消毒剂消毒效果定性试验标准 应用稀释法2022版.pdf

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1、ICS 11.080CCS C 59WS中中华华人人民民共共和和国国卫卫生生行行业业标标准准WS/T 7982022消毒剂消毒效果定性试验标准 应用稀释法Qualitative testing standard on disinfection effect of disinfectantuse dilutionmethod2022 - 01 - 24 发布2022 - 06 - 01 实施中中华华人人民民共共和和国国国国家家卫卫生生健健康康委委员员会会发发布布S/T 7982022I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14试验材料.15染菌载体的制备.26中和剂鉴定试验.

2、37杀菌试验.58结果判定.59注意事项.6附录 A（规范性附录）培养基和试剂.7S/T 7982022II前言本标准由国家卫生健康标准委员会消毒标准专业委员会负责技术审查和技术咨询， 由中国疾病预防控制中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委综合监督局负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国人民解放军疾病预防控制中心。本标准主要起草人：佟颖、于礼、沈瑾、魏秋华、王劲、韩杰、安伟、肖潇、高迪。S/T 79820221消毒剂消毒效果定性试验标准应用稀释法1范围本标准规定了消毒剂消毒效果定性试验应用稀释法的试验材

3、料、 染菌载体的制备、 中和剂鉴定试验、杀菌试验、结果判定和注意事项。本标准适用于消毒剂对光滑硬质物体表面的实验室定性消毒效果评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。WS/T 683消毒试验用微生物要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1应用稀释法 use dilution method采用定性方法评价消毒剂对不锈钢圆筒载体上试验微生物杀灭效果的检测方法。4试验材料4.1试验微生物4.1.1金黄色葡萄球菌(Staph

4、ylococcus aureus)作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表，试验菌种为ATCC 6538。4.1.2铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为医院感染中常见分离的细菌繁殖体的代表，试验菌种为 ATCC 15442。4.1.3肠炎沙门菌(Salmonella enterica)，试验菌种为 ATCC 10708。4.2培养基4.2.1传代培养基营养肉汤或合成肉汤培养基，用于细菌传代培养，见附录A。4.2.2中和试验培养基4.2.2.1基础培养液：营养肉汤或液体硫乙醇培养基，作为中和试验的基础培养基，见附录 A。S/T 798202224.2.2.2中和剂培养液：根据

5、消毒剂有效成分选择相应中和剂加入基础培养基液中制备成为中和剂培养液，中和剂培养液需经中和剂鉴定试验验证合格后方可使用。4.2.3其他培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），用于染菌载体的菌落计数，见附录A.5。4.3其他试剂和材料4.3.1磷酸盐缓冲液(见附录 A.6)。4.3.2标准硬水(见附录 A.7)。4.3.3有机干扰物：采用 3%牛血清白蛋白；如为清洁物品采用 0.3%牛血清白蛋白。4.3.4载体：304 不锈钢圆筒，表面抛光，外径 8 mm1 mm，内径 6 mm1 mm，壁厚 1 mm0.5 mm，长度 10 mm1 mm。4.3.5吊钩：长度为 50 mm75 mm，直径为 0

6、.5 mm 的镍铬合金丝，末端 3 mm 呈直角弯曲。4.3.6滤纸：直径为 90 mm 的定性滤纸。4.3.7器皿：25 mm100 mm 玻璃试管，直径为 90 mm 的平皿，10 mL 吸管，移液器等。4.4仪器设备级及以上生物安全柜、恒温培养箱、振荡培养箱、恒温水浴箱、计时器等。5染菌载体的制备5.1载体准备5.1.1外观检查载体经肉眼观察合格，方可使用。如有可见破损如钝化、缺口、凹陷或凿孔等应剔除。5.1.2清洗将载体置于1 mol/L NaOH溶液中浸泡约12 h，用去离子水反复冲洗3次4次，收集冲洗水加入2滴3滴1%酚酞溶液，如酚酞变为粉红色，表明有NaOH残留，需要继续冲洗至酚

7、酞不变色，将载体晾干后密闭保存。5.1.3筛选测试5.1.3.1测试要求未使用过或使用过但试验中无菌生长的载体，不需进行筛选测试，经压力蒸汽灭菌后可使用。使用过的载体且在试验中有菌生长，应进行筛选测试，测试合格方可使用。5.1.3.2测试方法按照7.1规定，在无有机干扰物条件下，选用500 mg/L苯扎氯铵消毒液对铜绿假单胞菌消毒作用10min，以Letheen肉汤作为中和剂培养液，对每个载体进行杀菌试验。5.1.3.3测试结果判断无菌生长为载体筛选测试合格，测试管中有菌生长，则该载体不合格。S/T 798202235.1.4灭菌载体染菌前，将清洗后的载体放入试管中，加入去离子水至载体完全浸没

8、，经压力蒸汽灭菌后，冷却至室温备用。5.2菌悬液的制备5.2.1参照 WS/T 683 的规定复苏菌种， 接种于含 10 mL 营养肉汤或合成肉汤的试管中， 经 36 1 ，200 r/min20 r/min 振荡培养 24 h2 h，此为第 1 代培养物。5.2.2用移液器取第 1 代培养物 10 L 转种于含 10 mL 营养肉汤或合成肉汤的试管中， 经 36 1 ，200 r/min20 r/min 振荡培养 24 h2 h，此为第 2 代培养物，可继续传代培养至第 5 代。5.2.3用移液器取第 15 代的 24 h 新鲜培养物 10 L 转种于 10 个含 10 mL 营养肉汤或合成

9、肉汤的试管中，经 36 1 静置培养 48 h56 h 后备用。5.2.4铜绿假单胞菌培养物应去除培养菌液表面的菌膜，或使用 10mL 吸管直接从溶液中部吸取菌液，放入另一个试管中。不可使用含菌膜的菌悬液进行试验。5.2.5将金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌和去除菌膜的铜绿假单胞菌培养菌液用电动混匀器振荡混合20s，室温静置 10 min 后，用 10 mL 吸管吸取上层四分之三的菌液转移至新的试管中混匀，以去除细菌碎片和团块，菌悬液于 4 冷藏保存备用，于 30 min 内使用。5.2.6根据消毒剂的检测要求，按照 WS/T 683 的规定加入有机干扰物。5.3载体染菌5.3.1每次试验时取 80

10、 个无菌载体染菌，首先向 4 个无菌试管（25 mm100 mm）中分别加入 20 mL制备好的菌悬液， 依次向每管菌液中加入 20 个干燥无菌载体， 确保载体完全浸没于菌液中， 持续 15 min2 min。5.3.2用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余菌液，垂直放置于无菌的双层滤纸上，置 36 1 恒温培养箱内干燥 40 min2 min 后，于 2 h 内进行试验。5.4染菌载体菌落计数5.4.1随机挑选 2 个染菌载体，分别放入 2 个含 10 mL 营养肉汤的 50 mL 离心管中，用电动混匀器剧烈振荡混匀 20 s 进行洗脱，使用磷酸盐缓冲溶液进行 10 倍系列稀释。5.4.2

11、选择适宜的稀释度,吸取 1 mL 加入无菌平皿中， 将冷却至 40 45 的熔化营养琼脂培养基，倾注于平皿中，平行接种于 2 个平皿，置 36 1 恒温培养箱中培养 48 h2 h 后进行菌落计数。5.4.3每个染菌载体上金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收菌量为 1.0106CFU/载体1.0107CFU/载体，肠炎沙门菌的回收菌量为 1.0105CFU/载体1.0106CFU/载体。6中和剂鉴定试验6.1试验原则通过中和剂鉴定试验结果， 判断所选中和方法对消毒剂是否有效中和。 若中和组显示可有效中和，则仅使用中和剂培养液进行中和。若中和组结果显示未完全中和，而中和组为有效中和，则在选用中和剂

12、培养液进行中和的基础上，再使用培养液进行二次中和。如仍显示未完全中和，则继续进行中和组试验。试验重复三次。6.2菌悬液的稀释S/T 798202246.2.1取 1 mL 制备好的菌悬液加入 9 mL 磷酸盐缓冲溶液中进行 10 倍梯度稀释，取 4 个稀释梯度（举例：10-4、10-5、10-6和 10-7）进行中和试验。6.2.2同时取 4 个稀释梯度各 1.0 mL 采用倾注法接种于 TSA 平板中，置 36 1 恒温培养箱中培养 48 h2 h 后，进行菌落计数。6.3中和组6.3.1试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。6.3.2选取 4 个无菌载体加入 10 mL

13、消毒剂溶液中，作用至规定时间后，用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余消毒液，分别转移至 4 管含有 10 mL 中和剂培养液的试管中。6.3.3向上述 4 管中和剂培养液中分别接种 0.1 mL 4 个稀释梯度（10-4、10-5、10-6和 10-7）的菌液，置 36 1 恒温培养箱中培养 48 h2 h。6.4中和组6.4.1重复 6.3.1 和 6.3.2，载体在中和剂培养液中室温静置 30 min 后，用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余液体，分别转移至 4 管含 10 mL 基础培养液的试管中。6.4.2向上述 4 管培养液中分别接种 0.1 mL 4 个稀释梯度（10-4、

14、10-5、10-6和 10-7）的菌液，置 36 1 恒温培养箱中培养 48 h2 h。6.5阳性对照未暴露于消毒剂的中和剂培养液和基础培养液各4管，分别接种0.1 mL 4个稀释梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36 1 恒温培养箱中培养48 h2 h，作为阳性对照。6.6阴性对照中和剂培养液和基础培养液各1管加入无菌载体， 不接种菌液， 置36 1 恒温培养箱中培养48h2 h，作为阴性对照。6.7结果判定6.7.1菌悬液浓度菌悬液计数最后两个稀释梯度（如10-6和10-7），至少有一个稀释梯度的菌悬液的数量在5 CFU/mL100 CFU/mL范围内。6.7.2阳性

15、对照基础培养液管有菌生长表明试验菌、 培养液性能良好， 中和剂培养液管有菌生长表明中和剂对试验菌生长无明显影响。6.7.3阴性对照应无菌生长。6.7.4中和组接种菌量较低（5 CFU/mL100 CFU/mL）的中和剂培养液管中有菌生长，认定为中和剂可有效中和消毒剂， 且中和产物对试验菌生长无明显影响。 若无菌生长或仅在接种高浓度菌液的试管中生长表明未完全中和，或中和产物有抑菌作用，需进行中和II组试验。S/T 798202256.7.5中和组接种菌量较低（5 CFU/mL100 CFU/mL）的培养液中有菌生长认为中和有效。7杀菌试验7.1试验步骤7.1.1用标准硬水配制消毒剂溶液至作用浓度

16、，以每管 10 mL 分装至 60 个无菌试管（25 mm100 mm）中，置于 20 1 水浴中平衡 10 min。7.1.2用灭菌后的吊钩以 20 s5 s 间隔依次向每管消毒液中加入一个染菌载体，加入过程中勿触碰管壁，轻柔振荡 23 下后放入于 20 1 水浴中。7.1.3消毒作用至规定时间后，用灭菌后的吊钩依次钩取染菌载体，轻触管壁去除多余消毒液，转移至 10 mL 中和剂培养液管中，加入时勿触碰管壁。7.1.4振荡混匀，置 36 1 恒温培养箱中静置培养 48 h2 h。7.1.5若中和剂鉴定试验结果显示中和 I 组未完全中和， 在中和剂培养液中静置 30 min 后用灭菌后的吊钩将

17、染菌载体取出后，转移至基础培养液管中，振荡混匀后进行培养。7.2阳性对照将未经消毒处理的染菌载体 2 个，分别放入 10 mL 中和剂培养液和 10 mL 基础培养液管中振荡混匀，置 361恒温培养箱中静置培养 48 h2 h。7.3阴性对照将无菌载体2个分别放入10 mL中和剂培养液和10 mL基础培养液中振荡混匀，置36 1 恒温培养箱中静置培养48 h2 h。7.4试验次数试验重复三次。8结果判定阳性对照管应有菌生长，阴性对照管应无菌生长。消毒剂标注的消毒对象为光滑硬质物体表面时，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的三次重复杀灭效果均应达到表1的要求，即金黄色葡萄球菌的杀灭试验，阳性管数为0

18、3个，且阳性对照菌量对数值为67时，判定为合格，铜绿假单胞菌的杀灭试验，阳性管数为06个，且阳性对照菌量对数值为67时，判定为合格。表 1消毒剂应用稀释法对微生物杀灭效果的判定试验微生物阳性管数（个）试验管数（个）阳性对照菌量对数值金黄色葡萄球菌036067铜绿假单胞菌066067S/T 79820226表 1 （续）试验微生物阳性管数（个）试验管数（个）阳性对照菌量对数值肠炎沙门菌016056注：当消毒剂说明书标注对肠炎沙门菌有效时，增加肠炎沙门菌的杀灭效果试验，对肠炎沙门菌的三次重复杀灭试验，也应符合阳性管数为01个，且阳性对照菌量对数值为56的要求。9注意事项9.1金黄色葡萄球菌在试验中

19、可使用营养肉汤或液体硫乙醇培养基作为基础培养液，Letheen 肉汤对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。9.2同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，应按微生物种类分别进行中和剂鉴定试验。9.3染菌载体转移至消毒剂管时应避免触碰管壁，严格无菌操作，操作中产生的微生物气溶胶可能导致测试管假阳性。9.4在结果判定时，如培养液未出现混浊，但发生颜色变化或出现膜状物，应与阳性对照对比来判定结果，并进行细菌的分离鉴定。9.5杀菌试验中试验组有菌生长时，可随机挑选阳性管进行鉴定，以排除污染。S/T 79820227AA附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1A.1营养肉汤培养基营养肉汤培养基蛋白胨10.0 g

20、牛肉膏5.0 g氯化钠5.0 g蒸馏水加至1000 mL以上各成分蒸馏水溶解，调 pH 至 7.27.4，于 121 压力蒸汽灭菌 20 min 备用。A.2A.2合成肉汤培养基合成肉汤培养基L-胱氨酸0.05gDL-蛋氨酸0.37gL-精氨酸0.40 gDL-组氨酸0.30 gL-赖氨酸0.85 gL-酪氨酸0.21 gDL-苏氨酸0.50 gDL-缬氨酸1.00 gL-亮氨酸0.80 gDL-异亮氨酸0.44 g氨基乙酸0.06 gDL-丝氨酸0.61 gDL-丙氨酸0.43 gL-谷氨酸1.30 gL-天冬氨酸0.45 gDL-苯丙氨酸0.26 gDL-色氨酸0.05 gS/T 7982

21、0228L-脯氨酸0.05 g氯化钠3.00 g氯化钾0.20 g硫酸镁0.05 g磷酸二氢钾1.50 g磷酸氢二钠4.00 g盐酸硫胺素0.01 g烟酰胺0.01 g蒸馏水加至1000 mL以上各成分蒸馏水溶解，调 pH 至 6.97.3，于 121 压力蒸汽灭菌 20 min，冷却至室温后，加入0.1 mL 无菌 10%葡萄糖溶液备用。A.3液体硫乙醇培养基液体硫乙醇培养基酪蛋白胨15.0g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g硫乙醇酸钠0.5gL-胱氨酸0.5g氯化钠2.5g刃天青0.001g蒸馏水加至1000 mL除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清

22、，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调 pH 至 6.97.3，分装于 115 压力蒸汽灭菌 20 min 备用。A.4Letheen 肉汤培养基肉汤培养基酪蛋白胨10.0 g牛肉膏5.0 g吐温-805.0 g卵磷脂0.7 g氯化钠5.0 gS/T 79820229蒸馏水加至1000mL以上各成分蒸馏水溶解，调 pH 至 6.87.2，于 121 压力蒸汽灭菌 20 min 备用。A.5胰蛋白胨大豆琼脂培养基（胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）胰蛋白胨15.0 g大豆蛋白胨5.0 g氯化钠5.0 g琼脂16.0 g蒸馏水加至1000 mL以上各成分蒸馏水溶解，调 pH 至 7.27.4，于 121 压力蒸汽灭菌 20 min 备用。A.6A.6磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L）无水磷酸氢二钠2.83 g磷酸二氢钾1.36 g蒸馏水加至1000 mL以上各成分蒸馏水溶解，待完全溶解后，调pH至7.27.4，于121 压力蒸气灭菌20 min备用。A.7A.7标准硬水标准硬水(硬度 342 mg/L)氯化钙0.034 g六水氯化镁0.139 g蒸馏水加至1000 mL以上各成分蒸馏水溶解，待完全溶解后，于 121 压力蒸气灭菌 20 min 备用。_