猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测多重反转录聚合酶链反应地方标准编制说明.docx

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1、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测多重反转录聚合酶链反响地方标准编制说明一、工程背景、来源及目的1、工程背景猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)可以引起以母猪的繁殖障碍及各种年龄猪 特别是仔猪的呼吸道病症为特征的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)O该 病最早于19XX年在美国首次发生，现已呈世界性分布。我国最早于 1996年别离到美洲型PRRSV, 20XX年别离到美洲型PRRSV高致病 性变异株，20XX年别离到病性欧洲型PRRSVo多年来，PRRSV是 我国猪群中最重要病原之一，给我国

2、养猪业造成了巨大的经济损失。 PRRSV分为两个基因型，即以VR-2332株为代表的美洲型和Lelystad virus (LV)为代表的欧洲型，其基因组核甘酸序列的同源性仅为60 % 左右。PRRSV属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员， 为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组大小为15 kb左右，包含9 个开放阅读框。目前，在中国流行的PRRSV以美洲型毒株为主，但 也有欧洲型PRRSV致病的报道。PRRSV流行毒株的多样性，是PRRS 的监测、诊断和防控面临新的严峻挑战。猪瘟(Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fe

3、ver virus, CSFV)引起猪的一种高度接触性急性传染病，以高稽留 热、出血、梗死、坏死和高死亡率为主要特征。CSFV属于黄病毒科 株pMLV、美洲型PRRSV变异株JXA1-R和CSFV的cDNA混合物 为模板，在优化后的反响条件下，进行多重PCR,分析其重复性。(8)临床样品检测应用所建立的多重RT-PCR检测方法对采集的106例病猪的肺脏、 脾脏、肾脏、淋巴结等组织病料进行检测，以验证该方法检测临床样 品的可行性。3、结果(1)特异性试验结果如图1所示,CSFV在508 bp、欧洲型PRRSV在614 bp、美洲型PRRSV 经典毒株在338 bp、美洲型PRRSV变异毒株在24

4、8 bp处有特异性扩 增条带，而阴性对照以及FMDV、PPV、PRV、BVDV的临床阳性 病料均无扩增条带出现。说明，所建立的多重RT-PCR方法具有良 好的特异性。M 123456789 10图1多重RT-PCR特异性试验结果M： 100 bp DNAMarker； 1：阳性对照；2： p-EU-ORF567； 3： CSFV； 4： PRRSV CH-1R株；5： PRRSV JXA1-R株；6： FMDV； 7： PPV； 8： PRV； 9： BVDV； 10：阴性对照（2）敏感性试验结果单重PCR敏感性：单重PCR结果见图2。引物 EU-ORF5-F/EU-ORF5-R 检出下限为

5、103 copy/uL （图 2-1）；引物 NS2-F/NS2-R 检出下限为 及 copy/uL （图2-4 ）；引物 AM-Nsp2-F/AM-Nsp2-R检测美洲型PRRSV经典株与变异株的检出 下限均为 102 copy/uL （图 2-2、2-3）。多重PCR敏感性：分别将同一浓度梯度的4种cDNA （质粒）等 体积混合，获得不同稀释度的混合液，以此为模板进行多重PCR扩 增，结果见图3。各对引物的检出下限均为103copy/uL。2-2bp2614tp56789 IO33Bbp2-35Q8bpbp300200图2单重PCR敏感性试验结果M： 100 bp DNA Marker；

6、1 9:模板浓度分别为 109-101copy/uL; 10：阴性对照M1 23 456789 10图3多重PCR敏感性试验结果M： 1 OObp DNA Marker； 19：混合模板浓度分别为 10。okopy/uL； 10：阴性对照(3)重复性试验结果以欧洲型PRRSV阳性质粒p-EU-ORF 567、以及美洲型PRRSV经典 株pMLV、美洲型PRRSV变异株JXA1-R和CSFV的cDNA混合物 为模板，在优化后的反响条件下，进行多重PCR。结果，所进行的5 次重复试验均能扩增出均匀一致的目的片段(图4),具有很好的重 复性。1500bp1000bp7OObp 6OObp 5OObp

7、 400bp 300bp2OObp1OObp1500bp1000bp7OObp 6OObp 5OObp 400bp 300bp2OObp1OObpM 12 3 4 5614bp508bp338bp248bp图4多重PCR重复性试验结果M： lOObp DNAMarker； 1-5：相同条件的5次重复反响(4)临床样品检测结果利用所建立的多重RT-PCR方法对采集的106例病猪的肺脏、脾脏、 肾脏、淋巴结等组织病料进行检测。结果，CSFV和PRRSV变异株 混合阳性4份，占3.77%(4/106)；PRRSV变异株阳性17份，占16.04%(17/106)； CSFV阳性7份,占6.60% (7

8、/106)；局部临床样品检测结果见图4,其中2号、6号、7号、8号样品为CSFV和PRRSV变 异株混合阳性，3号为CSFV阳性，4号、5号和11号为PRRSV变 异株阳性，9号、10号临床样品，12号为阴性对照。-508-508248bp700600500*400300-*200图4局部临床样品的检测结果M： lOObpDNA Marker； 1：阳性对照；211：临床样品；12：阴性对照五、与现行法律、法规和有关标准的关系目前，国内没有应用多重RT-PCR方法检测和诊断PRRSV和CSFV的 国家标准、行业标准或地方标准。本标准制订的条款没有与现行的法律、法规以及有关的国家标准、行 业标准

9、中任何条款相矛盾。六、采用国际标准或国外先进标准的情况以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新, 使之具有先进性。七、主要反响意见的处理情况形成标准征求意见稿后，分别向来自高等学校、科研院所、出入境检 验检疫机构、动物预防控制机构的10位专家征求意见，具体名单如 下：序号姓名职称工作单位1XXX教授省大学2XXX教授XX农业大学3XXX研究员中国农业科学院XX畜牧兽医研究所4XXX研究员省兽医研究所5XXX研究员中华人民共和国XX出入境检验检疫局6XXX研究员中华人民共和国省出入境检验检疫局7XXXXXX研究员省标准技术研究院8XXX高级兽医师省动物疫病预防控制中心9XXX

10、研究员XX市动物疫病预防控制中心10XXX高级兽医师XX市动物疫病预防控制中心专家们认真审核后，提出了不少修改意见。经课题组仔细梳理，共获 得修改意见52条。经认真研究，采纳其中32条，未采纳20条。未 采纳的主要原因是GB/T1.1从2010年开始实施，我们按照新国标的 要求进行撰写和编排，因而对局部专家就征求意见稿中编排方面的意 见未予采纳。八、地方标准作为强制性地方标准或推荐性地方标准的建议本项标准的制订，已经实验室和临床实践的验证，可作为推荐性 地方标准，用于PRRSV和CSFV的检测。九、贯彻地方标准的要求和措施建议1、加大对基层单位的宣贯和培训力度。2、加大投入，争取推出商品化的，

11、且经过标准化的诊断试剂盒，便 于基层单位使用。3、争取升格为国家标准或行业标准，满足全国需要十、其他应予说明的事项无。瘟病毒属的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组大小为 12kb左右，包含1个开放阅读框。长期以来，我国实行猪瘟疫苗强 制免疫政策，使猪瘟得到了有效控制，但由于疫苗质量不稳定、免疫 程序不合理、防疫措施不当等原因，猪瘟仍时有发生，每年因猪瘟死 亡的猪只约占病死猪只的1/3,猪瘟仍是危害我国养猪业开展的头等 疫病。对CSFV的及时监测及准确诊断对有效防控CSF显得格外重 要。PRRS和CSF均为我国一类传染病，两者在临床病症和病理变 化上不易区分。同时，两者在临床上的混合感

12、染、继发感染也比拟常 见。而且，两者与伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）等重 要病原所致的某些病症也难以区分。因此，建立和制定PRRSV和 CSFV的快速鉴别诊断技术规程，快速、准确地进行诊断，为正确处 置和防控这两种疫病，将损失减少到最低限度，对确保我区畜牧业持 续、稳定和健康开展具有重要意义。当前，单重RT-PCR检测方法已作为CSFV和PRRSV检测的国 家标准。应用多重RT-PCR方法同时检测PRRSV和CSFV的文献国 内外均有报道，但没有归纳总结形成地方标准、行业标准或国家标准。 20XX年以来，我单位在完成省青年科学基金工程高致病性猪繁殖 与呼吸综合征病毒分子流行病学及

13、快速诊断方法研究（编号：桂科 青0832057,主持人：施开创）的过程中，根据我区重大动物疫病监 测、检测的需要，研制、开发了 PRRSV和CSFV多重RT-PCR检测 方法，并用于临床检测，效果显著。该方法经实验室验证及临床反复 应用，证明具有快速、准确、特异、敏感、高通量、无污染等优点, 有关论文已被国家级核心期刊中国预防兽医学报、动物医学进展 录用、发表，获得国内同行的认可。2、工程来源本地方标准为省质量技术监督局下达给省动物疫病预防控制中 心承当的20XX年第十二批省地方标准制定（修订）计划工程（X质 监函20XX 884 号）,编号为 20XX-12005。3、工程目的目前用于检测C

14、SFV和PRRSV的方法主要有病毒别离、免疫过 氧化物酶单层细胞试验（IPMA）、免疫荧光试验（IFA）和RT-PCRo 由于RT-PCR检测方法快速、准确、敏感、操作较简便，易标准化, 多数基层单位均具备开展条件，易于推广应用。但能够同时检测和区 分美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法迄今 尚无国家标准、行业标准或地方标准，所以，建立一种同时检测和区 分这3种病毒的方法十分必要。因此，本工程制定了检测美洲型 PRRSV、欧洲型PRRSV和CSFV的推荐性地方标准，内容涵盖应用 多重RT-PCR方法检测美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和CSFV的材 料准备、操作

15、方法及结果判定等。二、工作概况从20XX年5月开始，我单位承当了省青年科学基金工程高致 病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学及快速诊断方法研究。 课题组在PRRSV和CSFV的快速鉴别诊断方法上开展了大量研究工 作,取得较好成果。根据国内检测和诊断PRRSV和CSFV多重RT-PCR 检测方法尚无国家标准、行业标准及地方标准的实际，课题组开展了 相关资料的工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制订 省地方标准工程建议书，积极开展标准的申报。20XX年10月接到 省质量技术监督局下达的地方标准制定（修订）工程计划的通知后, 迅速成立标准编制课题组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并 积极组织

16、实施。至11月30日已完成标准初稿的编写。至12月31日 完成测试和验证工作。20XX年1月15日已按GB/T 1.1标准化工 作导那么第一局部：标准的结构和编写规那么要求完成标准征求意见 稿的编写工作。经过课题组全体成员反复研讨、修改和校对，形本钱 标准征求意见稿。本标准编制课题组人员包括：XXX等。具体分工如下：XXX：组长。负责标准的提出、起草、审定、申报。XXX：负责标准的起草、校正、外联。XXX：负责标准的起草、校正。XXX：负责标准的实验室及临床验证。XXX：负责标准的实验室及临床验证。XXX：负责组织标准的校正、审定。三、标准编制原那么1、政策性原那么：本标准编写过程遵循国家相关

17、法律、法规和国家标 准。2、先进性原那么：以国内外相关文献资料为参考，力求反映最新的科 技成果；以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充 实和创新，使之具有先进性。3、经济性原那么：在本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室和 临床验证到形成征求意见稿的每一个环节，在确保质量的前提下均力 行节约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写任务。4、适用性原那么：本标准集国内外PRRSV和CSFV RT-PCR检测技 术的成功经验，并经实验室和临床验证，完全按照要求编写，内容全 面，形式规范，可操作和实用性强。5、协调统一性原那么：本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方 法，力求与国内相关标

18、准的协调统一。本标准通过持续查新，确保内 容不与已有的国家标准、行业标准和地方标准重复或相矛盾。6、规范化原那么：本标准是严格按照GB/T 1.1的要求来编写的。四、标准主要内容及依据本标准是动物疫病防控地方标准，编写重点是疫病的检测。标准 的主要依据是借鉴国内先进的标准和技术内容，参考国内外有关文献 资料，结合我国国情，进行实践研究，并通过实验室试验和临床验证 后提出。标准编写的主要内容包括样品的采集、处理、RT-PCR操作过程 以结果的判定，适合于PRRSV和CSFV多重RT-PCR检测。标准的建立过程主要进行了以下试验：1、试剂和材料(1)主要试剂1 mol /L PBS (pH7.2)

19、缓冲液；Mini BEST Viral RNA/DNA ExtractionKit Ver.4.0 (包含RNA抽提所需的除1 %冰乙酸异丙醇以外的全部试剂)；两步法 RT-PCR 试齐U盒(包含了 RT-PCR扩增所需全部成份)。(2)参考毒株和RT-PCR引物序列分别见表1和表2。表1试验用毒株/质粒及其来源毒株名称来源CH-1R疫苗株哈维科生物科技JXA1-R疫苗株广东大华农动物保健品股份P-EU-ORF567 质粒中国农业科学院北京畜牧兽医研究所猪瘟C疫苗株广东永顺生物制药表2引物序列及扩增片段长度引物名称引物序列(57)扩增长度/bpAM-Nsp2-F5GGCGRCR ATGTCCC

20、T A ACRGTT3248或338AM-Nsp2-R5 f-GCCTCATATTCMGTCTGTG-3EU-ORF5-F5，-CR ATG AGGTGGGC Y AC A ACC-3614EU-ORF5-R5，-T ATGTR ATGCTA A AGGC W AGC AC-3NS2-F5 LGCTCCTGGTCGG A A ATCTTG-3508NS2-R5，-TG ATGCTGTC AC AC AGGTG A A-3(3)样品省动物疫病预防控制中心从20XX年至20XX年从省各地采集的106例PRRS和/或CSF疑似病猪的肺脏、脾脏、肾脏、淋巴结等组织。2、方法(1)样品前处理无菌采取肺脏

21、、脾脏、肾脏、淋巴结等各约2 g,置于乳钵或玻 璃研磨器中，充分研磨，加入16 mL灭菌的1 mol / L PBS (pH 7.2), 收集组织悬液，反复冻融3次。以3 000 x g离心5 min,收集上清, 用于总RNA抽提，或置-20。保存备用。购买的弱毒疫苗，每瓶加入2 mL灭菌的1 mol/LPBS(pH7.2) 充分溶解。以3 000 xg离心5 min,收集上清，供总RNA抽提，或 置-20 保存备用。(2)待检样品总RNA提取取处理过的待检样品上清200 pL置于无RNA酶的1.5 mL离心 管中，力口入200 |liL Solution A,剧烈震荡混匀，室温放置5 min

22、；加 入 75 1HLsolution B,轻柔混匀后，12 000 r/min 4 离心 5 min。将 上述操作的上清液转移至新的离心管中，加入250 1nL含1 %冰乙酸 的异丙醇，混匀。将试剂盒中的Spin column安置于2 mL的离心管 中。将混合液转移至Spin column中，12 000 r/min 4 离心1 min, 弃滤液。将 500 pL 的 Rinse A 加入到 Spin column 中，12 000 r/min 4 离心1 min,弃滤液。再将800 pL的Rinse B,加入到Spin column中， 12 000 r/min 4离心1 min,弃滤液。

23、重复离心Spin column一次，以 充分甩干Spin column上残留的液体。将Spin column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin column膜的中央处加入50 jliL的ElutionBuffer,室温静置 1 mino 12 000 r/min 4 离心 1 min 洗脱病毒 RNA。取4rL总RNA样品进行RT-PCR,或置-20 保存备用。(3) RT反响体系在冰浴条件下，按下表中各试剂用量在PCR反响管中分别加入各成分：用量终浓度1 pL1倍1 pL1mmol/pL0.25 mL1U/pL0.5 pL0.25 U/pL2 |iiL5mmol/pL0.5|iL2

24、.5 pmol/pL4pL试剂名称10 X RT-PCR BufferdNTP Mixture (10 mM each)Rnase Inhibitor (40 U/pL)AMV Reverse Transtriptase (5 U/pL)Mgch (25 mM )Random 9 mers (50 pmol/pL)待检总RNA模板加灭菌双蒸水至总体积为10 pL加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于PCR仪内，按以下循环条件进行RT反响：30 , 10 min；42 , 30 min；99 , 5 mino(4) PCR反响体系在冰浴条件下，按下表中各试剂用量在PCR反响管中分别加入各成分

25、：试剂名称用量终浓度10 X RT-PCR Buffer5 pL1倍AM-Nsp2-F/AM-Nsp2-R (25 pmol/juL)各2.5 pL1.25 pmol/pLEU-ORF5-F/EU-ORF5-R(25 pmol/pL)各1 pL0.5 pmol/pLNS2-F/NS2-R(25 pmol/pL)各1 ML0.5 pmol/pLTaKaRa Ex Taq HS (5 U/pL)0.3 |iL0.03 U/pLRT反转录产物5 pL灭菌双蒸水：补足至总体积为50 |jL加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于PCR仪内，按以下循环条件进行PCR扩增：94, 2 min；94 ,

26、30 s；57.3 ,30s；72 ,45 s；循环40次；72 , 10 min；4 结束反 应。PCR产物直接用于电泳，或置4 保存备用。（5）特异性试验分别用该方法对口蹄疫病毒（FMDV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂 犬病病毒（PRV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等临床阳性病料提 取RNA或DNA进行RT-PCR扩增,以检验该方法的特异性。（6）敏感性试验将浓度的欧洲型PRRSV阳性质粒p-EU-ORF567以及美洲型 PRRSV经典株pMLV、美洲型PRRSV变异株JXA1-R和CSFV的 cDNA分别做10倍系列稀释，使其浓度梯度为1010 -101 copy / uL。 取5叱为模板进行PCR,根据其能检测的最大稀释度判定RT-PCR 的最小检出量。（7）重复性试验以欧洲型PRRSV阳性质粒p-EU-ORF 567、以及美洲型PRRSV经典