最新单克隆抗体.ppt

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1、最新课件单克隆抗体最新课件单克隆抗体现在学习的是第1页，共65页McAbandPcAb现在学习的是第2页，共65页杂交瘤技交瘤技术的的诞生生1975年年8月月7日日，Kohler和和Milstein在英国自然在英国自然杂志志上上发表了表了题为“分泌具有分泌具有预定特异性抗体的融合定特异性抗体的融合细胞的持胞的持续培养培养”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）1984年度荣年度荣获诺贝尔生理学和医学生理学和医学奖现在学习的是第3页，共65页一、一、杂交瘤技交瘤技术的基本原理的基本原理 聚乙

2、二醇（聚乙二醇（PEG）：）：细胞融合胞融合剂，使免疫的小鼠脾，使免疫的小鼠脾细胞与胞与小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤细胞融合胞融合 HAT培养基的培养基的选择培养：培养：反复的免疫学反复的免疫学检测筛选克隆化增克隆化增殖的殖的杂交瘤交瘤细胞系胞系 单克隆抗体生成：克隆抗体生成：接种接种杂交瘤交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的可得到高效价的单克隆抗体克隆抗体现在学习的是第4页，共65页抗体种抗体种类：第一代抗体第一代抗体 多克隆抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体第二代抗体单克隆抗体克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体第三代

3、抗体基因工程抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)现在学习的是第5页，共65页B淋巴淋巴细胞胞:寿命短寿命短,分泌特异分泌特异系性抗体系性抗体骨髓瘤骨髓瘤细胞：胞：寿命寿命长杂交瘤交瘤细胞：胞：寿命寿命长，单 隆抗体隆抗体现在学习的是第6页，共65页流流程程现在学习的是第7页，共65页 不不产生生Ig的重的重链和和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴与提供淋巴细胞的胞的动物品系相同物品系相同（一）小鼠骨髓瘤（一）小鼠骨髓瘤细胞胞小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤细胞系均来源胞系均来源于于BALB/c小鼠小鼠，大鼠骨髓瘤，大鼠骨髓瘤细胞都来胞都来源于源于LOU/c大鼠大鼠建立的

4、骨髓瘤建立的骨髓瘤细胞系胞系:SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653NSO/1现在学习的是第8页，共65页动物：物：BALB/c小鼠小鼠48周周龄20g25g体重体重（二）免疫脾（二）免疫脾细胞胞现在学习的是第9页，共65页细胞性抗原：胞性抗原：（12）107/只，不加佐只，不加佐剂，23周重复一次周重复一次可溶性抗原：可溶性抗原：首次，完全福氏佐首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，微克抗原，36周周100200微克微克抗原，融合前抗原，融合前3天，加天，加强免疫免疫体内免疫法体内免疫法-免疫原性免疫原性强、来源充分的抗原，、来源充分的抗原，对于免疫于免疫原性很弱或原性很弱或对机体有害（

5、如引起免疫抑制）的抗原就不机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了适用了免疫小鼠免疫小鼠现在学习的是第10页，共65页。淋巴淋巴细胞胞现在学习的是第11页，共65页。浆细胞胞现在学习的是第12页，共65页。抗原接种抗原接种现在学习的是第13页，共65页免疫原特性抗原量接种次数间隔时间单抗的特性抗体滴度亲和性免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等）106-107个细胞或1-10ug2-42-4周高中等至强免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或高中等或强免疫原性弱A.20-400ug2-4随后2-3每月2-3月中等强B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-1

6、00ug2其后4其后“休息”最后加强每月10天1-2月中等中等或强表表6-1不同免疫抗原的免疫程序不同免疫抗原的免疫程序（引自刘秀梵，（引自刘秀梵，1994）现在学习的是第14页，共65页培养液：培养液：RPM1640培养液培养液DMEM培养液培养液（三）（三）细胞融合胞融合现在学习的是第15页，共65页细胞融合胞融合剂：PEG:分子量分子量4000的的PEG是最常用的是最常用的细胞融合胞融合剂作用机理：作用机理：诱导细胞膜上脂胞膜上脂类物物质结构重排，使构重排，使细胞膜易打开而胞膜易打开而有助于有助于细胞融合胞融合作用特点：作用特点：随机随机发生的，不同厂商、批号、分子量的生的，不同厂商、批

7、号、分子量的PEG，其其纯度与毒性有所不同度与毒性有所不同最早仙台病毒被用做融合最早仙台病毒被用做融合剂，后来，后来发现聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病）的融合效果更好，且避免了病毒的毒的污染染问题现在学习的是第16页，共65页培养骨髓瘤培养骨髓瘤细胞：胞：选择对数生数生长期的期的细胞胞进行行传代培养代培养细胞形胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整、透亮、均一、排列整齐避免避免细胞返祖：定期用胞返祖：定期用8-AG处理理细胞胞注意事注意事项：切忌：切忌过多多传代培养，可将代培养，可将细胞分装胞分装冻存于存于-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中现在学习的是第17页，共65页取已取

8、已经免疫的免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗抗体体检测时的阳性的阳性对照血清。照血清。同同时通通过颈脱位致死小鼠，浸泡于脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中酒精中5分分钟通常每只小鼠通常每只小鼠1108-2.5108个脾个脾细胞，每只大鼠脾胞，每只大鼠脾脏可得可得5108-10108脾脾细胞。胞。免疫脾免疫脾细胞的制胞的制备：1108的的淋巴淋巴细胞胞无菌手无菌手术现在学习的是第18页，共65页常用的常用的饲养养细胞有胸腺胞有胸腺细胞、正常脾胞、正常脾细胞和腹腔巨噬胞和腹腔巨噬细胞胞其中其中MQ还有清除死亡有清除死亡细胞的作用胞的作用饲养存活一般

9、不超养存活一般不超过2周，不影响周，不影响杂交瘤交瘤细胞的胞的纯化化在在细胞融合后胞融合后选择性培养性培养过程中，由于大量骨髓瘤程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾胞和脾细胞相胞相继死亡，此死亡，此时单个或少数分散的个或少数分散的杂交瘤交瘤细胞多半不易存活，通胞多半不易存活，通常必常必须加入其他活加入其他活细胞使之繁殖，胞使之繁殖，这种被加入的活种被加入的活细胞称胞称为饲养养细胞（胞（Feedercells）。）。饲养养细胞：胞：现在学习的是第19页，共65页。饲养养细胞胞现在学习的是第20页，共65页融合方法融合方法a、将、将1108脾脾细胞与胞与2107-5107骨髓瘤骨髓瘤细胞胞SP2/0-Ag

10、14混合于一支混合于一支50ml融合管中，融合管中，补加不完全培加不完全培养基至养基至30ml，充分混匀。，充分混匀。b、1000r/min离心离心5-10分分钟，将上清尽量吸，将上清尽量吸净。c、在手掌上、在手掌上轻击融合管底，使沉淀融合管底，使沉淀细胞松散均匀胞松散均匀;置置40水浴中水浴中预热。d、用、用1ml吸管在吸管在1分分钟左右（最佳左右（最佳时间为45秒）加秒）加预热至至40的的50%PEG（PH8.0）1ml，边加加边轻轻搅拌。拌。e、用、用10ml吸管在吸管在90秒内加秒内加20-30ml预热至至37的不完全培养基；的不完全培养基；20-37静置静置10分分钟。f、1000r

11、/min5分分钟；弃去上清。；弃去上清。g、加入、加入5mlHAT培养基，培养基，轻轻吹吸沉淀吹吸沉淀细胞，使其胞，使其悬浮并混匀，然后浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬加含腹腔巨噬细胞的胞的HAT培养基至培养基至80-100ml。h、分装、分装96孔孔细胞培养板，每孔胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装；分装24孔板，每孔孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置；然后将培养板置37，6%CO2培养箱内培养。培养箱内培养。i、5天后用天后用HAT培养基培养基换出出1/2培养基。培养基。j、7-10天后用天后用HT培养基培养基换出出HAT培养基；（第培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。

12、天后可用普通完全培养基）。l、经常常观察察杂交瘤交瘤细胞生胞生长情况，待其情况，待其长至孔底面至孔底面积1/10以上以上时吸出上清供抗体吸出上清供抗体检测。现在学习的是第21页，共65页1020天出天出现克隆克隆HAT筛选杂交瘤交瘤细胞在融合后胞在融合后2周左右即可周左右即可筛选，即把，即把分泌所需抗体的分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称出来，通常也称为抗体抗体检测。融合融合细胞的早期培养胞的早期培养现在学习的是第22页，共65页常用的抗体常用的抗体检测方法：方法：（1）免疫）免疫酶技技术免疫免疫酶技技术是将抗原抗体反是将抗原抗体反应的特异性和的特异性和酶对底

13、物底物显色反色反应的高效催化作用有的高效催化作用有机机结合而成的免疫学技合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，。由于它特异性高，灵敏度高，现已广泛用于已广泛用于筛选和和鉴定定单抗。抗。用可溶性抗原的用可溶性抗原的酶联免疫吸附免疫吸附试验（ELISA）用全菌抗原的用全菌抗原的ELISA用全用全细胞抗原的胞抗原的ELISA抗体捕捉抗体捕捉ELISA试验ABC-ELISA试验Dot-ELISA试验免疫免疫组化染色法化染色法（2）免疫）免疫荧光技光技术间接免疫接免疫荧光法光法活活细胞的膜胞的膜荧光染色光染色（3）间接血凝接血凝试验（4）放射免疫）放射免疫测定定现在学习的是第23页，共65页HG

14、PRT酶与与TK酶：次黄次黄嘌呤磷酸核糖呤磷酸核糖转化化酶胸腺胸腺嘧啶核苷激核苷激酶（四）（四）杂交瘤交瘤细胞的胞的选择性培养性培养应用液：用液：8-氮氮杂鸟嘌呤呤聚乙二醇聚乙二醇现在学习的是第24页，共65页HAT培养基：培养基：H（Hypoxanthine）:次黄次黄嘌呤呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径合成主要途径T(Thymidine)：胸胸腺腺嘧啶核苷；核苷；“核苷酸前体核苷酸前体”，供，供细胞通胞通过替代途径合成替代途径合成DNA现在学习的是第25页，共65页HAT选择作用：作用：淋巴淋巴细胞：胞：不能生不能生

15、长，57天死亡；天死亡；DNA合成的合成的主要途径被主要途径被A阻断阻断骨髓瘤骨髓瘤细胞：胞：不能生不能生长，57天死亡；天死亡；HGPRT缺缺乏，乏，DNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻现在学习的是第26页，共65页SP2/O:HGPRT-，TK-;长命命脾脾细胞胞:HGPRT+，TK+;短命短命(7天天)杂交交瘤瘤细胞胞:HGPRT+，TK+;长命命骨髓瘤骨髓瘤细胞、脾胞、脾细胞与胞与杂交交瘤瘤细胞胞现在学习的是第27页，共65页杂交瘤交瘤细胞：胞：长期生期生长繁殖繁殖利用淋巴利用淋巴细胞的胞的HGPRT，将，将H合成合成为嘌呤碱并呤碱并最最终与与T一起合成一起合成DNA从淋巴从淋巴

16、细胞胞获得得产生某种抗体的生某种抗体的遗传信息信息从骨髓瘤从骨髓瘤细胞胞获得不断繁殖的能力得不断繁殖的能力现在学习的是第28页，共65页有限稀有限稀释法法(limitingdilution)FACS法法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法脂平板法(softagarmethod)二、阳性二、阳性杂交瘤交瘤细胞的克隆化培养与胞的克隆化培养与冻存存现在学习的是第29页，共65页特点：特点：不需任何特殊不需任何特殊设备克隆出克隆出现效率高效率高实验室常用方法室常用方法方法：方法：细胞胞悬液通液通过系列稀系列稀释每个培养孔含每个培养孔含0.51个个细胞胞有限稀有

17、限稀释法法每种每种杂交瘤交瘤细胞分装胞分装96孔板一孔板一块，每个稀，每个稀释度度32孔，每孔量孔，每孔量为0.2ml，每孔的，每孔的杂交瘤交瘤细胞数分胞数分别为0.5、3和和10。现在学习的是第30页，共65页效率最高效率最高价格昂价格昂贵FACS现在学习的是第31页，共65页软琼脂平板法脂平板法(softagarmethod)37、7.5%湿湿润培养培养7-14天；克隆生天；克隆生长至至2mm时，用毛，用毛细吸管吸管吸出克隆，直接吸出克隆，直接转种于含有种于含有饲养养细胞的胞的24孔板，孔板，扩大培养。大培养。吸取上清，吸取上清，检测抗体，阳性孔可抗体，阳性孔可继续克隆化，或克隆化，或扩大

18、培养、大培养、冻存。存。现在学习的是第32页，共65页配制方案：配制方案：杂交瘤交瘤细胞（胞（15）x106/ml)+细胞胞冻存液存液(30%40%牛血清，牛血清，50%60%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)“慢慢冻”：分步冷分步冷冻，30-70液氮液氮保存数年至数十年保存数年至数十年“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤交瘤细胞的胞的冻存与复存与复苏在建立在建立杂交瘤交瘤细胞的胞的过程中，有程中，有时一次融合一次融合产生很多生很多“阳性阳性”孔，来不孔，来不及及对所有的所有的杂交瘤交瘤细胞作胞作进一步的工作，需

19、要把其中一部分一步的工作，需要把其中一部分细胞胞冻存起存起来；另一方面，来；另一方面，为了防止了防止实验室可能室可能发生的意外事故生的意外事故现在学习的是第33页，共65页防止防止污染染避免染色体避免染色体丢失失防止非分泌防止非分泌细胞的胞的过度生度生长防止防止细胞密度胞密度过高而死亡高而死亡细胞冷胞冷冻的意的意义现在学习的是第34页，共65页（1）单克隆性的确定克隆性的确定包括包括杂杂交瘤交瘤细细胞的染色体分析、胞的染色体分析、单单抗免疫球蛋白重抗免疫球蛋白重链链和和轻链类轻链类型的型的鉴鉴定和定和单单抗抗纯纯度度鉴鉴定等。定等。A A、杂杂交瘤交瘤细细胞的染色体分析胞的染色体分析 对杂对杂

20、交瘤交瘤细细胞胞进进行染色体分析可行染色体分析可获获得其是否是真正的得其是否是真正的杂杂交瘤交瘤细细胞的客胞的客观观指指标标之一，之一，杂杂交瘤交瘤细细胞的染色体数目胞的染色体数目应应接近两种接近两种亲亲本本细细胞染色体数目的胞染色体数目的总总和，正常小鼠脾和，正常小鼠脾细细胞的染色体数目胞的染色体数目为为40，小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤细细胞胞SP2/0为为62-68，NS-1为为54-56；B 、单抗免疫球蛋白的抗免疫球蛋白的类别和和亚类鉴定定免疫免疫扩散散ELISAC、单抗抗纯度的度的鉴定定聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳（泳（PAGE）、）、SDS-PAGE、等、等电点聚焦点聚焦电泳（泳（IEF

21、）及免疫）及免疫转印分析（印分析（WB）等方法都可用于）等方法都可用于鉴定定单抗的抗的纯度。度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB（三三）单单克隆抗体的性克隆抗体的性质鉴质鉴定定现在学习的是第35页，共65页（2）单抗理化特性的抗理化特性的鉴定定抗体抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之合簇（部）和抗原决定簇之间的立的立体构型的合适程度决定的。体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在合力通常以平均内在结合常数（合常数（K）表示。）

22、表示。常用的方法有常用的方法有竞争争ELISA、非、非竞争性争性ELISA、间接接ELISA、间接法接法夹心心ELISA等等（3）单抗与相抗与相应抗原的反抗原的反应性性测定定包括各包括各类免疫血清学免疫血清学试验、生物学、生物学试验和免疫化学技和免疫化学技术等等现在学习的是第36页，共65页 三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化反复克隆化获得的得的抗体阳性抗体阳性杂交瘤交瘤细胞株胞株应立即立即扩大培养大培养（除及（除及时冻存的存的细胞外）。因多次胞外）。因多次传代易引起染色体逐代易引起染色体逐渐丢失而使失而使细胞胞产生抗体能力逐生抗体能力逐渐减弱甚至消失，减弱甚至消失，还应尽早使用尽早使用获得

23、的抗体阳性得的抗体阳性杂交瘤交瘤细胞株制胞株制备单克隆抗体。克隆抗体。现在学习的是第37页，共65页（一）（一）单克隆抗体的克隆抗体的产生生1 动物体内物体内诱生方法：生方法：每次用每次用BALB/c或或F1代小鼠，（代小鼠，（510）105/只只,使用使用的的动物当然首物当然首选BALB/c小鼠小鼠,将将杂交瘤交瘤细胞接种于小鼠胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并交瘤，并产生腹水，因而生腹水，因而可得到大量的腹水可得到大量的腹水单抗且抗体抗且抗体浓度很高。可度很高。可见该法操作法操作简便、便、经济，不，不过，腹水中常混有小鼠的各种，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白

24、蛋白（包括（包括Ig）现在学习的是第38页，共65页腹腔注射法腹腔注射法现在学习的是第39页，共65页2 体外培养法：体外培养法：a、悬浮培养法：浮培养法：小小规模模悬浮培养多采用浮培养多采用转瓶培养，通瓶培养，通过搅拌使拌使细胞呈胞呈悬浮状浮状态；而大；而大规模模悬浮培养多采用浮培养多采用发酵式的生物反酵式的生物反应器器b、微、微载体培养法体培养法Microcarrier：主要以交主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作玻璃等作为基基质的的产品品c、中空、中空纤维细胞培养系胞培养系统：由中空由中空纤维生物反生物反应器、培养基容器、供器、培养基容器、供氧器和蠕氧器和蠕动

25、泵等等组成成d、微囊化、微囊化细胞培养系胞培养系统：先将先将杂交瘤交瘤细胞微囊化，然后将此具有半胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中透膜的微囊置于培养液中进行行悬浮培养，一定浮培养，一定时间后，从培养液后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高得高浓度的度的单抗。抗。现在学习的是第40页，共65页（3）杂交瘤交瘤细胞的无血清培养胞的无血清培养已已报道的各道的各类无血清培养基有含有大豆无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基学限定性的、无蛋白的、含

26、有血清低分子量成分的无血清培养基利于利于单抗的抗的纯化，有助于大化，有助于大规模生模生产，可减少，可减少细胞胞污染的机染的机会，且成本会，且成本较低。低。但无血清培养但无血清培养细胞的生胞的生产率低、率低、细胞密度小，影响了胞密度小，影响了单抗的抗的产量；量；现在学习的是第41页，共65页可溶性抗原：可溶性抗原：ELISA抗体捕抗体捕获法法细胞、胞、亚细胞胞结构上的抗原：构上的抗原：免疫免疫荧光法（用丙光法（用丙酮和甲醇按和甲醇按1:1比例固定比例固定细胞）胞）（二）（二）单克隆抗体的克隆抗体的纯化化现在学习的是第42页，共65页前前5天天进行行,预先腹腔注射先腹腔注射pristane（15）

27、106细胞胞13w形成腹水形成腹水腹水型腹水型单抗的抗的纯化化高滴度腹水高滴度腹水现在学习的是第43页，共65页盐析沉淀析沉淀亲和和层析析离子交离子交换层析析 McAb的的纯化化 现在学习的是第44页，共65页ELISA多多头加加样枪现在学习的是第45页，共65页ELISA现在学习的是第46页，共65页。免疫免疫荧光法光法现在学习的是第47页，共65页（四）（四）单克隆抗体的特性克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反弱凝集反应和不呈和不呈现沉淀反沉淀反应对环境敏感性境敏感性现在学习的是第48页，共65页优点点：在体外在体外“永久永久”地存活并地

28、存活并传代代用相用相对不不纯的抗原，的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以以标记抗体抗体为特点的免疫学分析方法特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫可用于体内的放射免疫显像和免疫像和免疫导向治向治疗（五）（五）单克隆抗体的克隆抗体的优点与局限性点与局限性局限性局限性：固有的固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的和性和局限的生物活性限制了它的应用范用范围反反应强度不度不如多克隆抗体如多克隆抗体制制备技技术复复杂、费时费工、价格工、价格较高高现在学习的是第49页，共65页 McAb PcAb 抗原要求抗原要求可以不可以不纯纯度高度高得量得量高高低低特

29、异性特异性高高低低稳定定低低高高 沉淀反沉淀反应无无有有成本成本高高低低McAb与与PcAb的比的比较现在学习的是第50页，共65页三、基因工程抗体制三、基因工程抗体制备基因工程抗体基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)根据研究者的意根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基，采用基因工程方法，在基因水平，因水平，对免疫球蛋白基因免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修行切割、拼接或修饰后后导入受体入受体细胞胞进行表达，行表达，产生新型抗体。主要包生新型抗体。主要包括嵌合抗体、括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。双特异性抗体

30、。现在学习的是第51页，共65页 将小鼠将小鼠Ig基因敲除，基因敲除，转染人染人Ig基因，在小鼠体内基因，在小鼠体内产生人生人Ab，再，再经杂交瘤技交瘤技术，产生大量完全人源生大量完全人源化抗体化抗体（一）人源化抗体（一）人源化抗体现在学习的是第52页，共65页方法：方法：从从杂交瘤交瘤细胞分离出功能性可胞分离出功能性可变区基因，与人区基因，与人Ig恒定区基恒定区基因因连接，插入适当表达接，插入适当表达载体，体，转染宿主染宿主细胞，表达人胞，表达人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性保留了保留了亲本抗体特异性本抗体特异性结合抗原的能力合抗原的能

31、力1、嵌合抗体、嵌合抗体现在学习的是第53页，共65页嵌合抗体嵌合抗体现在学习的是第54页，共65页定定义：指利用基因工程技指利用基因工程技术，将人抗体可，将人抗体可变区（区（V）中互）中互补决决定簇（定簇（CDR）序列改）序列改换成鼠源成鼠源单抗抗CDR序列。重构成既具有鼠源序列。重构成既具有鼠源性性单抗的特异性又保持抗体抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。和力的人源化抗体。RAb亦叫亦叫“重重构型抗体构型抗体”，因其主要涉及，因其主要涉及CDR的的“移植移植”，又可称，又可称为“CDR移移植抗体植抗体意意义：多种特异的鼠源多种特异的鼠源单抗有可能抗有可能应用于用于临床治床治疗2、改型抗

32、体、改型抗体现在学习的是第55页，共65页Fab：抗原抗原结合片断合片断Fv：可可变区片段区片段ScFv：单链可可变区片段区片段SdAb：单区抗体区抗体 （二）小分子抗体（二）小分子抗体现在学习的是第56页，共65页小分子抗体小分子抗体现在学习的是第57页，共65页其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白融合（三）抗体融合蛋白（三）抗体融合蛋白现在学习的是第58页，共65页许多抗原抗体反多抗原抗体反应要求双价的抗原要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两合位点，使抗原分子上的两个表位交个表位交联或使两个抗原分子或使两个抗原分子连接。将接。将识别肿瘤抗原的抗体和瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效胞毒性

33、免疫效应细胞表面分子的抗体胞表面分子的抗体连结在一起，可使效在一起，可使效应细胞更容胞更容易与易与肿瘤瘤细胞胞结合合识别，取得，取得杀伤肿瘤瘤细胞的作用。胞的作用。（四）双特异性抗体（四）双特异性抗体现在学习的是第59页，共65页 分分别分离分离纯化两种不同的化两种不同的McAb，使各抗体解离，使各抗体解离为单价抗体，价抗体，再使两种不同抗原特异性的再使两种不同抗原特异性的单价抗体通价抗体通过化学化学试剂交交联起来，然后分起来，然后分离出目的离出目的组分。此法缺点是容易分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，致抗体失去活性，产物均一性不佳。物均一性不佳。化学交化学交联BsAb现在学习的是第60页，

34、共65页 将两种分泌不同特异性将两种分泌不同特异性单抗的抗的杂交瘤交瘤细胞胞进行再次融合，行再次融合，产生四源生四源杂交瘤交瘤(quadroma)。但二次但二次杂交瘤交瘤细胞株分泌的是两胞株分泌的是两套重套重链，轻链的随机的随机组合物。合物。BsAb在其中的比例可在其中的比例可为10%50%不等。多倍不等。多倍杂交瘤交瘤细胞的胞的稳定性差，定性差，BsAb的的产量少且活性低，量少且活性低，费时费力，力，临床床应用用时存在人抗鼠抗体免疫反存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于因此不适用于临床。床。细胞工程胞工程BsAb现在学习的是第61页，共65页 多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段

35、,如如Fab，Fv或或ScFv,经基因操作修基因操作修饰后后,或体外或体外组装装为BsAb,或直接表达分泌型的或直接表达分泌型的BsAb。基因工程基因工程BsAb现在学习的是第62页，共65页定定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，体，转染工染工程程细菌菌进行表达，然后用抗原行表达，然后用抗原筛选即可即可获得特异的得特异的单克隆克隆噬菌体抗体。利用噬菌体抗体。利用这一技一技术可以得到完全人源性的抗体，可以得到完全人源性的抗体，在在HIV等病毒感染和等病毒感染和肿瘤的瘤的诊断与治断与治疗方面有其独特的方面有其独特的优越性越性（五）噬菌体抗体（五）噬菌体抗

36、体库技技术现在学习的是第63页，共65页用用PCR扩增人抗体重增人抗体重链可可变区区(VH)和和轻链可可变区区(VL)基因基因克隆到噬菌体克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并出表达所需要抗体的克隆并扩增。增。使抗体基因以分泌的方式表达，使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。得可溶性的抗体片段。抗体抗体库：组合抗体文合抗体文库：在建：在建库过程中如果将程中如果将VH和和VL随机随机组合合人天然抗体人天然抗体库：抗体：抗体mRNA来源于未来源于未经免疫的正常人免疫的正常人（一）基本原理和程序（一）基本原理和程序现在学习的是第64页，共65页噬菌体抗体噬菌体抗体库现在学习的是第65页，共65页