洗脱出来。使之洗脱出来。利用利用利用利用DEAE-cellulose 52DEAE-cellulose 52离子交换层析分离抗体离子交换层析分离抗体离子交换层析分离抗体离子交换层析分离抗体DEAE-cellulose 52 chromatography of anti-serum specific to a DEAE-cellulose 52 chroma

11、tography of anti-serum specific to a characteristic protein component of GRcharacteristic protein component of GR 注意事项进行离子交换层析的最佳溶液进行离子交换层析的最佳溶液 pHpH值一般与预值一般与预分离蛋白质的等电点相差一个单位，这可使蛋分离蛋白质的等电点相差一个单位，这可使蛋白质的净电荷量即可保证将其结合在离子交换白质的净电荷量即可保证将其结合在离子交换树脂上，又不需在洗脱时采用高强度的离子浓树脂上，又不需在洗脱时采用高强度的离子浓度或度或 pHpH值相差悬殊的苛刻洗脱条件

12、。值相差悬殊的苛刻洗脱条件。离子交换树脂再使用前需要再生，阴离子交换离子交换树脂再使用前需要再生，阴离子交换树脂以碱酸碱的顺序进行处理，阳离子交换树树脂以碱酸碱的顺序进行处理，阳离子交换树脂以酸碱酸的顺序进行处理和再生。脂以酸碱酸的顺序进行处理和再生。装柱时要求粒度均匀，比较致密，柱床表面平装柱时要求粒度均匀，比较致密，柱床表面平整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象，加样蛋整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象，加样蛋白浓度低于白浓度低于 2020毫克毫克/毫升，上样体积小于柱体毫升，上样体积小于柱体积的积的 1/31/3，流速控制在，流速控制在 0.2-0.50.2-0.5毫升毫升/分钟。分钟。亲和层

13、析法亲和层析法的原理亲和层析是利用生物分子间所具有专一亲和力亲和层析是利用生物分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术如抗原和抗体，蛋白质而设计的层析技术如抗原和抗体，蛋白质A A与与一些鼠亚类抗体之间，均具有专一的亲和力，一些鼠亚类抗体之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把可结合的一对分子的一方当把可结合的一对分子的一方 (称配体称配体)结合在结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结

14、合为一整体。然后设法将它该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。一特定的物质。载体的选择使配体固相化的不溶性化合物称为载体，用于使配体固相化的不溶性化合物称为载体，用于亲和层析的理想载体应该具备下述持性：。亲和层析的理想载体应该具备下述持性：。高度亲水：高度亲水：使固相配易于同水溶液中的相应结使固相配易于同水溶液中的相应结合物接近；合物接近；惰性载体：惰性载体：使载体的非专一性吸附尽可能小；使载体的非专一性吸附尽可能小；具有相当量可供活化的化学基团：具有相当量可供活化的化学基团：并在温和条并在温和条件

15、下能与较大量配体连接；件下能与较大量配体连接；有较好的物理化学稳定性：有较好的物理化学稳定性：不易受周围条件的不易受周围条件的影响。影响。(如如PHPH，离子强度，温度，变性剂和去离子强度，温度，变性剂和去污剂等污剂等)具有多孔的网状结构，具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分能使被亲和吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度；子自由通过而增加配体的有效浓度；有良好的机械性能，有良好的机械性能，利于控制层析速度，最好利于控制层析速度，最好是均一的珠状颗粒。是均一的珠状颗粒。琼脂糖凝胶抗体纯化中常用的载体为琼脂糖凝胶，它是球抗体纯化中常用的载体为琼脂糖凝胶，它是球状凝胶颗粒，球状琼脂糖凝胶获水

16、能力很强，状凝胶颗粒，球状琼脂糖凝胶获水能力很强，物理和化学性质比较稳定。它具有疏松的网状物理和化学性质比较稳定。它具有疏松的网状结构，可让分子量上百万的大分子产物自由通结构，可让分子量上百万的大分子产物自由通过。过。因此用琼脂糖载体制成的亲和柱不但可以较长因此用琼脂糖载体制成的亲和柱不但可以较长期的反复使用，而且可以采用蛋白变性剂作为期的反复使用，而且可以采用蛋白变性剂作为洗脱大分子物质及彻底洗涤吸附物质的洗脱液洗脱大分子物质及彻底洗涤吸附物质的洗脱液缺点是琼脂糖经不起有机溶剂处理，也不能进缺点是琼脂糖经不起有机溶剂处理，也不能进行干燥行干燥 (包括冷冻干燥包括冷冻干燥)。常用的配体抗体纯化

17、中常用的配体是抗原。根据抗原和抗抗体纯化中常用的配体是抗原。根据抗原和抗体能形成抗原体能形成抗原-抗体复合物的特性，发展了免疫抗体复合物的特性，发展了免疫吸附技术。吸附技术。将可溶性抗原用化学方法偶联到不溶性载体上，将可溶性抗原用化学方法偶联到不溶性载体上，使之固相化，将相应的抗血清按层析法加入柱使之固相化，将相应的抗血清按层析法加入柱中，抗血清中相应的抗体就与抗原特异结合，中，抗血清中相应的抗体就与抗原特异结合，其它蛋白成分随洗液流出。再改变缓冲液的其它蛋白成分随洗液流出。再改变缓冲液的 PHPH和离子强度，就可以使抗体和偶联在载体和离子强度，就可以使抗体和偶联在载体上的抗原分开而被洗脱下来

18、，从而得到纯净的上的抗原分开而被洗脱下来，从而得到纯净的抗体。抗体。抗体纯化中常用的配体还有蛋白抗体纯化中常用的配体还有蛋白A A和蛋白和蛋白 GG。蛋白A蛋蛋白白A A是是金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌细细胞胞壁壁的的一一种种蛋蛋白白抗抗原原成成分分，它它是是单单一一的的多多肽肽链链分分子子量量为为42,00042,000分分为为5 5个个片片段段，从从N N末末端端开开始始的的4 4个个由由58-6258-62个个氨基酸残基组成的高度同源的片段。氨基酸残基组成的高度同源的片段。每每个个片片段段都都具具有有和和IgGIgG的的FcFc段段结结合合的的活活性性，但但就就整整个个蛋蛋白白A A分分

19、子子而而言言，只只能能与与2 2个个FcFc段段结结合合，这这种种结结合合是是一一种种疏疏水水结结合合，可可在在一一定定条条件件下下，将将IgGIgG从蛋白从蛋白A A解脱下来。解脱下来。蛋蛋白白A A具具有有良良好好的的再再生生性性，耐耐受受低低pHpH反反复复处处理理的性能，大多数抗体都能耐受短暂的低的性能，大多数抗体都能耐受短暂的低pHpH处理。处理。蛋白G蛋蛋 白白 G G是是 链链 球球 菌菌 表表 面面 的的 一一 种种 蛋蛋 白白，分分 子子 量量 为为30,00035,00030,00035,000，它它对对免免疫疫球球蛋蛋白白的的吸吸附附机机制制与与蛋蛋白白A A相似。相似。

20、蛋蛋白白G G对对各各种种免免疫疫球球蛋蛋白白的的吸吸附附能能力力与与蛋蛋白白A A不不同同，故故在在抗抗体体的的纯纯化化上上可可与与蛋蛋白白A A互互补补。当当某某些些抗抗体体对对蛋蛋白白A A没没有有吸吸附附能能力力时时，它它们们往往往往会会对对蛋蛋白白G G有有吸附作用吸附作用。蛋白蛋白A/GA/G对来自不同种属抗体的亲和性对来自不同种属抗体的亲和性 种属种属蛋白蛋白A A亲和性亲和性蛋白蛋白G G亲和性亲和性人人+马马+牛牛+绵羊绵羊+/-+/-+山羊山羊-+家兔家兔+鸡鸡-+豚鼠豚鼠+大鼠大鼠+/-+/-+小鼠小鼠+层析条件的选择亲和层析一般采用柱层析法，在亲和吸附时，亲和层析一般采

21、用柱层析法，在亲和吸附时，亲和柱使用的平衡缓冲液的组分，亲和柱使用的平衡缓冲液的组分，pHpH和离子和离子强度都应选择亲和双方作用最强，最有利于形强度都应选择亲和双方作用最强，最有利于形成复合物的条件。成复合物的条件。根据生物大分子的特点，一般选取接近中性根据生物大分子的特点，一般选取接近中性 PHPH作为亲和吸附条件，上柱时样品液一般应作为亲和吸附条件，上柱时样品液一般应与亲和柱平衡缓冲液一致，通常是上柱前样品与亲和柱平衡缓冲液一致，通常是上柱前样品先对平衡缓冲液进行充分透析。先对平衡缓冲液进行充分透析。上柱流速尽可能缓慢，对流出液需进行定量测上柱流速尽可能缓慢，对流出液需进行定量测定，以判

22、断亲和吸附效率。定，以判断亲和吸附效率。样品的洗脱样品通过亲和柱后，用大量的平衡缓冲液洗去样品通过亲和柱后，用大量的平衡缓冲液洗去杂质，直至流出液中不含蛋白。杂质，直至流出液中不含蛋白。然后再用洗脱液洗脱，洗脱液能减弱配体和亲然后再用洗脱液洗脱，洗脱液能减弱配体和亲和物之间的亲和力，使该结合物完全解离。和物之间的亲和力，使该结合物完全解离。洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在时为止。直到无亲和物存在时为止。再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡，加入防腐再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡，加入防腐剂，存放于冰箱剂，存放于冰箱(4 4)中，以备下次再用。中，以备下次再用。凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤也用于凝胶过滤也用于 IgGIgG 和和 IgMIgM 类单克隆抗体的分类单克隆抗体的分离纯化。离纯化。常用常用 SephadexSephadexG200G200作分离介质，可以回收到作分离介质，可以回收到 3 3个峰，最高峰为个峰，最高峰为 IgMIgM，另外两个为另外两个为 IgGIgG，抗抗体回收率达到体回收率达到 50-80%50-80%，能除去微量的杂蛋白，能除去微量的杂蛋白，抗体的纯度可以达到抗体的纯度可以达到 95%95%以上。以上。