实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展资料讲解.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展-实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展摘要：实时荧光定量技术是在反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来，实时荧光定量技术在植物检疫研究上不断深入，大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。关键词：实时荧光定量技术；植物检疫；植物病害flu

2、orescent（，）：，（）couldbemonitoredquantitatively，applicationofwasstudieddetectingt，wascomprehensivelydescribed：；实时荧光定量（，）技术是世纪年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。最早是由等于年提出来的，年由美国公司推出。与普通相比，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、定量准确等特点。过去实时荧光定量技术主要应用在医学诊断、新型农业、基础研究等领域，而在植物检疫中的应用相对较少，随着分子生物学的不断发展，特别是在检疫检验系统，实时荧光定量技术已经被广泛用来检测植物病

3、害，有效地遏制了国外有害生物的入侵，保证了生物入境安全。实时荧光定量技术原理实时荧光定量技术是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个技术进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量技术中有一个很重要的概念，即值。代表循环（），代表阈值（）。值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，值越小。因此，要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再利用分析软件获得未知样品的值，便能根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量技术检测方法该检测方法主要分为两大类：第

4、一类是使用特异的双链（）结合染料，常用的有和；第二类则是应用荧光标记探针，如探针、分子信标等，是建立在荧光共振能量转移原理（，）上的。荧光染料检测技术是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于双链结构的小沟中，非特异地与分子结合，是应用最广泛的非探针类化学检测物。当它与双链结合时发出荧光，荧光强度随着聚合反应的进行逐渐增加，便可被荧光探测系统检测到。但是由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。可以在结束时通过分析扩增产物的熔解曲线来排除非特异性扩增。探针检测方法水解探针主要是利用酶外切核酸酶活性，并在反应体系中加入一个荧光标记探针。探针的端荧光发射基团（羧基荧光素）

5、，端标记淬灭基团（羧基四甲基丹诺明）。该探针在过程中不能延伸。当探针保持完整时，根据原理，端淬灭基团抑制端发射基团的荧光发射；在的退火期，引物和探针同时与模板发生特异性杂交；延伸期，引物在酶作用下沿模板延伸，当到达探针处，酶发挥外切核酸酶活性，将探针切断。此时发射基团远离淬灭基团，荧光信号得以释放，荧光探测系统便会检测到荧光密度有所增加。模板每复制次，就有个探针被切断并伴有个荧光信号的释放。产物与荧光信号产生一对一的对应关系，随着产物的增加，荧光信号不断增强。当信号增强到某一阈值，此时的循环次数即为循环阈值（）。与体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系，利用不同标准模板扩增的值和标准模板数

6、经过对数拟合作图，制成标准曲线，再根据待测样品的值可以准确地确定起始模板的数量。实时荧光定量技术定量方法在实时荧光定量中，模板的定量有两种方法，即绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。实时荧光定量技术在植物检疫研究中的应用在真菌引起的植物病害检测中的应用年等首次将实时荧光定量方法应用于植物病理学研究，年有学者首次将该方法应用于植物病理真菌的检测。在我国，使用定量技术对植物病理真菌检测相对较晚，程颖慧等报道了小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光定量检测。章桂明等报道应用探针检测小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌，分别

7、建立了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌实时荧光单重和实时荧光双重检测方法。等使用实时荧光定量技术检测了罂粟携带霜霉菌引起的霜霉病。年四季等根据筛选的独有差异基因片段（）设计特异性引物对和探针，建立荧光染料法和水解探针法定量检测体系，均可成功鉴别出与小麦矮腥黑穗病菌，并可快速准确检测小麦矮腥黑穗病菌冬孢子和检测罹病小麦植株体内的侵染菌丝体。黄国明等设计了通用探针及引物和特异探针及共用引物，结合通用探针的单色荧光和特异探针的双色荧光两种方法，成功摸索出一种和的菌丝及单粒种子快速、稳定、可靠、特异性强的荧光检测方法，使检测时间由至少个月缩短至，而且检测灵敏度达到单粒种子。苏丹等成功建立了利用技术

8、对黑麦草中内生真菌感染状况的检测和定量分析方法，发现不同植株之间内生真菌含量差异较大。在细菌引起的植物病害检测中的应用植物病原细菌（p）主要类群有个属，除土壤杆菌（）、欧文氏菌属（）、假单胞菌属（）、黄单胞菌属（）和链丝菌属（）之外，革兰氏阴性菌增加了嗜酸菌属（）、根杆菌属（）、根单胞菌属（）、嗜木质菌属（）、泛生菌属（）和木质部小菌属（x）等；革兰氏阳性细菌则有棒形杆菌属（）、节杆菌属（）、短小杆菌属（）、红球菌属（）、芽孢杆菌属（）、布克氏菌属和韧皮部杆菌属等能引起多种农作物、园林观赏、经济作物及牧草上的病害。利用荧光定量技术准确成功鉴定的有柑橘黄龙病菌，、番茄溃疡病菌（）、柑橘溃疡病菌（

9、）、西瓜细菌性果斑病菌（）、梨火疫病菌（）1、水稻白叶枯病菌（），、玉米细菌性枯萎病菌（）4、苜蓿细菌性萎蔫病菌（）5、菜豆细菌性萎蔫病菌（）6、哈密瓜细菌性果斑病菌（）7、香蕉枯萎细菌性病菌（）8、马铃薯环腐病菌（）9等细菌的检测。植物病原细菌的传统检测方法主要是采用生物学和免疫学的方法，这种方法费时费力，而且准确率也不高。但实时荧光定量技术可以很好地解决这些问题，不仅有效地提高了检测速度和水平，而且灵敏度也比一般的检测方法高出倍左右。还有一个明显的优点是试验中不需要的后续处理及病原菌的分离培养，大大简化了试验操作步骤，缩短了检测时间。在病毒引起的植物病害检测中的应用植物病毒是仅次于真菌的一

10、类病原体，由于病毒对寄主的绝对寄生性，使其危害增大，同时防治又很困难，故病毒病有植物癌症之称。植物病毒的检测方法主要有生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法，其中检测最方便的莫过于实时荧光定量技术，它具有灵敏、快速和特异性强等优点。烟草环斑病毒（）为中国公布的第二类禁止进境检疫有害生物，郑耘等首次应用直接结合反转录实时荧光技术检测烟草环斑病毒。杨伟东等首次应用免疫捕捉反转录实时荧光技术成功检测烟草环斑病毒，由此解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、干扰物质存在而影响检测结果的问题，为植物病毒病原的快速、简便有效检测提供了一套科学的方法。闻伟刚等用实时荧光技术检测了齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒，用

11、这种方法从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。闻伟刚等建立了玉米褪绿斑驳病毒的荧光定量的检测方法，其灵敏度比普通高出倍。在线虫引起的植物病害检测中的应用松材线虫病是世界上四大林木病害之一，也是世界重要的检疫性有害生物。在我国松褐天牛是它的主要传媒昆虫。松材线虫病致病力强，寄主死亡速度快，传播也快，且常常猝不及防，一旦发生，则治理难度大。由于环境、气候和不同寄主的影响，在形态上存在一定的差异。现在发现除了从美国、日本等疫区检测出木质包装携带松材线虫外，一些非疫区国家也检测出松材线虫，口岸检疫工作形势严峻。实时荧光技术在口岸植物检疫工作中起到了很大的作用。王金成等用探针法对松材线虫进行了定量检

12、测，为口岸快速准确地鉴别松材线虫建立了行业标准。王翀等建立了鳞球茎茎线虫实时荧光的检测技术，整个检测过程只需要，能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。有学者应用探针进行马铃薯金线虫和白线虫实时荧光的研究，可高度灵敏地检测单个马铃薯金线虫的孢囊或幼虫，最高检测灵敏度达到，。龚艳清等建立了简单异尖线虫荧光定量技术方法，可用于简单异尖线虫的鉴定。结语目前实时荧光定量技术作为核酸定量的方法已经广泛地应用于植物研究，例如植物抗逆性研究，转基因植物检测，植物抗病性研究，植物发育学研究，环境对植物基因表达的影响。可见其应用的领域远比本研究涉及的范围要广得多。但是实时荧光技术也有其局限性，会受到非靶序列的干扰，

13、如何排除背景的影响，使实时荧光定量具有普遍性是人们面临的又一个挑战。植物病害危害性是极其严重的，防治十分困难，例如柑橘溃疡病、柑橘黄龙病、果树根癌病、水稻细菌性条斑病和水稻白叶枯病等都是许多国家的植物检疫性病害，防治或根除办法都是极其棘手和困难的。口岸在加强植物检疫工作的同时，也要不断地进行基础研究，建立起一系列生物安全措施和简便准确的检测方法，以便进一步提高口岸植物检疫工作的效率。总之，实时荧光定量技术为植物检疫工作的开展提供了强有力的技术支撑，如果能与其他分子生物学以及传统方法相结合，将会推动口岸检疫工作更好地发展。参考文献：，（）：，（），（）：施林祥，李东辉实时荧光研究新进展，（）：，

14、：.，（）：，-，（10）：，：，：，：，（）：程颖慧，章桂明，王颖，等小麦印度腥黑穗病菌实时荧光检测植物检疫，（）：章桂明，程颖慧，王颖，等应用探针检测小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌植物病理学报，（）：，tqp，opdmp，sssip，（）：年四季，袁青，殷幼平，等实时荧光定量鉴定小麦矮腥黑穗菌技术研究中国农业科学，（）：黄国明，廖芳，刘跃庭，等苇状羊茅内生真菌与多年生黑麦草内生真菌实时荧光检测研究菌物学报，（）：苏丹，任安芝，高玉葆黑麦草内生真菌感染状况的检测及定量分析微生物学通报，（）：田亚南，柯穗，柯冲应用多聚酶链式反应（）技术检测和定量分析柑桔黄龙病病原植物病理学报，（）：胡浩

15、，殷幼平，张利平，等柑桔黄龙病的常规及荧光定量检测中国农业科学，（）：夏明星，赵文军，马青，等番茄细菌性溃疡病菌的实时荧光检测植物病理学报，（）：殷幼平，黄冠军，赵云，等柑桔溃疡病菌实时荧光定量检测与应用植物保护学报，（）：冯建军，许勇，李建强，等免疫凝聚试纸条和探针实时荧光检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究植物病理学报，（）：钱国良，胡白石，卢玲，等梨火疫病菌的实时荧光检测植物病理学报，（）：孙蕾，吴茂森，何晨阳建立以和为靶基因的方法对水稻白叶枯病菌侵染过程进行定量分析中国农业科学，（）：廖晓兰，朱水芳，赵文军，等水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光快速检测鉴定微生物学报，（）：626-

16、634漆艳香，朱水芳，赵文军，等玉米细菌性枯萎病菌探针实时荧光检测方法的建立植物保护学报，（）：漆艳香，赵文军，朱水芳，等苜蓿萎蔫病菌探针实时荧光检测方法的建立植物检疫，（）：漆艳香，朱水芳，肖启明菜豆细菌性萎蔫病菌基因克隆及探针实时荧光检测仲恺农业技术学院学报，（）：回文广，赵廷昌，等哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立中国农业科学，（）：漆艳香，谢艺贤，张辉强，等香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光检测方法的建立华南热带农业大学学报，（）：魏琪，胡林双，董学志，等马铃薯环腐病菌检测体系的建立中国马铃薯，（）：童秀英，杨文权，寇建村药用植物病毒病及其防治青海农林科技，（）：，36郑耘，杨伟东，陈枝楠

17、，等烟草环斑病毒检测方法研究植物保护，（）：20杨伟东，郑耘，章桂明，等烟草环斑病毒检测方法研究中国病毒学，（）：闻伟刚，谭钟，崔俊霞实时荧光方法检测齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒植物保护，（）：闻伟刚，张建成，崔俊霞，等玉米褪绿斑驳病毒实时荧光检测方法研究植物检疫，（）：a，（，），（）：王金成，季镭，杨秀丽，等松材线虫探针实时荧光诊断植物病理学报，（）：王翀，葛建军，陈长发鳞球茎茎线虫实时荧光检测技术的研究植物检疫，（）：葛建军，曹爱新，陈洪俊，等应用探针进行马铃薯金线虫实时荧光检测技术研究植物保护，（）：葛建军，曹爱新，陈洪俊，等实时荧光检测马铃薯白线虫技术研究植物检疫，（）：龚艳清，郑洋妹，陈信忠荧光定量鉴定简单异尖线虫方法的建立检验检疫学刊，（）：28-31胡丹丹，顾金刚，姜瑞波，等定量及其在植物学研究中的应用植物营养与肥料学报，（）：-