流式细胞仪分析技术应用.ppt

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1、实验室流式细胞仪单细胞分选技术流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。选的新技术。流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，

2、测量快速、大量、准确、灵敏、定量细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞术的特点 （1 1）液流系统液流系统 （2 2）光学系统光学系统 （3 3）数据处理系统数据处理系统1.流式细胞仪的基本结构：流式细胞仪的基本结构：通过流式细胞仪进行细胞分选通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。进一步培养和研究时进行的。细胞分选原理细胞分选原理细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压

3、电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理分选速度：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。的百分率。分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际

4、得率。胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。与分选速度成反比。（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双、双参数散点图参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维、假三维等高图等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、参数

5、参数单参数直方图单参数直方图双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析:REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图单参数直方图单参数直方图细细胞胞相相对对数数量量双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的

6、两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图（二）双参数直方图1.双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度2.二维等高图二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是由类似地图上的等高线组成，其

7、本质也是双参数直方图。双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即胞相对或绝对数，即“等高等高”。曲线层次越高曲线层次越高(越里面的线越里面的线)所代表的细胞所代表的细胞数愈多。数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。二维等高图二维等高图3.假三维等高图假三维等高图（三）三参数直方图（三）三参数直方图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。号可根据需要进行组合分

8、析。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析 Gate Gate设置：指在某一张选定参数的直设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术三、设门分析技术A A 淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核

9、细胞C C 中性粒细胞中性粒细胞A A、B B、C C均均为任意门为任意门线性门线性门样本制备样本制备标记染色标记染色液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 第四节第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞分离单个核细胞培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法机械法酶处理法酶处理法化学试剂

10、处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）1 Phosphate Buffer Saline or HBSS(Ca/Mg+free)1 mM EDTA25 mM HEPES pH 7.01%Fetal Bovine Serum(Heat-inactivated)Sorting Buffer淋巴淋巴细胞细胞：1x HBSS(with Ca+/Mg+)含含1%FBS HBSS配方中的配方中的阳离子阳离子可可增加

11、细胞增加细胞的生存力。的生存力。由由于这些细胞并非易于聚集于这些细胞并非易于聚集，即便配方中沒有，即便配方中沒有EDTA也不也不会会造成造成问题问题。较黏着较黏着较黏着较黏着的的的的细胞细胞细胞细胞(sticky cells)(sticky cells)：提高提高提高提高EDTA EDTA 到到到到 5mM 5mM 并并并并使用透析使用透析使用透析使用透析过过过过的的的的FBS FBS(against Ca+/Mg+free PBS)(against Ca+/Mg+free PBS)。某些。某些。某些。某些细胞细胞细胞细胞在活在活在活在活化化化化会比较会比较会比较会比较黏著而黏著而黏著而黏著而

12、EDTAEDTA可抑制此作用可抑制此作用可抑制此作用可抑制此作用贴壁贴壁型型细胞细胞株株(Adherent cells)：以以Trypsin处理后处理后去去准备单细胞悬液时准备单细胞悬液时，待，待细胞变圆细胞变圆(切记切记不可不可过度过度作用作用)，便以，便以5 ml 含含5%血清血清培养液培养液收取收取细胞细胞，并并均匀均匀地打散地打散细胞悬液细胞悬液。离心后离心后，用，用sorting buffer调整细胞调整细胞浓度浓度。如果需要的。如果需要的话，话，可以提高可以提高EDTA的的浓度浓度(至至5mM)以以避免細胞重新黏聚。避免細胞重新黏聚。含有高比例死細胞的含有高比例死細胞的含有高比例死

13、細胞的含有高比例死細胞的样本样本样本样本：Sorting bufferSorting buffer加加加加5mM MgCl25mM MgCl2以及以及以及以及2550 g/mL 2550 g/mL DNAase I(Sigma D-4513)DNAase I(Sigma D-4513)或是或是或是或是Sorting bufferSorting buffer加加加加0.83mM 0.83mM MgCl2MgCl2以及以及以及以及20 U DNAase II(Sigma D-4138)20 U DNAase II(Sigma D-4138)。这些这些这些这些配方配方配方配方可減少因死可減少因死可減

14、少因死可減少因死细胞释放细胞释放细胞释放细胞释放出來的出來的出來的出來的DNADNA所造成的所造成的所造成的所造成的细胞细胞细胞细胞黏聚黏聚黏聚黏聚现象现象现象现象。尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素PE-Cy5/APC&PerCP-Cy5.5/APCPE-Cy5/APC&PerCP-Cy5.5/APC为弱表达的抗原选择较亮的荧光素为弱表达的抗原选择较亮的荧光素为弱表达的抗原选择较亮的荧光素为弱表达的抗原选择较亮的荧光素CD62L on CD8+TCD62L on CD8+T防止耦联染料降解（光照防止耦联染料

15、降解（光照防止耦联染料降解（光照防止耦联染料降解（光照/固定固定固定固定/升温等）造成的干扰升温等）造成的干扰升温等）造成的干扰升温等）造成的干扰APC-Cy7/PE-Cy7APC-Cy7/PE-Cy7二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素Minimize the potential for spectral overlap Spillover estimates available in the spectra viewer2 2FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.AP

16、CPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料（一）几种常见的荧光染料名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋

17、白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在结合在一起，在488nm488nm激发光照射下，通过激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再一个荧光染料被激发后

18、产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。测到该特定荧光信号。能量传递复合染料能量传递复合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷花青苷5 5藻红蛋白藻红蛋白能量传递复合染料机制能量传递复合染料机制多色分析时组合抗体的使用原则在免疫表型分析中，常常把多种荧光素标记抗体同时组合在一起进行多色分析，但并非多种抗体均可以自由组合在一起使用。在多数荧光素标记抗体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和组合应用的结果进行比较，一旦这种组合显示出与单独应用时无差别的结果时，这种组合才可以应用于多色免疫表型分析。在

19、单独或组合应用时，应注意抗体的稀释度。如3种抗体单独使用时的最佳用量为20l，而3种抗体组合应用时如果各加20l，总体积会增至60l，因此每种抗体的浓度被稀释成原来的1/3，不再是最佳用量。因此组合抗体应用浓度应比单独抗体使用浓度高。一种新的抗体组合设计后必须进行这种比对试验，这种组合一旦应用与临床，不可随便改换抗体组合或抗体的克隆。一般情况下多色分析荧光素标记抗体组合最好采用同一种工艺制作的为佳。血液系统单细胞分选血液系统单细胞分选标准化的建立标准化的建立背景干细胞的研究意义现在已经越来越重要。白血病干细胞的研究一直走在整个学科的前沿，引领学科的发展。越来越多的证据显示干细胞自我更新及分化的

20、分子机制都是在单细胞水平上发生的，单细胞技术的发展为干细胞的研究奠定了重要基础。现有的单细胞技术主要包括单细胞分选、培养、单细胞PCR、单细胞多色Fish、单细胞基因组及表观遗传学分析、免疫缺陷鼠移植鉴定在内的单细胞技术。拟解决的关键科学问题拟解决的关键科学问题所有的单细胞实验技术中，干细胞的单细胞分选是最为关键，也是最为基础的一个环节。影响单细胞分选效果的因素有很多。（比如目的分离细胞群的不同，分选的仪器选择，抗体标记的染料的选择，不同荧光颜色之间的补偿计算，样品的准备，收集工具的不同等。)单细胞分选的标准化建立非常重要，尤其我重点实验室研究工作主要以血液系统为研究对象，更加有意义。研究目标

21、研究目标 通过对机器参数的调整，激光功率的确认，补偿的量化处理，接收工具的模板化和抗体组合的优化建立一套针对白血病干细胞和正常造血干细胞的分选标准。研究方法研究方法荧光抗体的选择荧光抗体的选择分选仪器的比较分选仪器的比较补偿计算的量化精确调整补偿计算的量化精确调整接收工具的模板标准化接收工具的模板标准化单细胞的培养鉴定单细胞的培养鉴定荧光抗体的选择荧光抗体的选择种属来源：人正常造血干细胞分选标记：Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow白血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD71-CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+种属来源：鼠正常

22、造血干细胞分选标记:Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2-或者 Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-MLL-AF9 AML白血病干细胞的分选标记:Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32+CD34+或 c-Kit+Gr-1-BCR-ABL CML 白血病干细胞的分选标记:Lin-Sca-1+c-Kit+分选仪器的比较分选仪器的比较石英杯激发石英杯激发原理原理：激光检测是在石英杯中进行的优点优点：比色皿提供层流和增强的样品聚焦，对于敏感性来说，石英杯激发系统明显占优。缺点缺点：石英杯长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰，细胞需要通过不同

23、的介质，且速度不一样，高速下细胞密度变大，与流动池和喷嘴接触面变大，不能保证在液滴延迟时间内到。空气激发空气激发原理原理：激光检测是在细胞通过喷嘴后的液滴中。优点优点：硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的可用的激光数多，液流更稳定，能在高速情况下准确在液滴延迟时间内到达。保持细胞清洁的更好，并且能提供额外的激光束。缺点缺点：对于敏感性来说，空气激发不那么敏感。补偿计算的量化精确调整补偿计算的量化精确调整 购买补偿微球（comp-beads），标记实验中所需要涉及的抗体，孵育后作为单阳补偿管，进行上样通过圈门调整微球群中位数，修正所有补偿。建立良好的补偿矩阵，这样的补偿计算更标准

24、。接收工具的模板标准化接收工具的模板标准化 因为实验的需求不同，所以单细胞分选到不同接收器中，这其中包括24孔板，96孔板，72孔板乃至384孔板等，在每个机器上调整相应模板，使其固定为标准化的模板，每次使用直接调用，不需要重复进行调整。这将极大提高分选效率和精确性。单细胞的培养鉴定单细胞的培养鉴定 将分好的单细胞至于相应的培养基中进行14天培养，培养后对每板细胞存活比例进行统计，然后对存活的各孔细胞向各系进行分化趋向的统计。1 细胞细胞/孔孔IMDM+10%FBS+SCF 100ng/mL+TPO 50ng/mL+Flt3L 100ng/mL14天天检测nmEM四系分化：人（CD19，CD3

25、3），鼠（Gr-1，Mac-1，Ter119，CD41）技术路线CD34-PE CD38-FITCCD34+CD38-细胞 1/PE-Isotype;FITC-Isotype :设置阴性对照门,去除抗体非特异性吸附的影响2/CD34-PE;FITC-Isotype :单阳管对照,设置补偿3/CD38-FITC;PE-Isotype :单阳管对照,设置补偿4/CD34-PE;CD38-FITC :检测分选管适当的制备方式适当的制备方式处理红细胞处理红细胞实体组织来源标本用机械法实体组织来源标本用机械法温度温度25253737，pH7.0pH7.07.27.2四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制（一）单细胞悬液制备的质控（一）单细胞悬液制备的质控温度温度pHpH染料浓度染料浓度固定剂固定剂（二）免疫荧光染色的质控（二）免疫荧光染色的质控培养基及血清的选择培养基及血清的选择温度温度离心速度离心速度无菌操作无菌操作（三）分选后细胞的培养（三）分选后细胞的培养