23发酵罐及灭菌方法.ppt

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1、第三节第三节 发酵设备及消毒灭菌发酵设备及消毒灭菌n 典型发酵设备 n n种子制备设备、主发酵设备、辅助种子制备设备、主发酵设备、辅助设备设备(无菌空气和培养基的制备无菌空气和培养基的制备)，发酵液预处理设备，粗产品的提取发酵液预处理设备，粗产品的提取设备、产品精制与枯燥设备、流出设备、产品精制与枯燥设备、流出物回收、利用和处理设备等。物回收、利用和处理设备等。一 发酵设备概述n n发发酵酵主主要要设设备备为为发发酵酵罐罐和和种种子子罐罐，它它们们各各自自都都附附有有原原料料(培培养养基基)调调制制、蒸蒸煮煮、灭灭菌菌和和冷冷却却设设备备，通通气气调调节节和和除除菌菌设设备备，以以及及搅搅拌拌

2、器器等。等。n n种种子子罐罐：以以确确保保发发酵酵罐罐培培养养所所必必需需的的菌菌体体量量为目的。为目的。n n发发酵酵罐罐：承承担担产产物物的的生生产产任任务务。它它必必须须能能够够提提供供微微生生物物生生命命活活动动和和代代谢谢所所要要求求的的条条件件，并并便便于于操操作作和和控控制制，保保证证工工艺艺条条件件的的实实现现，从而获得高产。从而获得高产。(一)发酵罐 发酵罐的定义：是为一个特定生物化学过发酵罐的定义：是为一个特定生物化学过程的操作提供良好而满意的环境的容器。程的操作提供良好而满意的环境的容器。对于某些工艺来说，发酵罐是个密闭容器，对于某些工艺来说，发酵罐是个密闭容器，同时附

3、带精密控制系统；而对于另一些简同时附带精密控制系统；而对于另一些简单的工艺来说，发酵罐只是个开口容器，单的工艺来说，发酵罐只是个开口容器，有时甚至简单到只要有一个开口的坑。有时甚至简单到只要有一个开口的坑。发酵罐系统 一个优良的发酵罐装置和组成一个优良的发酵罐装置和组成一个优良的发酵罐装置和组成一个优良的发酵罐装置和组成1 1应具有严密的结构应具有严密的结构应具有严密的结构应具有严密的结构2 2良好的液体混合特性良好的液体混合特性良好的液体混合特性良好的液体混合特性3 3好的传质、传热速率好的传质、传热速率好的传质、传热速率好的传质、传热速率4 4具有配套而又可靠的检测、控制仪表具有配套而又可

4、靠的检测、控制仪表具有配套而又可靠的检测、控制仪表具有配套而又可靠的检测、控制仪表发酵罐的特点 1发发酵酵罐罐对对纯纯种种培培养养的的要要求求高高。因因此此，发发酵酵罐罐的的严严密密性性，运运行行的的高高度度可可靠靠性性是是发发酵酵工工业业的显著特点。的显著特点。2发酵罐更加趋向大型化和自动化开展。发酵罐更加趋向大型化和自动化开展。自自动动化化方方面面，如如pH电电极极、溶溶解解氧氧电电极极、溶溶解解二二氧氧化化碳碳电电极极等等的的在在线线检检测测在在国国外外巳巳相相当当成成熟熟。国国内内目目前前尚尚处处于于起起步步阶阶段段，发发酵酵检检测测参参数数还还只只限限于于温温度度、压压力力、空空气气

5、流流量量等等一一些些最最常规的参数。常规的参数。发酵罐根本类型(1搅拌釜反响器搅拌釜反响器stirred tank reactor(2气泡柱式反响器气泡柱式反响器bubble column)(3)气升式生物反响器气升式生物反响器 airlift reactor)内管型；外管型内管型；外管型发酵罐工艺操作条件 1 1温度：温度：温度：温度：25254040。2 2压力：压力：压力：压力：0 01 kg1 kgcm3(cm3(表压表压表压表压)。3 3灭灭灭灭菌菌菌菌条条条条件件件件；温温温温度度度度100100140140，压压压压力力力力0 03 3 kgkgcm3 cm3(表压表压表压表压)

6、.).4 4pHpH：2 21111。5 5需氧量：需氧量：需氧量：需氧量：0 005050.3 kmo10.3 kmo1m3hm3h。6 6通气量：通气量：通气量：通气量：2 VVM2 VVM。7 7功率消耗：功率消耗：功率消耗：功率消耗：4kW4kWm3m3。8.8.发酵热量：发酵热量：发酵热量：发酵热量：5 0005 00020 000 kcal20 000 kcalm3m3h h。发酵设备及检测控制系统 B|Braun公司公司发酵罐：Biostat系列参数检测多级控制：Biostat B2Biostat ED10Pilot Biostat UD50国内、外发酵设备公司国内、外发酵设备公

7、司德国贝朗德国贝朗 占中国占中国80%以上的市场以上的市场瑞士比欧瑞士比欧美国美国NBS韩国韩国日本日本华东理工大学华东理工大学江苏理工大学江苏理工大学一般认为一般认为500L以下的是实验室发酵罐；以下的是实验室发酵罐；500-5000L是中试发酵罐；是中试发酵罐；5000L以上是生产规模的发酵罐。以上是生产规模的发酵罐。发酵罐按容积分类现代发酵工程规模低值工业品大型化低值工业品大型化 以规模来取胜以规模来取胜几十数百吨。如味精、氨基酸、有几十数百吨。如味精、氨基酸、有机酸、抗生素、饲料、食品工业用产机酸、抗生素、饲料、食品工业用产品等；品等；高价值转基因产品小型化几十数百高价值转基因产品小型

8、化几十数百升。基因工程大肠杆菌、酵母菌高升。基因工程大肠杆菌、酵母菌高密度培养；动物细胞植物细胞培养；密度培养；动物细胞植物细胞培养；研究中心智能化、全能性。研究中心智能化、全能性。(二)发酵辅助设备 n n发酵辅助设备主要包括：发酵辅助设备主要包括：无菌空气无菌空气系统，系统，培养基配制和灭菌系统培养基配制和灭菌系统、发发酵车间的管道及阀门等酵车间的管道及阀门等。1、无菌空气系统、无菌空气系统n n好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要作到作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济的。n n发酵对无菌空气的

9、要求是发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；质，无水，无油，正压等几项指标；n n发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。n n在工程设计中一般要求在工程设计中一般要求10001000次使用周期中只允许次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10N=10-3-3 发酵生产中制备无菌空气的大致过程 高空取气管 n n高空取气管是远离地面几十米高空取气管是远

10、离地面几十米的管子。一般而言，地面附近的管子。一般而言，地面附近空气中所含的空气中所含的 微生物和灰尘等微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高料介绍，每升高1010米，空气中米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有从高空取气要比从低空取气有利得多。利得多。油水别离器n n其其内内部部同同时时采采用用直直接接拦拦截截，惯惯性性碰碰撞撞，布布朗朗扩扩散散及及凝凝聚聚等等机机理理，能能有有效效地地去去除除空空气气中中的的水水、油油雾雾、尘尘埃埃，内内部部不不锈锈钢钢丝丝网网可可清清洗洗，使用寿命长。使用寿命长。

11、两级别离、冷却、加热的空气两级别离、冷却、加热的空气除菌流程除菌流程 粗过滤器粗过滤器压缩机压缩机 贮罐贮罐冷却器冷却器 丝网别离器丝网别离器 过滤器过滤器高效前置过滤除菌流程高效前置过滤除菌流程 高效前置过滤器高效前置过滤器压缩机压缩机贮罐贮罐冷却器冷却器 丝网别离器丝网别离器加热器加热器过滤器过滤器 空气净化的流程n n吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤n n进入空气压缩机进入空气压缩机120-150120-150度度n n冷却冷却20-2520-25度，除去油、水，再加热至度，除去油、水，再加热至30-30-3535度。度。n n最后通过总过滤器和分过滤

12、器除菌，获得洁净最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。空气压缩机：空气压缩机：目前常用的是往复式空压机目前常用的是往复式空压机过滤器过滤器：空气过滤器的类型很多，有棉花活：空气过滤器的类型很多，有棉花活性炭过滤器、管式过滤器和接送式过滤器等。性炭过滤器、管式过滤器和接送式过滤器等。过滤介质过滤介质：空气除菌用的过滤介质有：棉花、：空气除菌用的过滤介质有：棉花、活性炭玻璃纤维，超细玻璃纤维纸，石棉滤活性炭玻璃纤维，超细玻璃纤维纸，石棉滤板、烧结材料、聚乙烯醇板、烧结材料、聚乙烯醇(PVA)等多孔合成等多孔合成树

13、脂、素烧陶瓷筒和聚碳酸酯等。树脂、素烧陶瓷筒和聚碳酸酯等。培养基培养基n n培养基培养基culture medium)是人工配制的适是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。的营养基质。n n碳源碳源n n氮源氮源n n无机盐及微量元素无机盐及微量元素n n前体、促进剂与抑制剂前体、促进剂与抑制剂培养基的类型培养基的类型n n孢子培养基：供菌种繁殖孢子，常用固体培养基n n种子培养基：提供大量优质的菌体，其配方上应适合于菌体生长于繁殖n n发酵培养基：使微生物积累代谢产物，既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。2

14、、培养基的灭菌 n n1 1 1 1空罐灭菌空罐灭菌空罐灭菌空罐灭菌 n n空空空空罐罐罐罐灭灭灭灭菌菌菌菌也也也也称称称称空空空空消消消消。无无无无论论论论是是是是种种种种子子子子罐罐罐罐、发发发发酵酵酵酵罐罐罐罐、还还还还是是是是尿尿尿尿素素素素或或或或液液液液氨氨氨氨罐罐罐罐、消消消消泡泡泡泡罐罐罐罐，当当当当培培培培养养养养基基基基或或或或物物物物料料料料尚尚尚尚未未未未进进进进罐罐罐罐前前前前对对对对罐罐罐罐进进进进行行行行预预预预先先先先灭灭灭灭菌菌菌菌，为为为为空空空空罐灭菌。罐灭菌。罐灭菌。罐灭菌。n n为为为为了了了了杀杀杀杀死死死死所所所所有有有有微微微微生生生生物物物物特

15、特特特别别别别是是是是耐耐耐耐热热热热的的的的的的的的芽芽芽芽孢孢孢孢，空空空空罐罐罐罐灭灭灭灭菌菌菌菌要要要要求求求求温温温温度度度度较较较较高高高高，灭灭灭灭菌菌菌菌时时时时间间间间较较较较长长长长，只只只只有有有有这这这这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。n n2 2 2 2实罐灭菌实罐灭菌实罐灭菌实罐灭菌 n n将将将将培培培培养养养养基基基基置置置置于于于于发发发发酵酵酵酵罐罐罐罐中中中中用用用用蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽加加加加热热热热，到到到到达达达达预预预预定定定

16、定灭灭灭灭菌菌菌菌温温温温度度度度后后后后，维维维维持持持持一一一一定定定定时时时时间间间间，再再再再冷冷冷冷却却却却到到到到发发发发酵酵酵酵温温温温度度度度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。n n操作要点：操作要点：操作要点：操作要点：n n三三三三路路路路进进进进汽汽汽汽：直直直直接接接接蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽从从从从通通通通风风风风、取取取取样样样样和和和和出出出出料料料料口口口口进进进进入入入入罐罐罐罐内内内内直直直直接接接接加加加加热热热热，直直直

17、直到到到到所所所所规规规规定定定定的的的的温温温温度度度度，并并并并维维维维持持持持一一一一定定定定的时间。这就是所谓的的时间。这就是所谓的的时间。这就是所谓的的时间。这就是所谓的“三路进气。三路进气。三路进气。三路进气。3连消连消n n加热设备加热设备：在配料罐里培养基被加热到：在配料罐里培养基被加热到7070，然后，用泵送到加热设备，在然后，用泵送到加热设备，在2020秒的时间内继秒的时间内继续加热到续加热到130130140140。常用的加热设备有塔式。常用的加热设备有塔式和喷射式两种。和喷射式两种。n n塔式加热设备塔式加热设备又称连消塔，塔的有效高度又称连消塔，塔的有效高度2 23m

18、3m，料液在塔中的流速是，料液在塔中的流速是s s，因此料液在塔，因此料液在塔内的滞留时间为内的滞留时间为2 230s30s。n n喷射式加热器喷射式加热器有一喷嘴，蒸汽由喷嘴喷出，料有一喷嘴，蒸汽由喷嘴喷出，料液从侧面进入加热器而被蒸汽加热。液从侧面进入加热器而被蒸汽加热。n n 维持设备n n维持设备使加热后的培养基保温定的时间，从而到达灭菌的目的。n n维持设备有两种：罐式和管式。罐式的是一个带有上下开口用于进出料的立式密封容器；管式的是用无缝钢管焊成，管内流速可取s。冷却设备冷却设备 喷淋冷却器喷淋冷却器 套管冷却器套管冷却器 板式换热器板式换热器 螺旋板换热器螺旋板换热器4影响培养基

19、灭菌的因素 n npH值的影响 n npH值对微生物的耐热性影响很大，pH为时微生物最不易死亡，时氢离子易渗入微生物的细胞内。n n培养基成分 n n培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。n n浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。n n高浓度的盐类，色素那么削弱其耐热性，故较易灭菌。n n培养基中的颗粒物质 n n培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。5 5高温对培养基成分的有害影高温对培养基成分的有害

20、影响及其防止响及其防止 消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施1 1 1 1采用特殊加热灭菌法采用特殊加热灭菌法采用特殊加热灭菌法采用特殊加热灭菌法 2 2 2 2对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；其他成分分别灭菌后再合并；其他成分分别灭菌后再合并；其他成分分别灭菌后再合并；3 3 3 3对含对含对含对含Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+或或或或Fe3+Fe3+Fe3+Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，的培养基与磷酸盐先

21、作分别灭菌，的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；4 4 4 4对含有在高温下易破坏成分的培养基如含糖组合对含有在高温下易破坏成分的培养基如含糖组合对含有在高温下易破坏成分的培养基如含糖组合对含有在高温下易破坏成分的培养基如含糖组合培养基可进行低压灭菌在培养基可进行低压灭菌在培养基可进行低压灭菌在培养基可进行低压灭菌在112112112112即即即即cm2cm2cm2cm2或或或或8 8 8 8磅英磅英磅英磅英寸寸寸寸2 2 2 2下灭菌

22、下灭菌下灭菌下灭菌15151515分钟或间歇灭菌；分钟或间歇灭菌；分钟或间歇灭菌；分钟或间歇灭菌；5 5 5 5在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌培养基的灭菌培养基的灭菌培养基的灭菌3、管道及阀门 n n管管管管道道道道 ：与与与与发发发发酵酵酵酵罐罐罐罐连连连连接接接接的的的的管管管管道道道道有有有有水水水水管管管管、料料料料管管管管、空空空空气气气气管管管管和和和和蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽管管管管;发发发发酵酵酵酵罐罐罐罐内内内内的的的的冷冷冷冷

23、却却却却蛇蛇蛇蛇管管管管与与与与发发发发酵酵酵酵罐罐罐罐内内内内直直直直接接接接相相相相连连连连的的的的料料料料管管管管等等等等，最最最最好好好好采采采采用用用用不不不不锈锈锈锈钢钢钢钢管管管管。管管管管径径径径选选选选取取取取的的的的流流流流速速速速是是是是：上上上上水水水水管管管管1 1 1 12m2m2m2ms s s s；料料料料管管管管s s s s；空空空空气气气气管管管管1010101015m15m15m15ms s s s；蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽1515151520m20m20m20ms s s s。阀阀门门：阀阀门门是是发发酵酵罐罐的的重重要要组组成成，它它被被用用于调节控制气体和

24、液体的流量。于调节控制气体和液体的流量。阀门的选取应考虑：阀门的选取应考虑：用于什么目的；用于什么目的；阀门的材料是否耐温、耐压等；阀门的材料是否耐温、耐压等；连接方式；连接方式；经济本钱；经济本钱；操作方式。操作方式。第二局部：消毒与灭菌消毒消毒消毒消毒(disinfection)(disinfection)：杀死物体上病原微生物的杀死物体上病原微生物的杀死物体上病原微生物的杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒剂

25、生物。用以消毒的药品称为消毒剂生物。用以消毒的药品称为消毒剂生物。用以消毒的药品称为消毒剂(disinfectant)(disinfectant)。灭菌灭菌灭菌灭菌(sterilization)(sterilization)：杀灭物体上所有微生物的杀灭物体上所有微生物的杀灭物体上所有微生物的杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。内的全部病原微生物和非病原微生物。内的全部病原微生物和非病原微生物。内的全部病原微生

26、物和非病原微生物。抑菌抑菌抑菌抑菌(bacteriostasisbacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的抑制体内或体外细菌的抑制体内或体外细菌的抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。防腐防腐防腐防腐(antisepsis)(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁防止或抑制体外细菌生长繁防止或抑制体外细菌生长繁防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。殖的方法。细菌一般不死亡。殖的方法。细菌一般不死亡。殖的方法。细菌一般不死亡。无菌无菌无菌无

27、菌(asepsis)(asepsis)：不存在活菌不存在活菌不存在活菌不存在活菌。热力灭菌法热力灭菌法辐射杀菌法辐射杀菌法滤过除菌法滤过除菌法超声波杀菌法超声波杀菌法枯燥与低温抑菌法枯燥与低温抑菌法第一节 物理消毒灭菌法vv干热灭菌法干热灭菌法 燃烧：废弃物、尸体燃烧：废弃物、尸体vv 灼烧：接种环、试管口灼烧：接种环、试管口vv 干烤：玻璃器皿干烤：玻璃器皿vv 红外线：医疗器械红外线：医疗器械vv湿热灭菌法湿热灭菌法moist heat sterilization)巴氏消巴氏消毒法：毒法：61.6-62.8 30min或或71.715-30s,主要用于主要用于牛乳消毒。牛乳消毒。vv 煮沸

28、法；流动蒸汽消毒法煮沸法；流动蒸汽消毒法vv 间歇蒸汽消毒法；间歇蒸汽消毒法；高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法一一.热力灭菌法热力灭菌法n n紫外线紫外线 波长波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。的紫外线具有杀菌作用。其主要作用于其主要作用于DNA，使一条，使一条DNA链上相链上相邻的两个胸腺嘧邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体，啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。导致细菌变异和死亡。n n电离辐射电离辐射 高速电子、高速电子、X射线、射线、射线射线n n微波微波 波长波长1mm1m二二.辐射杀菌法辐射杀菌法vv赛氏赛氏滤器滤器vv玻璃滤器玻璃滤器vv薄膜滤器薄膜滤器三三.滤过除菌

29、法滤过除菌法 是一种机械的作用因素，每秒超过是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声波。常用万次振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生的超声波发生器能产生20-100千赫的千赫的声波，可使细菌细胞壁裂解而死亡。声波，可使细菌细胞壁裂解而死亡。四四.超声波杀菌法超声波杀菌法 枯燥法 低温法：低温可使细菌的新陈代谢减慢，常用作保存细菌菌种。冷冻真空枯燥法是目前保存菌种的最好方法。五五.枯燥低温抑菌法枯燥低温抑菌法消毒剂的种类：酚类、醇类、重金消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧化剂、外表活性剂、烷属盐类、氧化剂、外表活性剂、烷化剂。化剂。消毒剂的应用：病人排泄物与分泌消毒剂的应用：病人排泄物与分泌物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空气、手。气、手。第二节第二节 化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法 消毒剂的性质、浓度与作用时间消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量微生物的种类与数量 温度温度 酸碱度酸碱度 有机物有机物第三节第三节 影响消毒灭菌效果的因素影响消毒灭菌效果的因素