医学-人类基因组课件.ppt

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1、1七、人类基因组（一）人类基因组计划（二）DNA多态性（三）DNA多态性与个性化医疗（四）疾病相关基因的定位与克隆（五）疾病诊断、防治（六）人类基因组与法律、社会伦理2什么是基因组？什么是基因组？某种生物所有遗传信息的总和，包括编码序列，调控序列和其它所有功能未知的序列（一）人类基因组计划3人类基因组特点：1）人类基因组单倍体约含有3109、30亿个碱基对。2)结构松弛;基因组中大约只有2%-5%为编码序列，约含3万多个基因，近1/3为多拷贝。单拷贝基因多数只在分化细胞中翻译为专一蛋白质，如胰岛素基因在胰岛细胞表达。因为这些基因只在极少数细胞甚至只在生物发育的某个阶段才表达，所以它们在基因组上

2、所占的份额只需单拷贝即能满足生理需要。4多拷贝基因是一些与生物的基本功能密切相关的基因，如组蛋白基因、tRNA基因等，只有多拷贝才能满足生理需要。3)含有大量重复顺序。4)由线性DNA与蛋白质组成染色体结构。6什么是人类基因组计划如果把人类基因组比喻为一本有10亿单词的百科全书，这本书可分23章，每章为一个染色体。而每一个染色体上，又包含着数千个被称为基因的“故事”。这些“故事”由一系列3字母单词组成，其中每个单词是4个基本化学“字母”的任意排列组合。人类基因组计划，正是要“读出”这30亿个化学“字母”。7人类基因组计划是用大撒网的方法，将人的所有基因一网打尽，即测定人类基因组的全部DNA亿个

3、碱基对的序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，从而解读所有遗传密码，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。8计划于年正式启动，这一价值亿美元的计划的目标是，为亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，至2005年完成，从而最终弄清楚每种基因制造的蛋白质及其作用。10基因淘金热-从冰岛透视人类基因一项鉴定具有重要医药价值的人类基因的研究正在一个未曾预料一项鉴定具有重要医药价值的人类基因的研究正在一个未曾预料的地方进行，这是位于格陵兰岛（的地方进行，这是位于格陵兰岛（Grennland）和斯堪的纳维亚）和斯堪的纳维亚（Scandinavian）之间北大西洋中一个称为冰岛（）之间北大西洋中一个

4、称为冰岛（Iceland）的偏）的偏僻岛屿。由于历史和地理隔离的原因，冰岛上僻岛屿。由于历史和地理隔离的原因，冰岛上270 000居民为遗传居民为遗传学研究提供了独一无二的遗传资源。他们是学研究提供了独一无二的遗传资源。他们是1 100年前定居在该岛年前定居在该岛的海盗的后裔，遗传组成相当均一。这种遗传均一性因发生的海盗的后裔，遗传组成相当均一。这种遗传均一性因发生2次次遗传瓶颈而进一步强化，当时岛上的居民经历了急剧的人口递减。遗传瓶颈而进一步强化，当时岛上的居民经历了急剧的人口递减。15世纪，由于淋巴腺鼠疫袭击该岛，冰岛人口由世纪，由于淋巴腺鼠疫袭击该岛，冰岛人口由70 000人骤然降人骤然

5、降至至25 000人。人。17世纪，因世纪，因Hekla活火山的三次爆发造成的大火和活火山的三次爆发造成的大火和由此引起的疾病使全岛人口再次降至由此引起的疾病使全岛人口再次降至50 000。因此冰岛的人类基。因此冰岛的人类基因库较之其他大多数的人口群体更加均一。此外，自因库较之其他大多数的人口群体更加均一。此外，自1915年冰岛年冰岛的国家健康服务部门即为每个家庭保留着良好的医疗记录。的国家健康服务部门即为每个家庭保留着良好的医疗记录。11基因淘金热-从冰岛透视人类基因1997年，一位哈佛大学的遗传学家年，一位哈佛大学的遗传学家Kari Stefansson意识到冰岛人类意识到冰岛人类基因库和

6、家庭医疗记录的特殊意义，决定回到他的故乡，宣布成基因库和家庭医疗记录的特殊意义，决定回到他的故乡，宣布成立一家私人公司，即立一家私人公司，即deCODE Genetics。该公司的目标是分离和。该公司的目标是分离和鉴定人类基因，用于开发新的药物和诊断试剂。这家公司的第一鉴定人类基因，用于开发新的药物和诊断试剂。这家公司的第一个成功实验是鉴定出家族性必需震颤（个成功实验是鉴定出家族性必需震颤（familial essential tremor）基因基因 一种与老年人震颤相关基因。此外，一种与老年人震颤相关基因。此外，deCODE的科学家的科学家在其它人类缺陷疾病方面的研究也获得迅速进展。在其它人

7、类缺陷疾病方面的研究也获得迅速进展。由于上述结果，由于上述结果，deCODE的遗传学家与瑞士医药巨子的遗传学家与瑞士医药巨子Hoffmann-LaRoche签定了一项签定了一项2亿美金的合同，它将给瑞士公司亿美金的合同，它将给瑞士公司优先使用来自优先使用来自deCODE研究开发的任何一种药物或诊断试剂的权研究开发的任何一种药物或诊断试剂的权力。此外，该项合同还提到，力。此外，该项合同还提到，Hoffmann-LaRoche必需为冰岛居必需为冰岛居民无偿提供来自民无偿提供来自deCODE研究开发的所有药物，诊断试剂和其它研究开发的所有药物，诊断试剂和其它产品。因此至少在这一情况下，为产品。因此至

8、少在这一情况下，为deCODE分析研究提供遗传资分析研究提供遗传资料和料和DNA样品的人群可从私人公司的研究中获得个人利益。样品的人群可从私人公司的研究中获得个人利益。13人类基因组的研究历程1953年，Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型1972年，Berg等人构建成功第一个重组DNA分子；1977年，Gilbert和Sanger等人分别发明了DNA测序技术。151987年，人工染色体等载体构建成功。1987年，美国能源部开始实施人类基因组测序计划。1988年，国际人类基因组织（HUGO）成立。1988年，Watson担任负责人，美国国立卫生研究院参与HGP。1990年，美国国

9、会批准正式HGP，随后法国、英国、德国、日本、中国等陆续启动HGP计划。1690年代，人类基因组测序在六个国家合作下全面开展。基因组数据成指数增长。1998年，科学家Ventor等人组建Celera公司，同时开展人类基因组测序计划，与HUGO竞争。2000年6月，人类基因组草图宣布绘成。18IIIIIIAABBaabbAaBbaabbAaBbaabbAabBaABb左图3代家系中，第3代4同胞中，1和2没发生重组，3和4发生重组。19遗传标记在基因定位时的作用。不同基因不同基因带有遗传标记的染色体带有遗传标记的染色体根据遗传标记，基因在染色体上的位置被根据遗传标记，基因在染色体上的位置被确定。

10、确定。20M为遗传标记位点，D为致病位点，两个位点紧密连锁，大写表示为野生型，小写表示为突变型212、物理图谱 基因组太大,必需分散测序 如果将每个碱基比作一个英文字母，以每10 cm书写60个字母计算，人类基因组30亿个碱基其长度可达5000千米，相当于从北美洲的蒙特利尔横跨大西洋到达伦敦，洛杉矶 到达巴拿马。以上述标准编写书籍，可写成3000本每册200万字的著作。22物理图谱的基本原理是将每一条染色体敲碎、分段克隆，利用重叠的方法将这些克隆头尾重叠相连，就可以获得横跨和覆盖整条染色体的克隆群。物理图以Mb、kb、bp作为图距。物理图谱的路标：STS(sequence-tagedsite)

11、序列标签位点，STS在基因组中只出现一次，可定义重叠克隆群中某一特定克隆、对重叠克隆群进行排序。24DNA测序目前常用的DNA测序方法为：Sanger法：即双脱氧法，以单链DNA为模版，一个短的DNA引物和DNA聚合酶合成一条互补DNA链，利用双脱氧核苷酸（ddNTP）插入将会导致链延长反应随机终止的原理，可以在凝胶电泳上检测到模版不同位置上的不同碱基。从而读出模版的序列。短的DNA引物，通常十几至几十个核苷酸长度，单链，称寡核苷酸，可用DNA合成仪合成。25DNA测序原理示意图待测序模版引物四个反应，分别加入四种ddNTP分别终止在不同的ddNTP位置上电泳分开，读图，解析序列26DNA测序

12、原理示意图二改进的Sanger法，用四种荧光素标记四种ddNTP，测序结果直接被荧光探测器读出。测序仪测序。284、基因图谱在人类基因组中鉴别出占2%-5%的全部基因。基因增强子组织特异性成分“CCAAT盒”“TATA”盒“帽子位点”转录起始位点ATG起始密码子GTAGGTAGTAA,TGA,TAG终止密码子AATAAA多聚腺苷酸化信号加(A)n位点5非翻译区3非翻译区292003年4月15日，在DNA双螺旋（1953年4月15日发表）发表50周年之际，美、英、日、徳、法、中6个国家政府首脑正式宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标提前2年实现。1990-1998年的8年时间是

13、人类基因组第一阶段（作图），包括遗传图和物理图。这二张图的制作使得人类基因组这样一个巨大的DNA生物大分子分解成较小的可以操作的部分。31在人类基因组计划中，中国承担和完成了1%的任务，3号染色体短臂约300Mb的测序任务。32人类基因组计划完成，标志人类已读出人类生命这部天书，但读出不等于读懂。实际上我们现在能读懂的还只是其中很小一部分。基因组编码约2.5万个基因，一半以上我们还不知其功能是什么，就是已知功能的那部分，我们也只是知道其中很小部分。另外个别基因的功能不等于其在功能网络中的功能。每个基因实际上都有多重功能，可能我们现在对一些基因赋予的功能只是其在人类生长发育的一定阶段，或是某个空

14、间位置（某一细胞、组织或器官）的功能。33基因组计划完成后，接下来要进入的是功能基因组研究。要知道这些基因是干什么的，其相互关系，即蛋白产物的相互作用，基因表达的调控等。如要真正了解基因组在整体生命系统里的确切功能，还要进行模式生物的研究。因为要认识人类基因组，只看人类的DNA序列，或者只看蛋白质功能是不够的，人类基因中哪一些基因的结构决定了我们是人而不是黑猩猩，这就是比较生物学研究。34就与人类疾病的关系而言，功能基因组研究是最重要的。人类疾病涉及的基因一旦被发现后，实际上就是对其功能研究的最好注释。在疾病相关研究中，单核苷酸多态（SNP）非常重要。单核苷酸多态性（SNPs）是指不同个体间在

15、基因水平上的单个核苷酸变异，在人类基因组中，单核苷酸多态（SNP）很常见，平均每300对碱基出现一个SNP，两个无关个体间大约有900万SNPs。这种SNP的综合效应可能就造成了个体间的差异，包括个人的基本特征（身高、肤色等），其对疾病的易感性、对药物的反应等。35（二）DNA多态性在一个(个体、细胞或分子)群体中，某一遗传特性若存在若干种类型，则称之为多态性（polymorphism）。所谓DNA的多态性（DNApolymorphism）,则是指DNA水平上的多态性。一般认为DNA序列中某特定位点的变异频率低于1%的为突变,高于1%则为分子多态性。361、限制性片段长度多态性（RFLP）：同

16、一物种不同个体的DNA分子，用同一种限制性内切酶完全酶切后，出现分子量不同的同源等位基因片段，称为限制性片段长度多态性。限制性片段长度多态性是多态性DNA标记之一。37RFLP的示意图不同的个体的DNA，在同一种限制酶作用下，切出不同大小的片段，显示出多态性因为DNA的多态性，两个个体的DNA内切酶位点是不一致的38限制酶：即限制性内切酶，能识别双链DNA中的特定碱基序列，并切割双链DNA的核酸酶。常用于重组DNA技术的是一类限制酶的识别位点为回文对称结构，它们的结合和切割都在这一特定的对称结构内。由于不同的限制酶具有特异性识别和切割特定DNA序列的能力，我们称之为操作DNA的手术刀。39有些

17、限制性内切酶切割DNA后产生5磷酸突出的末端，有些则产生3羟基突出的末端，它们统称为粘性末端酶；还有一些在切割两条链时会产生两端平整(平末端)的DNA分子。4041两种限制性内切酶及其识别序列HindIII，识别六碱基的回文对称序列AAGCTT，TTCGAA并切出两个粘性末端。（不齐的末端）PvuII，识别CAGCTG，GTCGAC切出一个平末端（平齐的末端）42一个特定限制酶的识别序列在一段特异DNA中出现的频率部分地取决于它的长度。如HindIII识别TTCGAA这样一个特殊的6核苷酸序列，在一个DNA随机片段中可能出现的频率约为46（4096）个核苷酸一次。与此相似，识别4核苷酸的限制酶

18、，将会以大约44（256）核苷酸的间隔切割DNA，识别8核苷酸的限制酶，将会以大约48（65000）核苷酸的间隔切割DNA。实际上，因为在基因组中某些序列过多或过少地出现，一个特定限制酶位点的出现频率可能多于或少于预计的频率。43RFLP的特点（1）处于染色体上的位置固定;（2）严格遵守孟德尔遗传定律;（3）同一凝胶电泳可显示不同多态性片段,表现为共显性；（4）通常被限制性内切酶检出从而导致RFLP的碱基变化本身并不是致病原因，而是一种无功能后果的中性改变。然而能用来标记特定的基因跟踪它的遗传。44左图是一个典型的甲型血友病家族，在第IV和第V代有患病男性。系谱检察发现III-2、III-4、

19、III-5肯定是杂合子携带者。根据系谱个体IV-4是携带者的风险为50%，她在建立家庭之前想确切知道这种危险性。通常，人们发现血友病基因携带者血液中含有大约半量的正常VIII因子蛋白，因此有时可利用这一所见来区分纯合的正常妇女和携带者。但是在正常和携带者之间有很大的重叠，所以利用蛋白定量的方法有时不能明确区分。这样的家庭中，确定IV-4是否是携带者更准确的方法就是利用RFLP作为携带突变等位基因的标记。中图显示VIII因子基因内一个内含子区域含有限制性酶Bcl I多态性的限制图谱。用位于多态性限制位点两侧的PCR引物1和2扩增靶区域，用Bcl I切割扩增后的DNA，切割后的DNA片段直接进行凝

20、胶电泳以分析该酶切位点是否存在。如果存在，142bp的产物将被切割成为99bp和43bp两个片段；如果不存在，将会看到142bp 的全长片段。所有血友病男性患者都有142bp片段，说明带有血友病突变基因无Bcl I酶切位点。个体IV-4从她母亲III-4遗传了Bcl I等位基因，因此是血友病携带者。在67bp处有一个固定的不明来源的条带，在本次分析中可以忽略。45在这个例子中讨论了X连锁隐性遗传病，这类分析也同样可成功地应用于常染色体显性和隐性遗传病。这种基于PCR技术的分析方法非常快速，称为PCR-RFLP，几小时就能得到结果，而且只需要每个个体微量的基因组DNA。46基因体外扩增：PCR基

21、因扩增是自然状态下，细胞内发生的生理生化变化。l985年美国Cetus公司的Mullis发明了体外快速扩增特定DNA序列的方法，即聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)。它是分子生物学在技术上的一次革命。该技术模拟发生在细胞内的DNA复制过程，数小时内便可获得大量拷贝的特定DNA片段，其步骤简便，结果可靠，为研究和分析基因提供了一种全新的方法，在医学、法医、考古学、人类学等许多领域内获得了广泛的应用。由于这项工作，Mullis在l993年获得了诺贝尔化学奖。471）PCR成分：待扩增的双链DNA（模板），两个短的单链DNA引物（长约20个碱基，一个与待扩增DN

22、A一条链的5端序列互补，另一个与另一条链的5端序列互补，DNA合成仪合成），耐高温的TaqDNA聚合酶，四种脱氧核苷酸混合物及反应缓冲液。PCR的模板是含有待扩增序列的DNA或从mRNA反转录来的cDNA。482）PCR原理：PCR利用了DNA复制的一些特点和DNA双链的热动力学。通过加热，使双链DNA分子接近沸点温度（94oC）时分离成为两条单链DNA；然后降低温度，使引物分别与待扩增DNA片段的两条链配对结合，称退火，当降到某一温度时，引物分别与待扩增DNA片段的两条链配对结合，这一温度称退火温度Tm，Tm的经验公式：4X（G+C）+2X（A+T）；DNA聚合酶需要一小段双链DNA来起始合

23、成，引物分别与待扩增DNA片段的两条链配对结合，形成DNA合成的起始点；提高温度至TaqDNA聚合酶的最适温度72oC，TaqDNA聚合酶从起始点开始，以单链为模板合成新的DNA互补链；新合成的DNA链从两个引物端开始，分别延伸并超过另一条链上的另一个引物位置，因此新合成的DNA链上也有两个引物结合位点。493）PCR反应过程包括以下3个方面：变性。这是PCR反应的第一步，即将模板DNA置于94的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；退火。将反应体系的温度降低至退火温度Tm，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；延伸。将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72，

24、然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。经过n个周期循环以后，理论上可获得2n个双链DNA分子。50引物与模版配对延伸得到新的DNA第二轮复制第三轮复制聚合酶链反应示意图。目的片段呈指数极扩增51PCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期524）TaqDNA聚合酶与PCR最初，PCR用的是大肠杆菌E.coliDNA聚合酶，这种酶是热敏感的，在双链DNA94oC解链时被破坏，因此每个循环都要用手工重新加酶，造成操作繁琐、反应低效和费用增加。后来发现温泉中的细菌DNA聚合酶能在高温下很好地工作，这个发现推动了PCR的发展。水生嗜热菌（The

25、rmusaquaticus，简称Taq）生活在75oC温泉中，它的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）的最适反应温度是72oC，并且在94oC也相当稳定。因此，TaqDNA聚合酶只需在反应开始时，加一次就能在整个扩增循环中保持活性。这样，就可通过编程控制PCR循环仪的反应温度和反应时间，使PCR完全自动化。532、可变数目串联重复序列（VNTR）多态性：VNTR是由一些头尾相连的短序列以串联方式重复多次形成。这些序列如果有功能现在尚不清楚，但一个元件中的重复单位数量（即元件的总长度）在同源染色体中经常变化。在这种情况下，任何限制性酶切割这个串联重复序列的两侧将会产生一个片段，而其长度反映出VNT

26、R的大小。因为这个重复序列的总长度在不同染色体之间变化很大，可能存在很多数量的等位基因，这一特点使这些多态性非常有用。下图显示了一例VNTR多态性。探针1对应于此特殊VNTR多态性独有的DNA片段，因此利用DNA印迹只能检测此单一位点。检测了3个个体，所有这三个个体在这个基因座都呈现杂合性。探针2与VNTR多态性本身的串联重复序列配对。因为同样的串联重复序列为许多散布于基因组中的不同VNTR多态性，探针2在DNA印迹中将从这些众多多态性中检测到许多带谱。利用探针2这样的重复性探针检测到的复杂带谱同时显示出许多多态基因座，因此在两个个体很少一样。这种带谱称DNA指纹。这种DNA同一性分析在亲子鉴

27、定和法医学中已经广泛应用。54VNTR高度多态，两个非亲缘个体携带相同的两个等位基因的机率非常低，经常小于1%。通过检测4个或更多这种独立的多态性，任何两个非亲缘个体相同的机率非常低，除非是单卵双子。55利用单个探针检测大量分散于基因组内VNTR多态性的DNA指纹分析。每对样品代表卵生儿的DNA。B两个卵生儿和C两个卵生儿都完全配对，表明他们都是单卵双生子；A和D是异卵双生子。异卵双生子之间有大约一半可变谱带相同，与一级亲属一样。56VNTR多态性和法医学DNA分析图左DNA印迹分析显示独特DNA探针检测单个VNTR位点，与前面图中探针1相似。被害者（V）与嫌疑犯（S）的DNA显示了不同的谱带

28、。从犯罪现场采集的物证制备的DNA与嫌疑犯的DNA谱带吻合。从各种VNTR等位基因在总人群中的频率就可估计出吻合嫌疑人的概率。通过对许多不同的VNTR多态性进行相似的分析，这种吻合的概率就会非常低。图左DNA印迹分析是同时用了4个不同的单个位点特异VNTR探针。提取的物证与嫌疑犯之间的结果完全吻合。目前的法医学分析通常采用至少四种独立的、高度多态的VNTR标记。573、简单序列重复（SSRs）多态性：因为大多数VNTR的重复区可长达数千bp，标准PCR很难扩增到如此长度。因此VNTR通常必须用DNA印迹分析。简单序列重复（SSRs）多态性，又称微卫星多态性，虽然这类多态性也含有串联重复序列，但

29、基本的重复单位非常短，通常只有2、3、或4个碱基对（分别为2、3和4核苷酸重复），是高度多态性DNA标记，可用PCR分析，更适合于大规模DNA分型。这种PCR直接分析法也被称为广义上的DNA指纹图，在法医学中至少扩增6个DNA等位片段。值得说明的是，在利用DNA指纹图协助破案的过程中，简单序列重复PCR比VNTR的优越性除了体现在省时、简便和所需原始样本极少外，还在于有时简单序列重复PCR分析法是必须的。这是因为VNTR分析一般要求试样中的DNA是完整的，不能有断裂发生，否则DNA指纹图上的大小不一的片段就不真实了，可能使真凶漏网。而现场采取到的样品由于各种原因，其中的DNA往往可能已被部分降

30、解，因而是不完整的，这时就必须用简单序列重复PCR分析法。58在人类基因组特定位置还存在大量CA二核苷酸串联重复序列,高度多态:父亲GTCGTACGTGA(CA)10GTACGATACGT42bp,纯合母亲GTCGTACGTGA(CA)12GTACGATACGT46bpGTCGTACGTGA(CA)9GTACGATACGT40bp,杂合儿子GTCGTACGTGA(CA)10GTACGATACGT42bpGTCGTACGTGA(CA)9GTACGATACGT40bp杂合父亲42bp母亲46、40bp儿子42、40bp594、单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP）广泛分布于人类全基因组，最大限度地

31、代表了不同个体之间的遗传差异，是研究复杂疾病、药物敏感性及人类进化的重要标记。60在DNA上位置比较接近的很多SNPs，会组成单体型块并作为一个整体遗传。通过少数的几个标记SNPs，可以识别出不同的单体型块。61SNP之间是有关联的，把其中最有代表性的、每隔一定距离的有代表性的SNP取出来，做成的图谱就称为单倍型图谱，这对于将来研究人类疾病，尤其是多基因疾病非常有用。单基因病通过定位克隆这条路已经走通，但多基因病是更为复杂的系统，实际上是相当多的基因组结构功能发生微小的变化，其协同作用的结果造成对某些疾病的易感。因为多基因病发病率高、危险性大，所以是医学遗传学中的重中之重。621.ATCCTG

32、TACCTACGTGTACAATAGTA.CTGATCA TCTCTATGGG.2.ATCCTGTTCCTACGTGTACAATAGTA.CTGATCATCTCTATGGG.3.ATCCTGTACCTACGTGTACAATAGTA.CTGATCA GCTCTATGGG.123SNP1SNP2单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPs）632002年的10月28日，在美国华盛顿宣布正式启动了HapMap计划。2003年11月1日，发布 第一次公共数据，公布了可供公众下载的145,554 SNP 位点的超过一千三百万的分型数据，以及相关基因型频率和实验数据。642005年10月26日，历时3年，总投

33、资超过1.4亿美元，针对100多万个常见SNP位点进行了分型检测的人类基因组单体型图在美国宣布绘制完毕。2005年3月，完成第一阶段（在270个个体中对60万个常见的SNP进行基因分型），并开始第二阶段（在相同的样品中对225万额外的SNP进行基因分型）的工作。65这个计划有美、英、日、加、中、尼日利亚6个国家参与，其中，美国完成31%，日本完成25%，英国完成24%，加拿大完成10%，中国大陆、香港和台湾合作完成10%。66样本来源国际HapMap计划分析祖先来自非洲、亚洲和欧洲人群的DNA样品。科学家共搜集了270名志愿者的DNA样本，这些DNA样品被转化成细胞系并贮存在非赢利的Corie

34、ll医学研究所。67这些志愿者分别来自尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人（缩写：YRI）30组样本，每组包括父母和他们的一个成年孩子（这样的一组样本被称为一个三体家系）日本东京的日本人（缩写：JPT）45个不相关个体中国北京的汉族人（缩写：CHB）45个不相关个体CEPH样品（祖居北欧和西欧的美国犹他州居民）（缩写：CHB）30组三体家系6869HapMap的构建分为三个步骤：（a）在多个个体的DNA样品中鉴定单核苷酸多态性（SNPs）；（b）将群体中频率大于1%的那些共同遗传的相邻SNPs组合成单体型；（c）在单体型中找出用于识别这些单体型的标签SNPs。通过对图中的三个标签SNPs进行基因分型，研究

35、者可以确定每个个体拥有图示的四个单体型中的哪一个。70（三）DNA多态性与个性化医疗在现代医学发展史上，人们大致经历了三次革命。第一次医学革命主要是发现和描述疾病，并试图用现代科学来解释、查明疾病的病因；第二次医学革命是探明疾病发生的分子机理，即采用生物化学、生物物理等一系列新兴学科知识，从分子水平上揭示疾病的起因，并由此开发出针对某一类疾患的特效药，我们今天仍处于这一革命的高峰。第三次医学革命是1990年代中期出现的医学个性化医疗的新趋向，随着分子生物学，特别是人类基因组研究的不断深化，人们认识到疾病的发生、发展往往与患者特定的遗传背景有关。为此，在今后的疾病诊断和治疗中，医生将更多考虑患者

36、的遗传背景。71研究环境因素对人体健康的影响疾病易感性个体对环境致病因素的易感性有着很大的差异，因此患病的概率也不同统计数字表明，中国人患肝癌的比例大大高于其他种族，即使移居海外已经几代的华人，其患肝癌的比例仍明显高于其他民族人群。反过来，白人中皮肤癌的罹患率相当高，而中国这一病症的发生率则低到可以忽略不计。72日本是胃癌高发区：Japanese:1.00BorninJapan:0.72BorninUSA:0.38USwhites:0.1773正常人体细胞中有癌基因和抑癌基因。癌基因对维持细胞正常生理功能是必需的。当癌基因突变激活或抑癌基因突变失活，就会引发肿瘤。74化学诱变剂和辐射会损伤DN

37、A，使癌基因和抑癌基因发生突变。细胞中有一部分代谢酶灭活诱变剂，由于遗传变异，有的人这部分代谢酶活性低，就较易得肿瘤，编码这部分活性低的代谢酶基因就成为肿瘤易感记基因；75相反，有的诱变剂需另一部分代谢酶活化，编码这部分活性高的代谢酶基因就成为肿瘤易感记基因；细胞中有一系列修复DNA损伤的酶，编码活性低的修复酶基因，就成为肿瘤易感记基因。76因此，肿瘤的发生就和许多编码代谢酶、DNA损伤修复酶的基因有关，还和环境化学、物理因素有关，为多基因病。77例如对于某种肿瘤，与其发生相关的基因有许多（代谢酶基因、DNA损伤修复基因），SNP也有许多，根据大量的文献报道，进行综合分析，选取差异显著的一些S

38、NP位点进行检测，就可以作出风险评估。78个体对药物的敏感度个体化用药目前，正在兴起的药物基因组学研究遗传因素对药物作用的影响和不同基因型个体对药物反应的差异，从而为临床有针对性地合理用药，及根据不同基因型群体对药物的反应来改进药物设计提供了理论依据，促进了个体化用药的进程。79伊立替康（irinotecan）是治疗结直肠癌的化疗药，由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT1A1）代谢。伊立替康有严重的副作用：白细胞减少和严重腹泻。2005年8月美国FDA批准第一例通过检测UGT1A1多态指导伊立替康剂量。80UGT1A1野生型在启动子TATAbox区域6个TA重复，变异体UGT1A1*28是7个

39、TA重复，导致活性降低。81硝酸甘油是治疗心绞痛的特效药。线粒体醛脱氢酶2（ALDH2）负责NO的形成，而后者是硝酸甘油发挥作用所必需的。ALDH2第12个外显子在中国人中存在GA多态，导致第508位氨基酸由谷氨酸变成赖氨酸，而使ALDH2失效。研究表明，在80个中国病人中，有21个对硝酸甘油无效。82Gefitinib（吉非替尼），商品名商品名：Iressa（易瑞沙），生产公司生产公司：AstraZeneca（阿斯利康）在人类多种上皮细胞源性的肿瘤组织中都存在EGFR（表皮生长因子受体）的异常激活，使其正常功能失控，从而引起细胞异常增生和转移。已知多种实体瘤，如非小细胞肺癌（NSCLC）和头

40、颈癌、结肠癌、乳腺癌等的发生都与肿瘤组织中EGFR的异常活化有关。83Gefitinib抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR-TK）活性，截断EGFR生成信号传递至细胞内，从而遏止细胞的异常增生和转移，起到抗肿瘤作用。Gefitinib只对表皮生长因子受体基因突变肿瘤有效。84非小细胞肺癌（NSCLC）中研究表明：突变在腺癌中比其它NSCLC中频率高（15/70or21vs.1/49or2）；在女性中比男性中频率高（9/45or20vs.7/74or9）；在日本患者中比美国患者中频率高（15/58or26，腺癌中14/41or32vs.1/61or2，腺癌中1/29or3）。在日本女性腺癌

41、患者中基因突变频率最高（8/14or57）。85两年前，西班牙已在临床上试验性推广个性化治疗，采用的也是基因技术西班牙妇女玛尔塔和罗莎同时被诊断出患了乳腺癌，经过治疗病情得到控制。但是医生给她们使用了不同的药物。玛尔塔用的药物叫Trastuzumab，重组DNA人单克隆抗体。而罗莎使用的是Gefitinib，一种专门用来治疗顽固性家族遗传乳腺癌的药物。她们两人患上乳腺癌的病因完全不同，因而医生针对其各自病情采用了不同的药物。对玛尔塔和罗莎来说，医生治愈的不是“通常”的癌症，而是属于“她们”自己的癌症。86目前已知人类表皮生长因子受体2（HER2）是目前认识较为清楚的与乳腺癌关系密切的人类癌基因

42、，它在乳腺癌中的高表达往往预示着雌激素受体（ER）阴性、易有淋巴结转移和肿瘤分化差，预后不佳。随着对HER2研究的深入，它已经成为乳腺癌特异性治疗的靶分子之一。87已被FDA批准的曲妥珠单抗（Trastuzumab）是重组DNA人单克隆抗体。曲妥珠单抗选择性作用于HER2，具有高度亲和力，具有高度靶向性，只对癌细胞起作用，而对正常细胞的杀伤较小，是当代乳腺癌靶向治疗的代表性药物。88基础研究表明，约有2530的乳腺癌患者HER2有基因改变，促使肿瘤细胞HER2增加。曲妥珠单抗可选择性地与HER2牢固结合，抑制癌细胞的增生，适用于HER2过度表达的乳腺癌患者。人类全基因组关联分析GenomeWi

43、deAssociationStudies(GWAS)什么是什么是GWAS?一种确定遗传与表型(如血压、体重等)或与某种疾病(或生理状态)的全基因组范围的关联性分析研究快速的扫描被研究人群的全基因组DNA，寻找与特定表型或疾病相关的基因差异发现新的基因关联，将有助于发展更为可靠的方法来诊断，预防和治疗疾病对常见的多基因复杂疾病尤其有效，例如癌症，糖尿病，心脏病等GWAS实施的前提2003年人类全基因组测序完成，2005年Hapmap计划使我们得以研究常见疾病的遗传分布人类基因组序列和多态性图谱的计算机化数据库建立生物技术的进步让基因分型变得快速，成本也大大降低GWAS的应用前景推动医疗行业从现在

44、的普适性治疗向个性化治疗发展为健康个人评估特定疾病的患病风险，为特定遗传背景的人制定个性化的疾病预防计划为已经患病的个体选择疗效最好，副作用最小的治疗方案GWAS的基本设计需要两个被研究人群，分别为患病人群和健康人群，同时获取两个人群的DNA样本（常见方法为血样和口腔上皮细胞）从样本中提取出基因组DNA，然后在自动化的机器上对不同的基因标记进行分型，基因标记分很多种，主要是单核苷酸多态性（SNP）如果某种基因标记在患病人群中出现频率显著高于健康人群，即认定它和研究的疾病“关联”关于研究人群的不同设计GWAS的部分现有成果2005年，三个独立的研究同时发现人类补体因子H（一种炎症调控因子）基因上

45、的多态性和一种失明（与年龄相关的黄斑退行性改变）的强烈关联一个法国人群的研究(包括对非肥胖性糖尿病患者)发现一种编码胰腺转运锌蛋白的基因剪接本与II型糖尿病发病风险的增加有关。三份同期发布的报道在对超过32000名参与者的研究中发现了4个新的与糖尿病相关的基因变异,使我们已知的II型糖尿病非孟德尔遗传风险因素达到10个。这些发现强有力地表明了胰腺细胞是这种发病日益增加的根源所在。研究类风湿性关研究类风湿性关节炎的节炎的GWAS研究包括1522个患病者，1850个健康对照，结果显示三个基因的多态性和类风湿性关节炎的发病风险是显著关联的，分别是PTPN22，MHC，TRAF1-C5GWAS还存在的

46、局限假阳性问题，部分鉴定为“关联”的基因只是与致病基因紧密连锁出现频率很低的多态性需要非常大的样本量目前的高通量基因分型技术还存在误差研究人群信息不全导致无法研究基因-环境的相互作用评价一个GWAS是否合理的标准GWAS的国际数据库美国国家生物技术信息中心（NCBI）已经开始建立网上数据库，收录已经发表的关联分析研究成果，方便研究人员检索101（四）疾病相关基因的定位与克隆1、功能克隆：从疾病出发，鉴定功能蛋白质，从蛋白质再鉴定、克隆致病基因的方法，称为功能克隆。102功能克隆功能克隆克克隆隆（致致病病）基基因因的的一种策略。一种策略。收收集集所所要要克克隆隆的的基基因因的的蛋蛋白白质质产产物

47、物及及其其功功能能的的信信息息，用用以以分分离离基基因因，并并对对基基因因进进行行定位。定位。性状（疾病）蛋白质产物（生物学功能）从氨基酸序列出发设计DNA引物，从文库调取基因得到基因序列染色体定位疾病疾病功能功能基因基因103 分析异常基因的产物（蛋白质），分析异常基因的产物（蛋白质），纯化蛋纯化蛋白质，进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核白质，进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从苷酸序列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA文库中筛选对应的编码基因。文库中筛选对应的编码基因。从细胞中提取从细胞中提取mRNA,建立含有大量建立含有大量 cDNA的的集

48、合体，并将它们连接、克隆到特殊的载体中，集合体，并将它们连接、克隆到特殊的载体中，这个这个cDNA克隆的集合体就称为克隆的集合体就称为cDNA文库。文库。104 直到直到20世纪世纪80年代，研究人类医学遗传学的年代，研究人类医学遗传学的科学家只能通过仔细分析患者疾病的病理生理学科学家只能通过仔细分析患者疾病的病理生理学期望发现易感基因。血红蛋白基因突变引起血红期望发现易感基因。血红蛋白基因突变引起血红蛋白病是第一个在分子医学遗传学水平定性的人蛋白病是第一个在分子医学遗传学水平定性的人类疾病。血红蛋白病特别便于研究，因为疾病的类疾病。血红蛋白病特别便于研究，因为疾病的病理学可以定位于红细胞，相

49、应的血红蛋白可以病理学可以定位于红细胞，相应的血红蛋白可以通过收集外周血得到。通过收集外周血得到。105 绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白化病、苯丙酮尿症和如白化病、苯丙酮尿症和黑尿病等，都是采取的等，都是采取的这一策略。不幸的是，这种方法仅能用于有限的、这一策略。不幸的是，这种方法仅能用于有限的、可以直接测定生化缺陷的人类致病基因。可以直接测定生化缺陷的人类致病基因。1062、定位克隆：到20世纪80年代后期，现代分子医学遗传学强有力的手段，使仅通过图谱位置定位人类疾病易感基因成为可能，而不必借助任何功能信息。这种方法称为定位克隆。疾病染色体定

50、位基因序列mRNA蛋白质/生物学功能107定位克隆定位克隆又称为又称为“逆向遗传学逆向遗传学”，始于，始于2020世纪世纪8080年代后年代后期期利用遗传连锁或细胞遗利用遗传连锁或细胞遗传学定位技术将致病基传学定位技术将致病基因定位于染色体的特定因定位于染色体的特定区带。区带。定位定位：通过连锁分析找：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的遗传标记在染色体上的位置。的位置。克隆克隆：从定位的染色体：从定位的染色体区段内分离克隆所要的区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其基因，并进一步研究其功能。功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质