用荧光显微镜结构及观察口腔上皮细胞的.pptx

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1、实验目的实验目的实验原理实验原理仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂实验步骤实验步骤实验报告及思考题实验报告及思考题第1页/共22页 实实 验验 目目 的的了解荧光显微镜的基本构造和基本光路了解荧光显微镜的基本构造和基本光路了解荧光探针了解荧光探针Hoechst33258或或33342与细胞成分的结合特性和光谱特性与细胞成分的结合特性和光谱特性第2页/共22页荧荧光光显显微微镜镜第3页/共22页什么是荧光什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。出的光。即：物质吸收短波光，发射出的

2、长波光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光一种光化荧光 第4页/共22页荧光的种类荧光的种类自发荧光自发荧光 次生荧光次生荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光第5页/共22页荧光的性质荧光的性质吸收光吸收光保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性荧光波长激发波长（荧光波长激发波长（STOKES STOKES

3、法则）法则）荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率第6页/共22页落射荧光显微镜的构落射荧光显微镜的构造造吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜汞灯汞灯汞灯汞灯紫外线保护罩紫外线保护罩紫外线保护罩紫外线保护罩孔径光栏孔径光栏孔径光栏孔径光栏（FSFSFSFS）视场光栏视场光栏视场光栏视场光栏（ASASASAS）第7页/共22页落射荧光显微镜各部件特性和作用落射荧光显微镜各部件特性和作用 汞灯光

4、源汞灯光源汞灯光源汞灯光源:提供激发光提供激发光提供激发光提供激发光(UV(UV(UV(UV、B B B B、G)G)G)G)激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜:波长选择波长选择波长选择波长选择nmT%BAND PASSBAND PASS第8页/共22页第9页/共22页第10页/共22页落射荧光显微镜原理落射荧光显微镜原理汞汞汞汞 灯灯灯灯激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜物物物物 镜镜镜镜 标标标标 本本本本第11页/共22页第12页/共22页第13页/共22页滤色镜的选择滤色镜的选择荧光素的特性荧光素的特性荧光素的

5、特性荧光素的特性滤色镜的特性滤色镜的特性滤色镜的特性滤色镜的特性激发激发激发激发分色分色分色分色吸收吸收吸收吸收根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜第14页/共22页实实 验验 原原 理理 荧荧光光显显微微镜镜技技术术是是利利用用一一定定波波长长的的光光（通通常常是是波波长长短短的的紫紫外外光光和和蓝蓝紫紫光光）照照射射被被检检样样品品，样样品品获获得得能能量量，产产生生能能量量跃跃迁迁，从从基基态态到到汽汽激激发发态态，再再从从激激发发态态回回到到原原态态，放放出出光光和和热热能能，产产生生的

6、的光光为为波波长长较较长长的的光光（相相对对于于激激发发光光波波长长），此此可可见见光光称称为为荧荧光光。通通过过物物镜镜、目目镜镜的的成像、放大，以供观察、检测和拍摄。成像、放大，以供观察、检测和拍摄。第15页/共22页 荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和较短波长的荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的荧光。视野中所看到的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光映像。荧光显微镜技术是在光学显微镜像，主要是样品的荧光映像。荧光显微镜技术是在光学显微镜水平上对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。水平上

7、对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。非免疫荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及生物非免疫荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及生物大分子。这些探针大多数能被活细胞直接摄取并掺入和聚集在大分子。这些探针大多数能被活细胞直接摄取并掺入和聚集在特定的细胞器中，因此我们就可以通过荧光显微镜对这些细胞特定的细胞器中，因此我们就可以通过荧光显微镜对这些细胞器进行观察。器进行观察。第16页/共22页 Hoechst33258 Hoechst33258是一种亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，与是一种亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，与DNADNA特异性结合，它主要结合在富含特异性结合，它主要

8、结合在富含ATAT区域的区域的DNADNA小沟部分。结合小沟部分。结合DNADNA后荧光大大增强，最大激发光波长约为后荧光大大增强，最大激发光波长约为350nm,350nm,最大发射光波长约为最大发射光波长约为461nm461nm。可用于活细胞观察，不需要对细胞作固定及透化处理。可用于活细胞观察，不需要对细胞作固定及透化处理。第17页/共22页仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂仪器：荧光显微镜，仪器：荧光显微镜，材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，牙签材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，牙签试剂：试剂：PBS(pH 7.4)PBS(pH 7.4)Ho.33258 or H.33342 Ho.33258

9、or H.33342（10g/mL10g/mL，溶于，溶于PBS)PBS)第18页/共22页 实实 验验 步步 骤骤在1张载玻片上分别滴加一滴PBS溶液用牙签刮取口腔上皮细胞，分别涂于载玻片上（牙签在液滴中搅匀）在涂细胞处分别滴加10g/mL的Hoechst.33342盖片室温暗处孵育2-3分钟用紫外光激发，观看细胞DNA荧光第19页/共22页注注 意意 事事 项项 盖片时防止产生气泡盖片时防止产生气泡 滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察 注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存 操作时防止污染皮肤和环境操作时防止污染皮肤和环境第20页/共22页口腔粘膜上皮.jpg第21页/共22页感谢您的观看！第22页/共22页