基于薄膜电极的细胞电融合芯片.pdf

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1、基于薄膜电极的细胞电融合芯片 张小玲;杨军;胡宁;侯文生;郑小林;谢琳;杨忠;陈洁【摘 要】构建了一种薄膜电极阵列结构的细胞电融合芯片,通过多聚物微通道底/顶层凸齿状的微电极,以及多聚物微通道侧壁上溅射形成的一层离散式金属薄膜电极,共同形成离散式“三明治”微电极结构.该微电极结构可在微通道内部形成与传统凸齿状电极相似的非均匀分布的梯度电场,通过介电电泳效应进行细胞控制及排队.利用多聚物在芯片上填充了传统凸齿状电极的凹陷区,克服了细胞在凹陷区无法有效排队与融合的缺点.在芯片上利用 K562 细胞开展了基于介电电泳效应的细胞排队实验及基于可逆性电穿孔效应的电融合实验,结果表明该芯片能够较好地实现细

2、胞排队及融合,融合所需控制电压低至 10 V 左右.细胞排队率达 99以上,几乎无细胞在绝缘物填充区(传统凸齿电极芯片的凹陷区)滞留,细胞两两排队高于 60,细胞融合效率约为 40,比传统的细胞电融合方法和凸齿电极芯片有较大提高.%A microfluidic chip based on thin film microelectrode structure was developed for high efficiency cell electrofusion.The top/bottom thin film microelectrode array and the discrete thin

3、 film microelectrodes sputtered on the sidewalk of the polymer(Durimide 7510)microchannel constructed the discrete sandwich microelectrode structure.As the traditional protruding microelectrodes,this structure could generate nonuniform electric field for dielectrophoresis-based cell alignment/pairin

4、g between the microchannel.The cavity between two adjacent microeledctrodes was also filled using the Durimide 7510.It could overcome the shortcoming in the traditional protruding cell-electrofusion chip where many cells could not be aligned and fused in the unfilled cavity.Experimental investigatio

5、n of cell alignment based on dielectropjioresis and cell electrofusion based on reversible electroporation were conducted using K562 cells and good results were achieved.Low voltage pulses(ca.10 V)series could produce a strong enough electric field for reversible electroporation.Most cells(ca.99%)we

6、re trapped on the surface of the thin film microelectrodes and almost no cells were docked between two adjacent electrodes on the same sidewall.More than 60%cells were aligned as cell-cell twins and about 40%cells were fused.Thus,compared with traditional cell electrofusion method and protruding mic

7、roelectrode structures,higher alignment and fusion efficiency were achieved.【期刊名称】高等学校化学学报【年(卷),期】2012(033)008【总页数】5 页(P1698-1702)【关键词】薄膜电极;细胞电融合;微流控芯片;排队;电穿孔【作 者】张小玲;杨军;胡宁;侯文生;郑小林;谢琳;杨忠;陈洁【作者单位】重庆大学生物工程学院,生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆400030;重庆大学生物工程学院,生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆400030;重庆大学生物工程学院,生物流变科学与技术教育部重点实验室,

8、重庆400030;重庆大学生物工程学院,生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆400030;重庆大学生物工程学院,生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆400030;第三军医大学大坪医院野战外科研究所眼科,重庆 400042;第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室,重庆 400038;重庆医科大学附属儿童医院儿童营养研究中心,重庆 400014【正文语种】中 文【中图分类】O657;Q813.2 细胞融合技术是指通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将 2 个或者多个细胞通过无性方式融合成单核或多核的杂合细胞的过程.杂合细胞具有新的遗传或生物特性，具有广泛的应用前景，如用于抗体制备、药

9、物筛选及杂交育种等.细胞电融合1利用电信号诱导 2 个或多个细胞(原生质体)发生电穿孔及融合，与生物、化学诱导融合技术相比，该方法效率较高、操作简便、对细胞无毒害、适于仪器应用和规范操作.然而，传统的细胞电融合技术存在电极间距大、融合电压高和系统成本较高等问题，制约了该技术的广泛应用.同时，传统的大型平板电极间的电场范围大，控制精度较差，无法精确控制细胞的配对与融合过程，常发生多细胞融合现象，系统的整体融合效率也有待提高2.微加工和微机电系统3，4(Micro electro mechanical systems，MEMS)技术的产生与日趋成熟也渗透到细胞电融合研究领域，基于微流控与微电极阵列

10、技术的细胞电融合芯片在近年来得到了快速发展.Masuda 等5于 1989 年首次在芯片上加工形成了微米级的微电极及相应的微通道结构，并借助微流控技术及芯片上形成的微电场实现了细胞排队及电融合.此后，科学家们612在基于微流控技术的细胞电融合芯片上开展了大量探索，细胞排队与融合效率得到一定的提高.现有的微流控细胞融合芯片从结构上主要分为二维底层电极和三维体电极，二维底层电极在垂直方向电场的非均匀性导致该电极需要更高的电压才能达到足够的电场强度以促使细胞电融合，而且，有些二维底层电极对的间距较大911，同时要求更高的驱动电压.高电压对融合电信号发生器提出了较高要求，给操作安全性和细胞活性带来了负

11、面影响.在三维体电极细胞电融合研究中，通常采用凸齿状电极以在微通道中形成非均匀的电场分布，进而借助介电电泳效应实现细胞的控制与排队.但凸齿状电极从通道壁向通道中央突出，对微通道流路形成一定的影响，也妨碍了细胞悬液进样和抽取的有效进行.同时，在融合过程中，部分细胞会陷入通道同侧相邻 2 个电极间的凹陷区域，导致无法有效参与排队及融合，影响系统的整体效率8，1214.本文采用薄膜电极结构设计，利用微加工技术在芯片微通道的多聚物侧壁上溅射一层金属薄膜，形成黏附于侧壁上的三维薄膜电极.该电极结构可以在通道中形成非均匀分布的电场，并保证了光滑的流路.同时，多聚物填充了原有凸齿状电极存在的凹陷，有助于提高

12、系统的整体效率.1.1 仪器与材料 自制电融合仪;TDS1002 双通道数字存储示波器(美国泰克公司);Olympus BX51 显微镜(日本奥林巴斯株式会社);Motic AE31 倒置显微镜和视频采集系统(Motic 3000 Cooled CCD Camera 及图像处理软件)(麦克奥迪实业集团中国有限公司).低渗的融合缓冲液Hypoosmolar fusion buffer，电导率 120(1+10%)S/cm，23，德国 Eppendorf 公司;RPMI 1640 培养基(美国 GIBCO 公司);标准胎牛血清(FBS，美国 GIBCO 公司).选用 K562 细胞株(人慢性粒细胞

13、性白血病细胞株)为实验对象(重庆医科大学附属儿科医院提供).K562 细胞的培养与制备:将细胞接种于含 10%(体积分数)FBS 的RPMI 1640 培养基，于 37、5%(体积分数)的 CO2 培养箱中培养，34 d 换液1 次.待细胞生长到汇合度为 80%90%时，即可制备细胞悬浮液.首先将瓶内的旧培养液轻轻吸出，加入 45 mL 新的培养液，将细胞吹打均匀后分装到离心管中以转速 1500 r/min 离心 5 min.将离心管中液体倒出，加入融合缓冲液离心洗涤 3次，再加入新的融合缓冲液调节细胞密度为 2!104cell/mL，即制得实验用细胞悬浮液.1.2 基于薄膜电极的细胞电融合芯

14、片制备 1.2.1 芯片设计 基于凸齿状微电极阵列的细胞电融合芯片的优点在于可在微通道中形成非均匀分布的梯度电场，进而可借助介电电泳效应实现细胞的运动控制，达到细胞排队的目的15，16.但这种设计中在通道同一侧的两相邻凸齿状电极之间存在一凹陷区，在进样过程中有部分细胞会进入该区域.由于该区域的电场梯度及电场强度均较低，无法有效地完成细胞排队及融合，影响了系统的电融合效率.因此，本文在凸齿状微电极阵列的基础上改进了芯片设计.芯片采用石英玻璃为基底材料，在多聚物微通道底部、顶部和侧壁表面形成一层金属薄膜电极(图 1).多聚物微通道层采用 Durimide 7510 光刻显影成型，厚度为 30 m，

15、微通道的宽度为90 m.通道底部和顶部的每个凸齿状微电极的尺寸及黏附于多聚物微通道侧壁的薄膜电极尺寸均为 30 m!30 m.电极金属膜的厚度为 0.3 m.1.2.2 芯片加工 采用光刻工艺加工芯片，具体工艺流程(图 2)如下:将石英玻璃基片洗净;依次溅射厚度分别为 20 nm 的 Ti 和 150 nm 的 Au 于石英玻璃基底上，Ti的作用主要是提高 Au 与玻璃之间黏附的牢固度;光刻形成微电极阵列结构图形，利用 KI 溶液和 BOE 溶液Buffered oxide etch solution，V(40%NH4F)V(49%HF)=61腐蚀掉多余的Au 和 Ti;旋涂 Durimide

16、 7510于溅射金膜的石英玻璃片上，光刻形成微通道阵列结构，并在 350下固化形成微通道层;利用溅射和剥离(Lift-off)工艺在 Durimide 7510 微通道层表面形成一层结构与底部微电极阵列层结构相似的微电极阵列，首先在通道层通过悬涂 AZ4620并光刻形成与微电极阵列相反的图形，然后采用溅射技术淀积厚度分别为 20 nm的 Ti 与 150 nm 的 Au 金属薄层，用丙酮溶解 AZ4620 图形并使图形上的金属薄层脱落以获得所需的顶层微电极阵列图形.在溅射金属的过程中，金膜会沉积于Durimide 7510 微通道的侧壁上，进而形成相应的薄膜电极结构.同时，底层、顶层的微电极阵

17、列与侧壁的薄膜电极在电气结构上相互连接，进而形成“三明治”结构，提高了芯片整体的可靠性.芯片采用金丝键合工艺与外界形成电气连接，加载的电信号通过金丝后借助微通道两侧的电极结构在微通道中形成细胞电融合所需的电场.1.3 细胞电融合实验 细胞电融合分为细胞排队与细胞融合过程.与基于凸齿状微电极阵列的细胞电融合12类似，本文的细胞电融合实验也分为 2 个阶段:基于介电电泳效应的细胞排队以及基于可逆性细胞电穿孔效应的细胞融合，实验中所选电信号参数参照文献12，13.将 K562 细胞利用融合缓冲液稀释后注入芯片内部微通道中，首先加载正弦交流信号(电压峰峰值 23 V;频率 1 MHz;持续时间 30

18、s)，随后加载直流脉冲信号(幅值 810 V;脉宽 50 s;脉冲间隔 1 s;脉冲个数为5 个)于微电极阵列上，借助高强度的脉冲电场诱导排队后的细胞对之间的连接处发生可逆性电穿孔并建立相应的细胞连接通道;再次加载正弦交流信号(电压峰峰值23 V;频率 1 MHz;衰减率50%/s;持续时间 300 s)于微电极阵列上，以维持一个压紧效应于形成细胞连接后的细胞对上，促进细胞融合.采用图像采集系统记录实验过程，根据图像结果进行相应的分析.2.1 芯片表面形貌 在芯片加工完成后，对芯片的表面形貌进行检测以确定芯片是否达到预期的设计要求.由图 3 可见，芯片的完整性良好，在 1 cm2 cm 左右的

19、面积内集成了超过2000 个微电极，形成高密度的微电极阵列以及相应的微流路通道系统.SEM 结果表明，芯片的底/顶层微电极阵列与微通道侧壁上的薄膜电极阵列间形成了较好的电气连接，可有效加载信号于薄膜电极上.同时，金属薄膜的厚度极薄(约 200 nm)，微通道侧壁光滑，有助于样品在芯片内部的流动.2.2 芯片上的细胞排队 当加载正弦信号于微电极阵列后，与凸齿状微电极阵列芯片12类似，分别位于微通道两侧的薄膜电极之间将形成非均匀的电场分布，细胞在非均匀电场中被极化为偶极子，在正向介电电泳效应(细胞内部的电导率高于细胞外部即融合缓冲液的电导率)的作用下，细胞向高电场区域运动.根据通道内的电场分布，细

20、胞向微电极区域运动，进而吸附在微电极上并形成稳定的细胞对排列(图 4).由图 4 可见，K562 细胞在介电电泳力的作用下，在薄膜电极上形成了细胞珠串.与传统的凸齿状微电极阵列结构相比，多聚物填充了通道同一侧微电极阵列上两相邻微电极之间的凹陷区，因此没有细胞陷于该区域，99%以上的细胞都吸附于微电极上，大大提高了细胞排队效率，对于传统凸齿状微电极阵列引起 10%20%12，14的细胞陷于凹陷区也有大幅改进.由于微电极附近为高电场区域，细胞在该区域的吸附将受到通道中最强电场的作用，有利于降低细胞芯片工作电压.同时，绝大部分细胞都处于基本相同的电极位置，排队后的细胞对之间的细胞连接处将获得尽可能一

21、致的电场强度，从而使得排队细胞能够高效率地完成细胞电融合.2.3 芯片上的细胞融合 待细胞稳定吸附于微电极阵列并形成细胞对后，加载电穿孔/融合信号(方波脉冲，幅度 10 V;脉冲宽度 50 s;脉冲间隔 1 s;脉冲个数为 5 个)于微电极阵列上.由于相对薄膜电极之间的间距仅为 90 m，低电压信号在微通道中形成高强度电场.如果高强度电场引起的细胞膜电位差超过电穿孔阈值条件，细胞膜将发生可逆性的电穿孔;如果电场强度合适，细胞膜自身的流动性将诱导 2 个细胞连接处的细胞膜在发生电穿孔后建立细胞连接，为进一步的细胞交换形成通道.由图 5 可见，当加载电穿孔/融合信号后，2 个细胞间的连接处发生了电

22、穿孔效应，并形成了相应的细胞连接.在加载电穿孔/融合信号，建立细胞连接后，立即切换到促融信号(电压峰峰值 23 V;频率为 1 MHz;衰减率50%/s;持续时间 300 s)，2 个细胞在介电电泳作用下仍保持良好的连接状态，并最终完成细胞电融合过程.促融信号对细胞对产生介电电泳效应，置于远端的细胞保持向高电场强度区(即薄膜电极区)运动的趋势，使得2 个细胞能够持续压紧，进而为 2 个细胞稳定地进行胞质互换及完全融合提供良好的驱动力.采用衰减正弦信号是由于介电电泳效应与细胞直径的 3 次方成正比，随着细胞融合过程的发生，融合子受到的介电电泳效应将越明显，过大的介电电泳效应可能将细胞撕裂14.细

23、胞电融合结果表明，K562 细胞在该芯片内部的电融合率 E(E=融合细胞!2/加入的细胞总数，利用显微镜对视野下的融合过程进行观测并统计分析)达到了约 40%的水平，比传统的 PEG(Polyethylene glycol，聚乙二醇)方法(E1%)17，传统电融合方法(利用 BTX ECM 2001 细胞电融合仪得到，E5%)18以及传统凸齿状微电极阵列融合方法(E=21%30%)12，14显著提高.同时，与凸齿状微电极阵列芯片12相比，该芯片避免了细胞落入凹陷区，提高了细胞在微电极上排队的效率，进而提高了芯片的整体融合效率.综上，本文利用薄膜电极加工工艺实现了一种新颖的微流控细胞融合芯片结构

24、.利用多聚物侧壁上形成的一层金属薄膜与底/顶层微电极阵列共同形成的“三明治”电极结构，使微通道内部能够形成与传统凸齿状电极阵列相似的非均匀电场分布，从而可以利用介电电泳效应进行细胞排队控制.同时，利用多聚物填充了传统凸齿状电极的凹陷区，避免了细胞在凹陷区无法有效排队与融合的缺点，提高了细胞排队和融合效率.实验结果表明，该芯片能够较好地实现细胞排队和融合，融合脉冲的电压降到了 10 V 水平.与传统电融合设备相比，其电压需求大大降低，减少了外围设备的设计加工难度，对于细胞电融合芯片技术的推广应用有重要意义.1 Zimmermann U.Reviews of Physiology Biochemi

25、stry and PharmacologyJ，1986，105:175256 2 Watts J.W.，King J.M.Bioscience ReportsJ，1984，4(4):335342 3 Wise K.D.，Najafi K.ScienceJ，1991，254(5036):13351342 4 Ho C.M.，Tai Y.C.Annual Review of Fluid MechanicsJ，1998，30:579612 5 Masuda S.，Washizu M.，Nanba T.IEEE Transactions on Industry ApplicationsJ，1989，2

26、5(4):732737 6 Wang J.，Lu C.Applied Physics LettersJ，2006，89(23):234102-1234102-3 7 Clow A.L.，Gaynor P.T.，Oback B.J.Biomedical MicrodevicesJ，2010，12(5):777786 8 Stromberg A.，Karlsson A.，Ryttsen F.，Davidson M.，Chiu D.T.，Orwar O.Anal.Chem.J，2001，73(1):126130 9 Skelley A.M.，Kirak O.，Suh H.，Jaenisch R.，V

27、oldman J.Nature MethodsJ，2009，6(2):147152 10 Gel M.，Suzuki S.，Kimura Y.，Kurosawa O.，Techaumnat B.，Oana H.，Washizu M.IEEE Transactions on Nano BioscienceJ，2009，8(4):300305 11 Gel M.，Kimura Y.，Kurosawa O.，Oana H.，Kotera H.，Washizu M.BiomicrofluidicsJ，2010，4(2):022808-1022808-8 12 Cao Y.，Yang J.，Yin Z.

28、Q.，Luo H.Y.，Yang M.，Hu N.，Huo D.Q.，Hou C.J.，Jiang Z.Z.，Zhang R.Q.，Xu R.，Zheng X.L.Microfluidics and NanofluidicsJ，2008，5(5):669675 13 HU Ning(胡宁)，YANG Jun(杨军)，HOU Wen-Sheng(侯文生)，ZHENG Xiao-Lin(郑小林)，CAO Yi(曹毅)，YANG Jing(杨静)，XU Rong(许容)，ZHANG Rui-Qiang(张瑞强).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)J，2009，

29、30(1):4245 14 Hu N.，Yang J.，Yin Z.Q.，Ai Y.，Qian S.Z.，Svir I.B.，Xia B.，Yan J.W.，Hou W.S.，Zheng X.L.ElectrophoresisJ，2011，32(18):24882495 15 Ai Y.，Qian S.Z.，Liu S.，Joo S.W.BiomicrofluidicsJ，2010，4(1):013201-1013201-6 16 XU Yi(徐溢)，CAO Qiang(曹强)，ZENG Xue(曾雪)，WU Yong-Jie(吴永杰)，ZHANG Wen-Pin(张文品).Chem.J.Ch

30、inese Universities(高等学校化学学报)J，2009，30(5):876881 17 Guan Q.Z.，Guo Y.H.，Wei Y.X.，Meng F.Z.，Zhang Z.X.Plant Cell，Tissue Organ Cult.J，2010，102:279284 18 Yu X.C.，McGraw P.A.，House F.S.，Crowe J.E.J.Immunol.MethodsJ，2008，336:142151【相关文献】1 Zimmermann U.Reviews of Physiology Biochemistry and PharmacologyJ，19

31、86，105:175256 2 Watts J.W.，King J.M.Bioscience ReportsJ，1984，4(4):335342 3 Wise K.D.，Najafi K.ScienceJ，1991，254(5036):13351342 4 Ho C.M.，Tai Y.C.Annual Review of Fluid MechanicsJ，1998，30:579612 5 Masuda S.，Washizu M.，Nanba T.IEEE Transactions on Industry ApplicationsJ，1989，25(4):732737 6 Wang J.，Lu

32、C.Applied Physics LettersJ，2006，89(23):234102-1234102-3 7 Clow A.L.，Gaynor P.T.，Oback B.J.Biomedical MicrodevicesJ，2010，12(5):777786 8 Stromberg A.，Karlsson A.，Ryttsen F.，Davidson M.，Chiu D.T.，Orwar O.Anal.Chem.J，2001，73(1):126130 9 Skelley A.M.，Kirak O.，Suh H.，Jaenisch R.，Voldman J.Nature MethodsJ，

33、2009，6(2):147152 10 Gel M.，Suzuki S.，Kimura Y.，Kurosawa O.，Techaumnat B.，Oana H.，Washizu M.IEEE Transactions on Nano BioscienceJ，2009，8(4):300305 11 Gel M.，Kimura Y.，Kurosawa O.，Oana H.，Kotera H.，Washizu M.BiomicrofluidicsJ，2010，4(2):022808-1022808-8 12 Cao Y.，Yang J.，Yin Z.Q.，Luo H.Y.，Yang M.，Hu N.

34、，Huo D.Q.，Hou C.J.，Jiang Z.Z.，Zhang R.Q.，Xu R.，Zheng X.L.Microfluidics and NanofluidicsJ，2008，5(5):669675 13 HU Ning(胡宁)，YANG Jun(杨军)，HOU Wen-Sheng(侯文生)，ZHENG Xiao-Lin(郑小林)，CAO Yi(曹毅)，YANG Jing(杨静)，XU Rong(许容)，ZHANG Rui-Qiang(张瑞强).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)J，2009，30(1):4245 14 Hu N.，Yang

35、J.，Yin Z.Q.，Ai Y.，Qian S.Z.，Svir I.B.，Xia B.，Yan J.W.，Hou W.S.，Zheng X.L.ElectrophoresisJ，2011，32(18):24882495 15 Ai Y.，Qian S.Z.，Liu S.，Joo S.W.BiomicrofluidicsJ，2010，4(1):013201-1013201-6 16 XU Yi(徐溢)，CAO Qiang(曹强)，ZENG Xue(曾雪)，WU Yong-Jie(吴永杰)，ZHANG Wen-Pin(张文品).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)J，2009，30(5):876881 17 Guan Q.Z.，Guo Y.H.，Wei Y.X.，Meng F.Z.，Zhang Z.X.Plant Cell，Tissue Organ Cult.J，2010，102:279284 18 Yu X.C.，McGraw P.A.，House F.S.，Crowe J.E.J.Immunol.MethodsJ，2008，336:142151(Ed.:I，K)