海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)液芯微胶囊制备工艺优化及性能研究.pdf

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1、摘要海藻酸盐壳聚糖固芯微胶囊在生物细胞发酵领域虽然具有显著的优势，但仍存在一些不足：由于微胶囊内是固芯三维网状结构，使得细胞生长空间位阻较大，影响了细胞的大量增殖，同时固芯造成分子传质阻力大，微胶囊中心区域细胞不能及时获得营养物质和排出代谢产物，致使微囊化细胞生长和生产能力下降。针对这些不足，本文采用柠檬酸钠液化微胶囊的固芯，制得海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠(A C A)液芯微胶囊。首先采用响应面优化法对液芯微胶囊的制备工艺条件进行优化，寻找制备具有较好机械强度的液芯微胶囊的工艺条件；然后考察液芯微胶囊的传质性能包括小分子物质通过膜的传质系数和微胶囊膜的截留分子量；最后对细胞进行微囊化培养，考察A

2、C A 液芯微囊化细胞的生长和代谢情况。旨在为A C A 液芯微囊化技术在细胞发酵培养领域的应用奠定理论与实践基础。主要结论如下：1 对成膜材料壳聚糖进行改性，目的是提高壳聚糖的脱乙酰度和降低壳聚糖分子量。采用醇溶剂法制得具有高脱乙酰度(9 0)的壳聚糖，采用N a N 0 2 氧化法降解高分子量壳聚糖制得一定低分子量范围的壳聚糖。2 通过单因素实验确定制备A C A 液芯微胶囊的工艺条件范围：壳聚糖脱乙酰度 9 0，壳聚糖分子量为3 0 0 0 0-,5 0 0 0 0，壳聚糖的p H 值5 0“3，壳聚糖浓度 5 O g L，成膜反应时间1 5m i n 一-3 0 m i n，柠檬酸钠的

3、p H 2 0m i n。3 在单因素实验基础上，用膨胀率(s w)来表征液芯微胶囊膜的机械强度，采用响应面优化法对A C A 液芯微胶囊制备过程中1 1 个因子进行优化实验，寻找显著影响因子，确定最优工艺条件。首先由P l a c k e t t-b u r m a n 实验结果得到壳聚糖浓度、壳聚糖p H值和柠檬酸钠p H 值是影响A C A 液芯微胶囊膜强度的三个显著因子；然后由最陡爬坡实验逼近响应值最大的中心区域，确定中心点的条件为：壳聚糖浓度为5 5 叽，壳聚糖溶液p H 为6 2，柠檬酸钠p H 为6 O；最后由最陡爬坡实验的中心点设计中心组合实验，建立模型，绘制响应面曲线，计算最

4、优化的制备条件为：壳聚糖浓度5 9 虮，壳聚糖溶液p H 为6 2 2，柠檬酸钠p H 为5 5 3。进行验证实验，实验结果与优化理论值相符。4 在优化条件的基础上制备A C A 液芯微胶囊，考察液芯微胶囊的传质性能。首先建立传质模型，考察4 种小分子底物(谷氨酸、L 苯丙氨酸、葡萄糖和乳糖)通过微胶囊膜的传质系数，通过实验数据拟合得到谷氨酸、L 广苯丙氨酸、葡萄糖和乳糖的传质系数分别为0 0 1 2 6，O 0 1 1 0，0 0 0 7 1 及0 0 0 4 9；其次，由一系列已知分子量的聚乙二醇作为模型分子确定液芯微胶囊膜的截留分子量为2 0 0 0。5 在优化条件的基础上制备A C A

5、 液芯微胶囊并包埋大肠杆菌和酿酒酵母细胞，考察A C A 液芯微囊化细胞的生长和代谢情况。首先比较了大肠杆菌和酿酒酵母细胞在A C A 液芯微胶囊内和固芯微胶囊内的生长情况，其次考察了液芯微囊化酿酒酵母细胞的代谢和多批次培养情况。实验结果证明大肠杆菌和酿酒酵母细胞在液芯微胶囊内的生长情况良好，细胞密度比固芯微胶囊大；液芯微胶囊化酿酒酵母细胞代谢产物(酒精)浓度维持稳定，对细胞进行多批次培养，液芯微胶囊形态完好，细胞生长代谢维持稳定。关键词海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠微胶囊，液芯，优化，响应面，传质系数，新陈代谢A b s t r a c tA l t h o u g hA l g i n a t e

6、 C h i t o s a ns o l i dc o r eM i c r o c a p s u l eh a ss i g n i f i c a n ta d v a n t a g e si na s p e c t so ft h eb i o l o g i c a lc e l lf e r m e n t a t i o nb u tt h e r ea r es t i l ls o m ed e f i c i e n c i e s：A st h ec a p s u l eh a sas o l i dc o r ew i t h i nt h et h r e e

7、 d i m e n s i o n a ln e t w o r ks t r u c t u r e，m a k i n gc e l l sm o r es t e r i ch i n d r a n c e,a f f e c t i n gal a r g en u m b e ro fc e l lp r o l i f e r a t i o n,c a u s i n gb i g g e rm a s st r a n s f e rr e s i s t a n c e C e n t r a lr e g i o no fc e l lm i c r o e n c a

8、 p s u l a t i o nc a nn o tr e c e i v et i m e l yd i s c h a r g eo fn u t r i e n t sa n dm e t a b o l i t e s，g r o w t ha n dp r o d u c t i o no fm i c r o e n c a p s u l a t e dc e l l sd e c r e a s e d F o rt h e s ed e f i c i e n c i e s，i nt h i sp a p e r,s o d i u mc i t r a t el i

9、q u i ds o l i dc o r em i c r o c a p s u l e s，a n da l g i n a t e c h i t o s a n a l g i n a t e s o l i dl i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e sb ep r e p a r e d T h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e di no r d e rt om a d eg o o dm e c h a n i c a ls t r e n

10、g t hl i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e s S m a l lm o l e c u l e st h r o u g ht h em e m b r a n em a s st r a n s f e rp e r f o r m a n c ea n df i x e d c e l lf e r m e n t a t i o no nc e l lg r o w t ha n dm e t a b o l i s mw e r ei n v e s t i g a t i o n,f o rt h ea l g i n a t e

11、c h i t o s a n a l g i n a t el i q u i dc o r em i e r o e n c a p s u l a t i o nt e c h n o l o g ya p p l i e di nt h ef i e l do fc e l lc u l t u r el a i dt h et h e o r ya n dp r a c t i c e T h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s：1 B ye x p e r i m e n t a lm e t h o d sa n

12、dt h es i n g l ef a c t o rs c r e e n i n ge x p e r i m e n t，c h i t o s a nf i l mm a t e r i a lw e r em o d i f i c a t i o n,o b t a i n e db yh e t e r o g e n e o u sm e t h o dw i t hah i g hd e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n 9 0，o x i d a t i o nN a N 0 2w e r e u s e dt oo b t a i

13、n eas e r i e so fm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n 2 S i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sw e r eu e s dt os c r e e nl e v e lo fA 1 9 i n a t e C h i t o s a r d a l g i n a t el i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e sf a c t o r sa n dd e t e r m i n e dt h ec o n d i t i o n s

14、：c h i t o s a n Sd e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n 9 0，t h em o l e c u l a rw e i g h to f3 0 0 0 0 5 0 0 0 0c h i t o s a n,c h i t o s a n Sp Hv a l u eo f5 O 6 3，c o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a ni sg r e a t e rt h a n5 0 9 L，r e a c t i o nt i m ef i l ms h o u l db e15m i n 3

15、0 m i n,p Ho fs o d i u mc i t r a t ei sb e t w e e n 4 0a n d6 5，l i q u e f a c t i o nf o rm o r et h a n2 0m i n u t e sw h e nl i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e sw i mah i g h e rf i l ms t r e n g t h 3 O nt h eb a s eo ft h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t，11i n f l u e n c

16、i n gf a c t o r so ft h ep r e p a r a t i o no fA C Al i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e so p t i m i z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g ye x p e r i m e n t s t h ee x p a n s i o nr a t ei sc h a r a c t e r i z e dt h ef i l ms t r e n g t ha n dt h es i g n i f i c a

17、 n tf a c t o r sw e r ef o u n dt od e t e r m i n et h eo p t i m u mc o n d i t i o n s T h e r ea r et h r e es i g n i f i c a n tf a c t o r st h a td e p e n d i n gt h es t r e n g t ho ft h em e m b r a n eo fA C Al i q u i dc o r em i c r o c a p s u l eo nt h er e s u l to fP l a c k e t

18、t-b u r m a ne x p e r i m e n t T h et h e r ef a c t o r sa r ec o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n,c h i t o s a np Ha n ds o d i u mc i t r a t ep H D e t e r m i n e dt h ec e n t e ro fb o x-b e h n k e nd e s i g ne x p e r i m e n tb yt h er e s u l t so fs t e e p e s ta s c e n te x

19、 p e r i m e n ta n dt h ec e n t e rc o n d i t i o n sa r et h a tC H Ic o n c e n t r a t i o ni s5 5 9 L，C H Ip Hi s6 2a n ds o d i u mc i t r a t ep Hi S5 5 3 4 I n v e s t i g a t eo nt h et r a n s f e rp r o p e r t i e st h r o u g ht h em i c r o c a p s u l em e m b r a n eo ft h ef o u r

20、k i n d so fs m a l lm o l e c u l e sw h i c ha r eg l u t a m i ca c i d，L p h e n y l a l a n i n e，g l u c o s ea n dl a c t o s e M a s st r a n s f e rm o d e lW a se s t a b l i s h e da n dm a s st r a n s f e rc o e f f i c i e n t sw e r ef i t t e d 船O 0 1 2 6，O 0 110，0 0 0 71a n d0 0 0 4

21、 9 As e r i e so fk n o w nm o l e c u l a rw e i g h to fp o l y e t h y l e n eg l y c o lm o l e c u l e sw e r em e a s u r e da sam o d e la n dm e m b r a n em o l e c u l a rw e i g h tc u t o f fi sm e a s u r e d 嬲2 0 0 0 5 T h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo ft h eS a c c h a r o m y

22、 c e sc e r e v i s i a ea n dE c o l iw e r ec o m p a r e dw i t h i nt h ee n v i r o n m e n ts i t u a t i o ni nA C Al i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg r o w t hd e n s i t ya n dt h ec o n c e n t r a t i o no fm e t a b o l i t e so fi m m o

23、b i l i z e dS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec e l l si nl i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e sp e r f o r mb e t t e rt h a ni nt h es o l i dc o r em i e r o c a p s u l e sa n dm e t a b o l i s ma l c o h o lc o n c e n t r a t i o nr e m a i n e ds t a b l eo nm o r eb a t c hc

24、 u l t u r e K e y w o r d sA l g i n a t e C h i t o s a n A l g i n a t eM i c r o c a p s u l e s，L i q u i dc o r e，O p t i m i z a t i o n,R e s p o n s es u r f a c e，M a s st r a n s f e rc o e 街c i e n t M e t a b o l i c西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子

25、版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：灶指导教师签名：盔 埠如f o 年占月，7 日夕。年乡月，7 日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或

26、证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢：亡巳思0学位论文作者签名：纠。年石,E l，7 日西北大学硕士学位论文第一章绪论1 1 固定化技术1 1 1 固定化技术概论早在1 9 世纪初，人们就利用微生物细胞在固体表面吸附的现象，采用滴滤法来生产醋酸。后来，又有人采用类似方法来进行污水处理。现代的固定化细胞技术是在固定化酶技术的推动下而发展起来的。固定化细胞技术起始于1 9 5 9 年，H a：t t o n 等人首次实现了大肠杆菌的固定化。1 9 7 3 年，日本首次在工业上成功地利用固定化微生物细胞连续生产L 天冬氨酸，接着，固定化细胞技

27、术受到广泛重视，并很快从固定化休止细胞发展到固定化增殖细胞。经过几十年发展，已形成较为完备的理论和方法【1 一。固定化技术3,4,5 1 是指利用物理或化学等手段，将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，固定在限定的空间区域，并保持细胞及其内酶的活性、并能够反复使用的方法。它包括固定化酶技术、固定化细胞技术和固定化藻技术。由于此技术既不需要把酶从细胞中提取出来，也不需要加以纯化，酶活力损失少i 因此固定化细胞技术己超过固，。定化酶技术的应用。固定化细胞技术是从固定化酶技术发展起来的，目前已广泛应用于工业、医学、制药、化学分析、环境保护、食品发酵及能源开发等多种领域6 7，8 1。在工业方面，

28、如利用产葡萄糖异构酶的固定化细胞生产果葡糖浆；将糖化酶与含Q 淀粉酶的细菌、霉菌或酵母细胞一起共固定，可以直接将淀粉转化成葡萄糖；利用海藻酸钙或卡拉胶包埋酵母菌，通过批式或连续发酵方式生产啤酒；利用固定化酵母细胞生产酒精或葡萄酒；此外，还可利用固定化细胞大量生产氨基酸、有机酸、抗生素、生化药物和甾体激素等发酵产品。在医学方面，如将固定化的胰岛细胞制成微胶囊，能治疗糖尿病；用固定化细胞制成的生物传感器可用于医疗诊断。在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，除上述医疗诊断外，还可测定醋酸、乙醇、谷氨酸等。此外，固定化细胞在环境保护、产能和生化研究等领域都有着重要的应用。固定化细胞技术与细胞在游

29、离状态下培养相比具有显著的优势：细胞生长密度增高；耐毒害能力增强；产物易于分离；酶活损失少、稳定性高；细胞可回收或循环使用、回收率高；反应过程易于控制；能够实现连续化操作；大大提高生产能力；生产工艺自动化、连续化，处理效率高，无二次污染、能耗低。因而迅速发展成为生物工程学中一个研究热点。第一章绪论1 1 2 固定化细胞方法常用于制备固定化细胞的方法主要有：吸附法、包埋法、共价结合法、交联法 9，1 0,1。(1)吸附法吸附法即利用微生物细胞自身带电和载体之间的静电力作用或者细胞核载体之间表面张力和粘附力作用，将细胞固定在载体表面和内部的方法。吸附法根据吸附力的不同又分为物理吸附和离子吸附两种。

30、物理吸附采用具有具有吸附能力的载体如硅胶、活性碳、多孔玻璃、石英砂和纤维素等。离子吸附是根据细胞在解离状态下静电引力(即离子键合作用)与带有相异电荷的离子交换剂作用，使细胞附着于带有相异电荷的上实现固定化。离子吸附载体主要有D E A E-纤维素、C M 纤维素等。吸附法具有操作简单，操作条件温和，载体可以反复使用等优点，但是因为吸附活化能较低，载体与细胞的结合力弱，细胞容易脱落，并且固定的细胞数量有限，因此使用受到限制。(2)包埋法包埋法是指将细胞包裹于凝胶网格结构中或半透性膜内，小分子物质可以自由扩散通过膜，大分子物质和细胞不能通过。该法操作简单，操作条件温和，不会明显影响生物活性，是目前

31、应用较广泛的方法。对于包埋材料的要求应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高，寿命长，价格低廉等。使用较多的材料有海藻酸盐、卡拉胶、壳聚糖、琼脂、聚丙烯酞胺凝胶、角叉藻聚糖、聚乙烯醇、光硬化性树脂等。(3)共价结合法共价结合法利用细胞或酶表面上功能基团(例如琉基、氨基、羟基、咪唑基、酚基等)与固相支持物表面反应基团之间形成化学共价键，制成固定化细胞或酶。该法中细胞或酶与载体之间的连接键能高，因此结合牢固，使用过程中不易发生脱落，稳定性良好，但是此法不足是反应剧烈、操作过程复杂、控制条件苛刻，此法制备得到的固定化细胞的死亡率较高。(4)交联法交联固定法是利用双功能或多功能试

32、剂与细胞或酶表面的反应基团(如氨基酸、硫基、羟基、咪唑基等)反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞或酶，通过共价键相结合。常用的交联剂有甲苯二异氰酸醋、戊二醛等。由于交联固定法化学反应比较激烈，固定化微生物的活力较脆弱。此外，交联法所用的交联剂价格较贵，因此限制了该方法的应用。2西北大学硕士学位论文1 2 生物微胶囊技术1 2 1 生物微胶囊概述生物微胶囊技术是一种新兴的细胞固定化技术，随着固定化酶在工业生产上的成功应用，引发了人们对固定化细胞的探索和热情，生物微胶囊法是细胞固定化的主要方法之一。生物微胶囊是采用半透囊膜将细胞或酶等生物质包裹在囊内形成微胶囊。微胶囊内部的物质称为囊芯，外部

33、由成膜材料形成的包覆膜称为微胶囊膜。微胶囊允许小分子营养物质自由进入和囊内代谢产物自由排出，同时阻止囊外生物大分子进入微胶囊。微胶囊技术的优势在于形成微胶囊时，囊芯被胶囊膜包覆与外界环境隔离，微囊膜起到保护膜内活性物质，并且可以控制膜内、外小分子物质的传递。随着生物技术和膜技术研究的不断深入，微胶囊制备方法不断完善，应用领域正在不断扩宽，在各个领域都得到了极大应用，前景广阔。微胶囊作为一种极有前途的载体，已被用于细胞培养、细胞和酶固定化、药物缓控释、人工器官及基因运载工具、抗癌药物筛选等生物医学领域阮1 3，1 4】oC h a n g E l 5】于1 9 5 7 年首次提出了“人工细胞”概

34、念。随后报道了将酶、蛋白质和激素等生物活性物质包埋在不同材料的微胶囊中，并能够长时间内保持活性，为人工细胞的研究拉开了序幕。8 0 年代，L i m 1 6】将微囊化技术与组织细胞移植相结合，制备了具有良好生物相容性海藻酸钠聚赖氨酸(A P A)微胶囊，包埋猪胰岛细胞形成“人工细胞，作为免疫隔离工具移植人糖尿病大鼠体内，结果表明该“人工细胞”成功地调节了血糖水平，具有鼠胰腺功能，被称为“人工胰腺”。从此为细胞移植治疗神经内分泌系统疾病提供了新思路。9 0 年代微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具 1 刀，利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能，治疗相关疾病。随着生物微囊化技术研究的进一步

35、发展，结合基因工程技术的发展，生物微胶囊对基因工程茵进行包埋，将研究扩展到器官移植领域。目前，生物微胶囊技术不仅广泛应用于医药卫生领域，同时通过固定化细胞进行日用化学工业的研究也日益增多。生物微胶囊已经成为材料、化学、化工、生物和医学等多学科领域工作者的研究热点，具有广阔的应用前景。1 2 2 生物微胶囊材料生物微胶囊的制备材料选择是制备微胶囊的重要环节。适合于制备生物微胶囊的材料需要符合几点原则：1)成膜材料中至少有一种聚合物：2)聚合物带有电荷或通过调节p H 值而带有电荷，以便于与具有相反电荷的物质发生凝聚成膜反应；3)成膜材料要具有良好的生物相容性；4)材料易得，生物稳定性好，晁面反应

36、条件温和，界面凝聚3第一章绪论反应迅速。常用于生物微胶囊的材料主要分为天然、半合成和合成高分子三类。天然的主要有脂类如卵磷脂，多糖如海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、淀粉，蛋白质如明胶、白蛋白、纤维蛋白；半合成材料有羧甲基纤维素钠，醋酸纤维素等；合成材料有乳酸乙醇酸共聚物、聚内酯、聚酐、聚氨基酸、聚酰胺、聚氯乙烯等。带电荷的天然多糖和聚氨基酸是制备生物微胶囊的最理想的聚电解质，聚阴离子如纤维素硫酸钠、海藻酸钠等，聚阳离子如脱乙酰壳多糖、聚L 赖氨酸等。合成的聚阴离子一般细胞毒性也很小，如高分子量的聚丙烯酸等。其中因为天然材料一般具有无毒、免疫原性低，生物相容性好、可降解等特点，使其得到广泛应用。尤其是海

37、藻酸盐、壳聚糖等天然多糖因其资源丰富、制备简单、价格便宜，具有很大应用价值。对于合成材料，应用较多的是乳酸乙醇酸共聚物，多用于药物缓控释材料 1 8】。1 2 3 生物微胶囊制备方法微胶囊的制备方法主要有化学法、物理化学法和物理法。化学法有界面聚合法、原位聚合法、凝聚法、乳化法、辐射化学法；物理化学法有相分离法、溶剂蒸发法、界面沉淀法、喷雾干燥法；物理法有静电沉积法、气相沉积法、流化床喷雾包衣法、喷雾干燥法等。由于生物微胶囊所包埋的是具有生物活性的酶或细胞，因此要求制备条件温和能满足医药和生物技术中保持生物活性的要求【l8】。凝聚法 1 9 2 0】：通过对体系温度、p H 值和组成等参数的调

38、节使聚合物溶液的液滴分成内外二层，液态内核为凝聚层，外层为预膜层，然后采用加热、交联或溶剂移除等方法使预膜层固化，从而制得外膜包裹液芯的微胶囊。界面聚合法【2 1，捌：通过在界面处发生聚合反应制备生物微胶囊的一种方法。首先是一种单体水溶液在搅拌力的作用下分散于有机相中，然后加入另一可溶于有机相的单体，油溶性单体和水溶性单体在界面处发生聚合反应生成膜，得到囊芯为液态的胶囊。预凝胶溶解澍2 3,2 4】：首先制备得到球形的水凝胶，然后将此凝胶放入另外一种聚合物水溶液中，聚合物分子与凝胶表面的基团反应形成覆盖在凝胶表面的膜，然后溶解囊内的凝胶，使之成为液态内核的胶囊。1 2 4 生物微胶囊的性能生物

39、微胶囊的主要应用优势在于它可以保护固定化细胞或酶免于囊外有机、有毒物质的毒害，给细胞或酶提供一个温和的生存环境。因此对微胶囊性能的要求主要有以下4西北大学硕士学位论文几方面 2 5,2 6,2 7】：1 机械强度：机械强度主要指生物微胶囊能够承受压力、剪切力、溶胀等各种作用力的大小，包括搅拌、分离、重复使用等生产和处理过程中所能承受的负荷能力。微胶囊膜的机械强度的大小决定了微胶囊在生物环境中能否保持形态完整，保证囊内细胞或生物质活性。测量微胶囊机械强度的方法主要有：1)膜厚度表征法；2)单轴按压法；3)膨胀度法等。2 传质性能 2 8】：微胶囊膜对小分子物质的传递性能是其应用的关键，尤其对于固

40、定化细胞培养，因为营养物质的流入与代谢产物的流出从根本上决定了固定化细胞功能的正常发挥。传质性能主要包括分子在囊膜中的扩散系数和微胶囊膜的截留分子量这两个参数。扩散系数表明小分子物质透过胶囊膜的速率；截留分子量是指不能透过微囊膜的最小分子量，主要反映微胶囊膜对不同分子量溶质的阻隔能力。小分子在囊膜中的扩散系数的方法是将空白微胶囊放入底物分子溶液中，使底物分子向囊内扩散，直到达到平衡，记录底物溶液中底物浓度随时间的动态变化，根据数学模型来描述物质通过微胶囊膜的扩散行为，由模型计算出溶质在微胶囊膜中的扩散系数。截留分子量的测定一般采用一系列已知分子量的物质，考察其通过微胶囊的扩散情况，不能通过的最

41、小分子量即为截留分子量，此种方法较粗略，或者用多分散葡聚糖结合凝胶色谱测量较为精确。3 生物微胶囊的生物相容性【2 9 3 0 3 1】：对于生物微胶囊其主要应用目的是保护并运载生物活性物质或细胞，因此其材料除了应具备一定物理化学性质外，还需要维持生物质和细胞的活性功能。生物相容性是指制备微胶囊的材料和微胶囊是否对固定化细胞或酶的存活、生长有毒害或抑制作用，是否会引起细胞生理现象的改变。尤其在器官移植领域，微胶囊的生物相容性还包括是否引起移植受体的免疫排斥反应和微囊膜表面是否会蔓生微纤维等，材料是否会引起宿主异常反应，如过敏炎症等。宿主或生物体不能对材料产生较大的影响如老化、变性等。由此看来，

42、微胶囊的生物相容性对固定化细胞和酶的应用具有决定性的影响。1-3 海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠(A C A)液芯微胶囊1 3 1A C A 液芯微胶囊概述A C A 液芯微胶囊基于其良好的性能已被开始应用于药物缓控释、细胞发酵培养、微反应器、人体器官移植、基因运载工具和分离介质等领域。海藻酸盐、壳聚糖等天然多糖资源丰富，价格便宜，作为生物微胶囊制备材料具有巨大的潜力。A C A 液芯微胶囊制备条件温和，生物相容性好，免疫原性低等优点，因此A C A 液芯微胶囊越来越广5第一章绪论泛地应用于微生物固定化培养领域【3 2 3 3,3 4,3 5,3 6】。在微生物细胞培养方面，与游离培养环境相比，囊内液

43、芯环境对细胞的生长、代谢情况具有重要的影响3 7,3 8】。1 3 2 海藻酸钠海藻酸(A l g)是最常用的微胶囊制备材料，它是从褐藻类海洋生物中提取出的线性阴离子天然多糖，由a L-古罗糖醛酸与其立体异构体p D 甘露糖醛酸两种结构单元通过(1-4)糖苷键聚合而成的一种无支链的线性嵌段共聚物【3 9,4 0 。海藻酸钠的独特性质是从溶胶向含水量 9 5 的凝胶转变：当其遇见C a 2+等二价阳离子，在离子移变作用下C a 2+将N 矿置换出，形成既有机械强度又有弹性的海藻酸钙凝胶。海藻酸钙凝胶不仅材料易得、价格低廉、无毒害性、机械强度较高等特点，而且具有良好的生物相容性和温和的溶胶凝胶转变

44、过程，并且三维网状凝胶结构有利于微生物细胞生长代谢和细胞的稳定化，对于维持生物细胞活性很重要【4 1 1。海藻酸盐分子结构如图1 1 所示 4 2】：HHO图1 1 海藻酸盐的化学结构，G 是古罗糖醛酸单元，M 是甘露糖醛酸单元F 培1-1C h e m i c a ls t r u c t u r eo fa i g i n a t e，Gr e p r e s e n t sG u l u r o n i ca c i dg r o u p，Mr e p r e s e n t sM a n n u r o n i ca c i dg r o u p海藻酸钠与c a 2+由均相液态转变为凝

45、胶态的机理是：1 个c a 2+与2 个G G 单元通过4 个配位键形成具有2 个六元环结构的稳定螯合物，即蛋格 结构，如图1 2 所示f 4 3，“】o其基本反应方程式如下：2 n N a A l g i n a t e+n C a 2+-n C a 2+A l g i n a t e+2 n N a+6西北大学硕士学位论文图I-2 海藻酸盐与钙离子凝胶的。蛋格”结构F i g 1-2 E g g-b o x”s t r u c t u r eo fg e l a t i o nw i t ha l g i n a t ea n dc a l c i u mi o n1 3 3 壳聚糖壳聚糖

46、(C m)是自然界中少见的直链阳离子聚合物，是重要的一类天然生物降解高分子。壳聚糖是甲壳素在碱性介质中经脱乙酰化反应水解脱去5 0 以上乙酰基制得的一种聚氨基多糖，它的化学名是聚(1，4)2 一氨基2 脱氧p D 葡聚糖【4 5】，壳聚糖侧链结构中含有大量的伯氨基，能够在水溶液中与海藻酸钠等阴离子聚电解质发生络合反应，形成由聚电解质络合物构成的高分子半透膜。由于壳聚糖无毒，生物相容性好，可生物降解，资源丰富，价廉易得等特点，已经成为生物医学领域广泛应用的生物材料 4 6,4 7,4 8】。1 3 4 壳聚糖海藻酸钠成膜机理壳聚糖、海藻酸钠的成膜机理是聚电解质阴离子与阳离子间的库仑力的作用，形成

47、不溶于水的聚电解质络合物膜。此外分子间的其它相互作用力(氢键、静电斥力等)也会对形成的络合物结构和构象有非常重要的影响。聚电解质水溶液中产生聚离子和带有相反电荷的小分子离子。在溶液中聚离子的分子链上有一定的电荷密度分布，相互间存在强大的静电斥力，使分子链比较伸展，并且浓度越稀，离解程度越大。随着聚电解质溶液浓度增加的增加，由于聚离子能键合的反离子增多，分子链的有效电荷密度相对降低，静电斥力相应减弱，分子链较为卷曲。所以聚电解质的分子量的大小及其电荷分布密度是聚电解质的两个最重要的特性，决定了聚电解质在溶液中的构象情况。壳聚糖一海藻酸钠生物胶囊成膜机理为，壳聚糖分子中存在大量的伯氨基，带正电荷，

48、海藻酸钠分子中带大量的羧基带负电荷，壳聚糖和海藻酸钠可以通过正负电荷吸引形成聚电解质膜，其简图如下【4 9 5 0】：7第一章绪论I I l 3+H，+一3+H 一H 3 H 3-图l-3 海藻酸盐与壳聚糖静电作用示意图F i g 1-3S c h e m eo fe l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e na l g i n a t ea n dc h i t o s a n1 3 5A C A 液芯微胶囊的制备方法对于A C A 液芯微胶囊主要有三种制备方法，预凝胶溶解法，一步式液芯法，复合洼 5 1，5 2，5 3

49、 1 厶o1 预凝胶溶解法预凝胶溶解法是将海藻酸钠滴入C a C l 2 溶液中，在C a 2+作用下形成海藻酸钙凝胶，将海藻酸钙凝胶用壳聚糖(或聚赖氨酸)溶液覆膜后，加入螯合剂(如E D T A 柠檬酸钠等)又可以将C a 2+置换出来，由于壳聚糖是一种带正电荷的聚合物，它在海藻酸盐(带负电荷)周围形成一层半透膜，这层膜在有C a 2+的螯合剂或抗凝胶剂存在时不会溶解，而胶粒内的海藻酸变成了液态，细胞悬浮在囊内生长。这样既有利于细胞的生长，又可以避开外界的不利环境，保持细胞较高的生理活性，同时可以达到较高的细胞密度。2 一步式液芯法一步式液芯法是将壳聚糖和C a C l 2 溶液的混合溶液直

50、接滴入海藻酸钠溶液中反应，得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层，内部是液态的微胶囊。或者反向操作将海藻酸钠溶液滴入壳聚糖和C a C l 2 溶液的混合溶液中制成液芯微胶囊。3 复合法复合法是基于上述两种方法，先制备海藻酸钠壳聚糖微胶囊，然后再以双功能团分子对微胶囊的表面进行修饰。首先将海酸钠溶液乳化、凝胶化，再将凝胶化海藻酸盐与壳聚糖进行反应形成微胶囊，最后微胶囊用戊二醛、苯四甲酸二酐溶液交联。针对液滴生成聚电解质络合技术，采用静电液滴生成技术，即静电液滴发生器，在电场力作用下制备粒径均匀一致的胶珠，然后进行成膜反应。该方法制备的微胶囊形状规则呈球形，表面光滑，均匀一