病原细菌与真菌实训报告总结与体会311.pdf

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1、病原细菌与真菌实训报告总结与体会 病原细菌与真菌实训报告总结与体会篇一 病原菌的分离培养方法 一、基本原理 植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀

2、释分离法或划线分离法。二 病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）1.分离的准备工作 （1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。（2）培养基的准备:PDA 培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板；（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70酒精、01升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。2.组织分离法 （1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用 70酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。（2）酒精灯放入中间合适

3、位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。）（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精0.1%升汞无菌水无菌水无菌水），将病组织放人 70酒精中浸 35s 后，按无菌操作法将病组织移人 01升汞液中分别表面消毒 1 min 左右（如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中连续漂

4、洗三次，除去残留的消毒剂。（5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放 3-5 块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。（6）将培养皿倒置放人 25 左右恒温箱内培养。一般 34d 后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。（7）除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定；（8）在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在 25左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便

5、可保存。三 病原细菌的分离培养（萝卜黑腐病为例）1.分离的准备工作 （1）分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害。主要危害叶和根。幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多处产生黄色斑，后变“V”字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到维管束呈放射线状、黑褐色；重者呈干缩空洞，维管束溢出菌脓，这一点与缺硼引起的生理性变黑不同。（2）培养基的准备:PDA，后划线纯化 NB；（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、

6、剪刀、解剖刀、镊子、70酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。2.黑腐病菌分离（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用 70酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；（3）取萝卜黑腐病块茎，用 75%酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块（2mm*3mm），用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放 3-5 块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。（4）将培养皿倒置放人 28 左右恒温箱内培养。

7、一般 34d 后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。（5）根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落（黄、红、生防），分别在无菌条件下在 NB 培养基进行划线；在 28左右恒温箱内培养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。（6）观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状，内环呈金黄色，外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹陷，半透明，边缘不整齐。四资料查询其他分离培养方法 1.病原真菌 稀释分离法 (1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编

8、号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入 0510ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。(4)将熔化开冷却到 4550C 的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入 1-2 滴 25乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。为大体估计培养基温度，可将盛培养基的器皿靠在人

9、手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为 4550C。(5)将培养皿翻转后置恒温箱(25)中培养，数日后观察菌落生长情况。(6)挑菌。将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置 25左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。2.病原细菌 病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的

10、肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30C 恒温箱中 24h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用 01升汞表面消毒 05-2min，再用无菌水换洗 3 次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡 2060min，让细菌释放到灭菌水中。(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相

11、差很大。(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在 2628C 恒温箱中培养。13d 后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。五 常用的几种典型的病原菌分离方法 1斑点病原菌的分离。从病斑部分切取每边 35mm 的小块组织，在 70酒精中浸数秒钟后，移人 01的升汞水溶液中处理 3

12、5rain，以灭菌水冲洗 3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。2维管束组织内病原菌的分离。从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用 70酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。3根腐病病原菌的分离。根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。4肉质组织中病原菌的分离。多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。5种子内病原

13、菌分离。将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。6孢子分离法。能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。7土壤带菌分离法。为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。病原细菌与真菌实训报告总结与体会篇二 病原物的分离与培养 病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，

14、以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。、灭菌与消毒 灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方

15、法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。(一)热力灭菌 热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。1干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160170)，时间长 12 h。但干热灭菌温度不能超过 180，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口

16、和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160170)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到 70以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。湿热灭菌 (1)高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121保持 1530 min 进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的

17、不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。(2)常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过 100，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热 100，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培

18、养物取出放室温下 1824 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热 100，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。(二)过滤除菌 许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：(1)蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为 3 种型号：K 型最大，作一般澄清用；EK 滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S 滤

19、孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。(2)微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为 0.22m，但若要将病毒除掉，则

20、需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：组装、灭菌 将 0.22m 孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。提示:整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。(三)辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为 200300

21、 nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以 260 nm 的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和 DNA 的交联，从而抑制了 DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使 O2 氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3 和 H2O2 有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。注意事项:紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过 1.2 m为宜。此外，采

22、用 60Co-射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。(四)化学药品灭菌 化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。植物病理学实验室中常用的化学药品有 2煤酚皂溶液(来

23、苏尔)、0.25新洁尔灭、0.1升汞、35酌甲醛溶液、75乙醇溶液等。消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。二、培养基的制作 1、目的要求 了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。2、基本原理 在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适 pH 范围内才能生长得更好，因此，对

24、不同种类的微生物应将培养基调节到一定的 pH 范围。般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入 1.5%2%的琼脂，半固体培养基是加入 0.2%0.5%的琼脂。琼脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PD

25、A)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。3、材料、试剂与仪器 材料 马铃薯。试剂 葡萄糖、琼脂等。仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH 试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。4、操作步骤 PD

26、A 培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 1520g、蒸馏水 1000 ml，自然 pH。在 PDA 培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为 PSA 培养基。(1)称量 称量去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 1520 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的 15 g 就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。(2)将马铃薯切成小块，放入锅中，加水 1000 ml，煮沸 30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。(3)将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒

27、不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至 1000 ml。提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如 1 000 ml、2000 ml 等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。(5)分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的 15，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。正确

28、的棉塞是形状、划、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有 13 在外，23 在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。(7)包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。(8)灭菌 将上述培养基以 0.1MPa，121，高压蒸气灭菌 20 min。(9)搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至 50左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的

29、器具上，搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。培养基经灭菌后，必须放在 37温箱培养 24h，无菌生长者方可使用。PDA 培养基一般不需要调 pH。对于要调节 pH 的培养基，一般用 pH 试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用 l molL NaOH 或 l molL HCl 溶液进行调节。调节时应逐滴加入 NaOH 或 HCI 溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。三、病原菌的分离培养和纯化 1、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养

30、性状的方法。2、基本方法 植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。3、材料、仪器与用具 3.1 材料 (1)稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉

31、病（果）(Botrytis cinerea)。(5)黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv1achryrnans)。(7)水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pvoryzae)。(8)白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subsppcarotovora)。3.2培养基 PDA 培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。3.3仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环

32、(铒)、70酒精、0.1升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。4、实验操作 (一)病原真菌的分离 1组织分离法 其步骤为：(1)取灭菌培养皿一个，臵于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用 70 酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。（2）用无菌操作法向培养皿中加入 25乳酸 12 滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至 60左右的 PDA 培养基倒人培养皿中，每皿倒 1015 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入 25

33、乳酸 12 滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20gm1)可以抑制 G+细菌生长；加多黏霉素 B(5.0gml。)可以抑制 G-细菌生长；加链霉素(40gml)或氯霉素(50gm1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长 3

34、4 mm)病组织数块。提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。（4）将病组织放入 70酒精中浸 35s 后，按无菌操作法将病组织移入0.1升汞液中分别表面消毒 05、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。提示：先用 70的酒精浸 23 s 是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至 l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异

35、，可自 30s 至 30min 不等，一般情况下，需时间 35 min。(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放46 块。提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。(6)将培养皿倒臵放入 25左右恒温箱内培养。一般 34 d 后观察待分离菌生长结果。(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在 25 左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。提示：除根据菌落的一致性初步确定长

36、出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。2.稀释分离法 (1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入 0.51.0 ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。(4)将熔化并

37、冷却到 4550的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入 12 滴 25乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。(5)将培养皿翻转后臵恒温箱(25)中培养，数日后观察菌落生长情况。(6)挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，臵 25左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。(二)病原细菌的分离 病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在

38、进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在 30恒温箱中 24 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用 0.1升汞表面消毒 0.52 min，再用无菌水换洗 3 次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡 2060 min，让细菌释放到灭菌水中。(3)用灭菌的接种铒，(接种环)；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表

39、面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼，冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在 2628恒温箱中培养。13 d 后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的

40、特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。(三)真菌、细菌培养性状 1真菌培养性状观察 取已分离，纯化的某种真菌菌种；按前述稀释分离法中(1)(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及 pH)和培养温度、光照条件。2细菌培养性状观察 (1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记

41、载培养基种类(成分及 pH)和培养温度、光照条件。(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过 23 d 后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及 pH)和培养温度、光照条件。(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。也要记载培养基种类(成分及 pH)和培养温度、光照条件。