Chapter3培养基.ppt

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1、n n培养基的成分n n培养基的配制n n培养基的筛选Chaptor 3 培养基培养基n n 培养基(culture medium)的配制是组培工作的核心。外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化，其主要原因就在于培养基中的物质成分对细胞的生长发育起着定向调控作用。n n 在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。n n 事事实实上上，培培养养基基的的研研制制始始终终伴伴随随着着组组培培技技术术的的发发展展，整个组培的发展史就是一部培养基的研制史：整个

2、组培的发展史就是一部培养基的研制史：1902 1902 HaberlandtHaberlandt knopknop培养液培养液SucSuc 失败失败 1934 White 1934 White 等人等人 无机有机（无机有机（V VB B）IAA IAA 脱分化脱分化 1957 1957 SkoogSkoog&Miller CYT/IAA&Miller CYT/IAA 激素调控激素调控 再分化再分化 1958 Steward 1958 Steward 首次实现植株再生首次实现植株再生 里程碑里程碑 1965 1965 VasilVasil 成分已知的合成培养基成分已知的合成培养基 单单CellC

3、ell n n 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如的名字来命名，如WhiteWhite培养基，培养基，MurashigeMurashige和和SkoogSkoog培养基培养基(简称简称MSMS培养基培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。基。1、基本培养基：提供组织生长的基础营养物质。基本培养基无机有机 常用的基本培养基有：MS、B5、White、N6、ER、KM-8P 等。教材：P37 表3-1；P164 附录 第一节第一节 培养基的成分培养基的成分n nMS培养基：特点是无

4、机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。n nB5培养基：特点是含有较低浓度的铵，从实践得知双子叶植物特别是木本植物在B5培养基上生长更适宜。n nWhite培养基：其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。n nN6培养基：是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。广泛应用于小麦、水稻等禾谷类作物的花药培养。n nKM8P培养基：它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养

5、基。n n2、培养基的成分：培养基=无机有机激素固化剂其它无机物：大量元素（0.5mmol/L）:N、S、P、K Ca、Mg；微量元素（0.5mmol/L）:Fe、Cu、Zn、B Mn、Mo；有机物：C源、VB、AA、有机酸、肌醇、天然复合物；激素：生长素 IAA （吲哚乙酸）细胞分裂素 CYT 赤霉素 GA 脱落酸 ABA 乙烯 Eth 油菜素内酯 BR固化剂：琼脂（Agar）、琼脂糖、Gelrite等其它：抗生素、AgNO3 3、活性炭（AC）等n n思考：植物体内应该有它生长所需要的全部营养成分。能否利用现代分析化学技术对植物成分作出精确分析，从而有针对性的去设计培养基？无机物：n nN

6、：常以NO3N和NH4N两种形式供 应 （生理碱性）（生理碱性）（生理酸性）（生理酸性）单独使用易导致培养基酸碱性漂移。思考：参考植物生理学知识解释上述现象？n nFe：易形成絮状沉淀，常以Fe EDTA 的形式提供。FeSO4 4 7H2 2ONa2 2 EDTAn n各种配方中无机盐水平有差异，可满足不同需要。n n无机盐供应不足，出现对应缺素症状。有机物：n nC源：多用蔗糖（Suc），用量25；n nVB B：多以辅酶形式参与代谢活动，能促进生长、分化。如：VB B1 1(盐酸硫胺素)、VB B6 6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、生物素、叶酸、VB B1212等。用

7、量为0110mgL；n nAA：很好的有机氮源，可以被细胞直接利用。如：Gly、Ala、Glu、Asn等；n n天然复合物：大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。由于成分复杂，实验可重复性差，应尽量不用或少用。但有时大胆启用此类物质可能起到意想不到的效果。常用的有：CH（水解酪蛋白）、CM（椰子汁）、ME（麦芽浸提物）、YE（酵母浸提物）、TJ（番茄汁）、香蕉、马铃薯n n 1)1)椰椰乳乳（CMCM）是是椰椰子子的的液液体体胚胚乳乳。它它是是使使用用最最多多、效效果果最最大大的的一一种种天天然然复复合合物物。一一般般使使用用浓浓度度在在10%20

8、%10%20%，与与其其果果实实成成熟熟度度及及产产地地关关系系也也很很大大。它它在在愈愈伤伤组组织织和和细细胞胞培培养养中中有有促促进进作作用用。在在马马铃铃薯薯茎茎尖尖分分生生组组织织和和草草莓莓微微茎茎尖尖培培养养中中起起明明显显的的促促进进作作用用，但但茎茎尖组织的大小若超过尖组织的大小若超过1nun1nun时，椰乳就不发生作用。时，椰乳就不发生作用。n n2)2)香香蕉蕉（bananabanana）用用量量为为150-200ml150-200mlL L。用用黄黄熟熟的的小小香香蕉蕉，加加入入培培养养基基后后变变为为紫紫色色。对对pHpH值值的的缓缓冲冲作作用用大大。主主要要在在兰兰花

9、花的的组组织织培培养中应用，对发育有促进作用。养中应用，对发育有促进作用。n n3)3)马马铃铃薯薯(potato)(potato)去去掉掉皮皮和和芽芽后后，加加水水煮煮30min30min，再再经经过过过过滤滤，取取其其滤滤液液使使用用。用用量量为为150200g150200gL L。对对pHpH值值缓缓冲冲作作用用也也大大。添添加后可得到健壮的植株。加后可得到健壮的植株。n n4)4)水水解解酪酪蛋蛋白白（CHCH）为为蛋蛋白白质质的的水水解解物物，主主要要成成分分为为氨氨基基酸酸，使使用用浓浓度度为为100200mg100200mgL L。受受酸酸和和酶酶的的作作用用易易分分解解，使使用

10、用时时要要注意。注意。n n5)5)其他其他 酵母提取液酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液素类；麦芽提取液(0.01%(0.01%0.5%)0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。有时有效。n n实验设想：目前已经组培成功的植物只有4000余种，对一些难于培养的植物种类，可否将其组织捣碎，分离汁液作为培养基的添加剂，以其有所突破？（3）、植物激

11、素：植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。n nIAA由顶端分泌，诱导细胞分裂，促进生 根；、常用种类：IAA、IBA、NAA、2,4-D、NOA、2,4,5-T等；使用效价：IAAIBANAA2,4D NAA、IBA 生根培养 2,4-D、2,4,5-T 愈伤组织诱导与增殖用量：mg/L 级，mg/L=ppm用法：溶于95乙醇或0.1mol/L NaOHn nCYT由

12、根尖分泌，促进细胞分裂、促生芽常用种类：KT、BAP、6-BA、ZT、2ip、TDZ等；用量：mg/L级用法：溶于0.5mol/L 稀HCl或稀NaOH，通常多用NaOH助溶。CYTIAA的结合是实现器官发生很好的配合方式。eg：快繁技术激素配比模式激素配比模式n n生生长长素素与与细细胞胞分分裂裂素素的的比比例例决决定定着着发发育育的的方方向向，即即长长愈愈伤伤组组织织、长长根根还还是是长长芽芽。如如为为了了促促进进芽芽器器官官的的分分化化，应应除除去去或或降降低低生生长长素素的的浓浓度度，或或者者调调整整培培养养基基中中生生长长素素与与细细胞胞分分裂素的比例。裂素的比例。高高 有利于根的形

13、成和愈伤组织有利于根的形成和愈伤组织 的形成的形成生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素 适中适中 有利于根芽的分化有利于根芽的分化 低低 有利于芽的形成有利于芽的形成n n生长调节物质的使用甚微，一般为生长调节物质的使用甚微，一般为mgmgL L级。在组织培养级。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-0.05-5mg5mgL L，细胞分裂素细胞分裂素0.0510mg0.0510mgL L。n nGA多用GA3 3，促进幼胚发

14、育、促细胞伸长、打破休眠。易溶于水、乙醇，多用95乙醇溶解储存；n nABA 因物种不同，能促进或抑制愈伤组织生长；n nEth 有催熟作用，大量积累易影响生长、分化，导致培养物早衰、落叶和玻璃化苗，应尽量排除之；n nBR 可能与CYT有类似作用，有待研究。（4）、固化剂：支撑作用，不提供营养；n nAgar：多糖类物质，40凝固，用量 （0.7-1.0）%；不凝原因：PH5不凝；长时间高压灭菌；长期存放，易变质；厂家不同，杂质含量不同；配制时融解不充分，分装不均匀；n n琼脂糖：适宜用于原生质体培养；n n新思路：以液体培养或漂浮培养方式替代固体培养，可有效降低成本，避免杂质干扰。如：玻璃

15、纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶（5）、其它成分：n nAC：吸附有害物质，便于根避光生长；但选择吸附性差，导致营养损耗和 PH，应适当调高营养物质与激素水平，并加大Agar用量。用量0.5-3%；n nAgNO3 3：吸附Eth，促进茎芽分化，防玻璃化苗、早衰、落叶；只能短期培养，用量 110mg/L，需过滤灭菌n n抗生素：抑制内生菌；常用青霉素、链霉素、利福平、卡那霉素等，多数需过滤灭菌，用量520mg/L;n n水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。

16、大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。返回返回第二节第二节 培养基的制备培养基的制备 n n母液(stock solution)的配制和保存:母液（贮备液）：根据实验需要将试剂分类按一定浓度比例配制成的浓缩液。目的：简化操作、保证精度、方便冷藏；方法：准确称量、分别溶解、混合均匀、低温保存（4）；母液的配制方法：母液的配制方法：n n单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。浓度用母液。浓度用a:ba:b表示，即每表示，即每b b毫升溶液中含有毫升溶液中含有a a毫克溶质。毫克溶质。n n

17、混配法混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液。取用时按倍数稀释即可。合母液。取用时按倍数稀释即可。n n生长素、细胞分裂素：配制时可先用少量生长素、细胞分裂素：配制时可先用少量OO1mol1molL L的的NaOHNaOH助溶，再加入温水，冷却后定容。助溶，再加入温水，冷却后定容。n n铁盐（铁盐（MSMS为例）：在装有为例）：在装有400ml 400ml 蒸馏水的烧杯中加入蒸馏水的烧杯中加入2 2粒粒苛性钠，溶解后加入苛性钠，溶解后

18、加入3.73g EDTA-Na23.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入然后边搅拌边慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，直至全部溶解，冷却后定容至冷却后定容至500ml500ml，置于冰箱中备用。，置于冰箱中备用。n n母液配制时可分别配成：大量元素 浓缩20倍 I微量元素 浓缩200倍 II铁盐 浓缩200倍 III有机物 浓缩200倍 IV激素 1mg/ml 或 1mg/10ml 贮备液用量拟配体积（或用量）/贮备水平 n n母液配制时应注意的一些问题：母液配制时应注意的一些问题：一些离子之间易

19、发生沉淀，如一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+Ca2+和和S042+S042+，Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+和和PO43-PO43-一起混合后，会产生沉淀，一起混合后，会产生沉淀，一定要充分溶解再按一定顺序放入母液中。一定要充分溶解再按一定顺序放入母液中。用蒸馏水或重蒸馏水配制；药品应选取等级较高用蒸馏水或重蒸馏水配制；药品应选取等级较高的化学纯或分析纯；药品的称量及定容都要准确；的化学纯或分析纯；药品的称量及定容都要准确；先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。母液配好后放人冰箱内低温保存（母液配好后放人冰箱内低温保存（4 4），用时再），用时再按比

20、例稀释。其中按比例稀释。其中IIIIII、IVIV、以及激素类物质应以、以及激素类物质应以棕色瓶盛装棕色瓶盛装。贮备液使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微贮备液使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用。生物污染应停止使用。n n培养基的制备：称量融解Agar加Suc溶解加入母液定容、调 PH分装、封口灭菌、标记储存例1：配制1L以下培养基 MSBA2 2NAA0.20.2Suc3.0Agar0.8 MS：I 50ml ，II 5ml，III 5ml，IV 5ml BA：20ml NAA：2ml Suc：30g Agar：8g例2：N6 6GA3 3 0.10.1 Suc5.0Ag

21、ar0.8 过滤灭菌 灭菌转入无菌区 无菌水定容乘热分装分装用试管等例例3 3：1/2MS1/2MSNAANAA0.1 0.1 Suc3.0Suc3.0Agar0.8Agar0.8 MSMS母液：母液：25 25，2.5 2.5，2.5 2.5，2.52.5 （注意：工作中常为（注意：工作中常为2525，5 5，5 5，5 5）例例3 3：HellerHeller无无WhiteWhite有有KTKT0.10.1BABA2 2IAAIAA0.50.5椰乳椰乳10%+Ac 0.5%10%+Ac 0.5%肌醇肌醇100mg100mg例例4 4：配制：配制MS0MS0 只有只有MSMS基础物质，无激素

22、基础物质，无激素 返回返回第三节第三节 培养基的选择培养基的选择n n培养基基本培养基 植物激素 （物质基础）（调控手段）生存 发展 n n培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合，实现离体细胞的生长、分化与植株再生。而最佳组合的结论作出，需研制培养基配方并试验其效果。n n在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基的物质种类、用量、比例关系作出适当调整后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。选择最佳培养基，常用试验方法主要有单因子试验、多因子试

23、验及广谱实验等。一、单因子试验n n在试验中，培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动一个因子，通过试验可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。n n例：以MS为基本培养基，分别对BA和NAA作单因子分析：MSBA2 2NAAm（0.1、0.5、1.0）MS+BAn+NAA0.1 0.1 （0.5、1.0、2.0）局限性：探索范围难于把握，不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响。二、多因子试验n对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验。试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案。完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个

24、水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合。n例如研究NAA和6BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验。P30表34 2种激素种激素5种种浓浓度的度的实验组实验组合合BABA（mg/Lmg/L）0 0.5 2.5 5 100 0.5 2.5 5 10NAA 0 1 2 3 4 5NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L)0.5 6 7 8 9 10(mg/L)0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19

25、 20 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 10 21 22 23 24 25 n n完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用用正交试验正交试验。例如，采用正交设计，在使用。例如，采用正交设计，在使用L L9 9表表时就可以安排时就可以安排4 4个因子，个因子，3 3种水平的试验，一共做种水平的试验，一共做9 9种不同搭配的试验，其结果相当于做了种不

26、同搭配的试验，其结果相当于做了2727次种搭次种搭配的试验。在组织培养研究中，可用于同时探求配的试验。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。生长素、糖和其他成分的用量。n n例如：例如：A A、B B、C C、DD四个变动因子，四个变动因子，各有各有1 1、2 2、3 3三三种不同水平，则种不同水平，则可如图设计实验：可如图设计实验：对结果进行方差对结果进行方差分析与显著性分分析与显著性分析即可了解析即可了解4 4种种不同因子的影响不同因子的影响力。力。因子因子 A B C DA B

27、C D序号序号 1 1 1 11 1 1 1 1 2 2 2 1 2 2 2 1 3 3 3 1 3 3 3 2 1 2 3 2 1 2 3 2 2 3 1 2 2 3 1 2 3 1 2 2 3 1 2 3 1 3 2 3 1 3 2 3 2 1 3 3 2 1 3 3 3 2 1 3 3 2 1三、逐步添加和逐步排除的试验方法：三、逐步添加和逐步排除的试验方法：n n在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减分，而在取得了稳

28、定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种也经常用到这种加加减减加加减减的简单方法。的简单方法。四、广谱实验法四、广谱实验法n n在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4 4大类：大类：无机盐、有机营养物质无机盐、有机营养物

29、质(蔗糖、氨基酸和肌醇等蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)(L)、中中(M)(M)、和高、和高(H)3(H)3个浓度。个浓度。4 4类物质各类物质各3 3种浓度的自种浓度的自由组合即构成了一项包括由组合即构成了一项包括8181个处理的实验。在这个处理的实验。在这8181个处理中最好的一个可用个处理中最好的一个可用4 4个字母表示。例如，个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即

30、可表示为理即可表示为MLMHMLMH。达到这个阶段，再试用不。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。裂素对不同植物的活性有所不同。n n科学安排研究顺序：一、基本培养基的选择：通常会以一种或几种已知的基本培养基为起点，通过实验确定出合适的营养物质水平。二、激素配比的选择：通过单因子分析、多因子实验、正交实验等方法确定出最佳激素配比模式。三、糖浓度的选取：大多数植物2或3，少数4；花药培养时糖浓度要求较高，715，其

31、主要作用在于调节基质渗透压。四、PH值的选取：植物组织对PH值要求不高，一般PH5.65.8，个别喜酸或喜碱，可结合植物的生长习性适当调整，也可通过单因子分析加以确定。n n五、综合因子的确定：在各个单项因子的条件找到以后，综合进行全面实验，并根据实验情况作出适当调整，即可确定出最佳培养基配方。1 13 3章作业章作业1 1、名词解释：、名词解释：细胞全能性；组培；外植体；脱分化；再分化；细胞全能性；组培；外植体；脱分化；再分化；愈伤组织；愈伤组织；2 2、请简述常规外植体消毒的一般步骤。、请简述常规外植体消毒的一般步骤。3 3、拟配制、拟配制1L N1L N6 6贮备液，请计算贮备液，请计算

32、KNOKNO3 3与与ZnSOZnSO4 47H7H2 2OO的用量的用量 （单位：（单位：mgmg）；）；4 4、请说明配制、请说明配制1L1L下列培养基的方法：下列培养基的方法：MSMS无无WhiteWhite有有KTKT0.10.1BABA2 2IAAIAA0.50.5GA3GA30.20.2椰乳椰乳10%+Ac 0.5%10%+Ac 0.5%KNOKNO3 3400mg400mgGly200mgGly200mg3、拟配制1L N6 6贮备液，请计算KNO3 3与ZnSO4 47H2 2O的用量（单位：mg）；要点：1、基本培养基的贮备液配制方法 大量 20倍 微量 200倍 2、N6配

33、方用量浓缩倍数1L贮备液 所需质量MS无无White有有KT0.10.1BA2 2IAA0.50.5GA30.20.2椰乳10%+Ac 0.5%KNO3 3400mgGly200mg要点：1、基本培养基：MS无机盐White有机物 2、激素使用水平：mg/L 贮备浓度：1mg/10ml 3、椰乳10%V/V 液/液 Ac0.5%W/V 固/液 4、IAA、GA3、椰乳 需过滤灭菌MSMS无无无无WhiteWhite有有有有KTKT0.10.1BABA2 2IAAIAA0.50.5GA3GA30.20.2椰椰椰椰乳乳乳乳10%+Ac 0.5%10%+Ac 0.5%KNO3400mgKNO3400

34、mgGly200mgGly200mg要点：要点：1 1、基本培养基：、基本培养基：MSMS无机盐无机盐WhiteWhite有机物有机物 2 2、激素使用水平：、激素使用水平：mg/Lmg/L 贮备浓度：贮备浓度：1mg/10ml1mg/10ml3 3、椰乳、椰乳10%V/V 10%V/V 液液/液液 1010相当于相当于10ml/100ml10ml/100ml AC0.5%W/V AC0.5%W/V 固固/液液 0.5%0.5%相当于相当于0.5g/100ml0.5g/100ml4 4、IAAIAA、GA3GA3、椰乳、椰乳 需需过滤过滤灭菌灭菌以配制以配制1 1升为例：升为例：1 1、MS

35、I MS I 50 ml50 ml 、MS MS II5 mlII5 ml MS IIIMS III5ml 5ml、White IV White IV 5ml5ml2 2、激素：、激素：贮备液贮备液 KT 0.1mg 1ml KT 0.1mg 1ml BA 2mg 20mlBA 2mg 20ml IAA 0.5mg 5ml IAA 0.5mg 5ml GA GA3 3 0.2mg 2ml0.2mg 2ml3 3、椰乳：、椰乳：100ml100ml AC AC ：5g5gGrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)S

36、ucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwi

37、throotsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiate

38、dcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantNAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

39、MSsaltsreducedto0.47g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.Callus culture-creation of genetic variants via somaclonal variation and/or in vitro selection-elimination of pathogens esp.viruses-gene transfer(eg v

40、ia Agrobacterium,microprojectiles2.Meristem culture-clonal propagation-elimination of pathogens-germplasm collection and long-term storage(eg cryopreservation)Virus eliminationvirus elimination most useful for vegetatively reproduced species-banana,sugarcane,potato,strawberry,sweet potatochemotherap

41、y and/or thermotherapy may also be usedNB:disease-free planting material may be rapidly rapidly re-infected by insect vectors,contaminated soil or implementsthe only long-term solution is genetic resistance3.Embryo culture-shortening breeding cycles-creating wide hybrids(interspecific/intergeneric)-

42、haploid production via chromosome elimination4.Anther/pollen/ovule culture-production of haploids for genetic analysis and shortening breeding programmes-creation of genetic variants via gametoclonal variation5.Protoplast culture-gene transfer-creating wide hybrids via somatic hybridizationPlant protoplasts