血红蛋白电泳及其临床应用.pdf

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1、.血红蛋白电泳及其临床应用 鄢盛恺 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院检验科，北京 100730 早在 60 多年前 Pauling 等（1949）在研究镰状红细胞贫血患者的血红蛋白（hemoglobin，Hb）时就发现其与正常人不同，证实这种异常的 Hb 在缺氧条件下是产生红细胞镰变和溶血性贫血的原因，并提出了“分子病”这一新概念。引起了人们对 Hb 结构异常及异常 Hb 与遗传性贫血之间关系的重视。近年来，由于生化技术和分子生物学技术的不断发展，相继发现和鉴定了许多新型异常的 Hb。电泳技术作为分离与鉴定 Hb 最简便、准确的方法之一，广泛用于临床遗传性贫血（如地中海贫血）、异

2、常血红蛋白病等疾病的临床诊治。1 概述 Hb 的主要生理功能是将氧气从肺部运送到组织，同时将组织释放的二氧化碳带回到肺部完成氧气和二氧化碳的交换。Hb 是由珠蛋白和亚铁血红素连接成的一种结合蛋白质。每一个 Hb 是由 4 个多肽链组成，而每一肽链又和一个铁卟啉结合。和血红素连接的珠蛋白是一种组蛋白，每一个珠蛋白分子由 4 条肽链组成，每一条肽链和一个血红素结合，构成一个Hb 单体或称为亚单位。因此，每个 Hb 分子是由 4 个 Hb 单体聚合而成的四聚体。现在已知人类的红细胞中存在 3 种正常的 Hb，即 HbA、HbA2 和 HbF。从正常 Hb 中已发现、链、和4 种不同肽链。这些 Hb

3、由均由一对链和一对非链组成。正常成人 Hb 的非链称为链，而胎儿 Hb 中的非链称为链。HbA 含量最多，它由两条链和两条链组成；HbA2（占 3%）由两条链和两条链组成。HbF 正常含量是 Hb 的 2%，由两条链和两条链组成。除 HbA、HbA2 和 HbF 外其他的各种 Hb 常被称为异常 Hb。全世界目前已报道的异常Hb 达 450 余种，而且每年还有新的发现。如美国最常见的两种 Hb 变异体是 HbS 和 HbC，而 Hb Lepore，HbE，HbA2 G-philadelphia 等几类很少见。现已证实这些异常 Hb 的不同之处不在于亚铁血红素部分，而在于珠蛋白部分化学结构的差异

4、。主要类型有：肽链中氨基酸的顺序略有差异。此类型最为多见，约占 90%。如 HbS（HbAHbS 是由于2222S），HbC（HbAHbC 是由于2222C）；各肽链的重新组合或某些正常肽链的缺失。如 HbH（HbAHbH 是由于224），Hb Barts（HbAHb Barts 是由于224）；Hb 肽链的融合。如 Hb Lepore 是链的一半（N 端）与链的一端（C 端）融合而成；肽链中氨基酸增多，可在中间嵌入或在 C 端延长。等。以前发现的 Hb 皆以英文字母命名，由 AQ（B 除外，加上 S）。随着新发现的 Hb 越来越多，字母不够用，现规定从 Q 以后的字母不能再用以命名，而以发现

5、地或实验室命名。临床实验室常用的分离和鉴定Hb的方法有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、柱层析和一些有关的化学试验。地中海贫血是一种常染色体显性遗传病，是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一。应用电泳法鉴别患者血液中 Hb 的类型及含量对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。全自动电泳分析系统的引进将为临床诊断地中海贫血及异常Hb 病提供准确的实验室方法和依据。近年来分子生物学技术已用于因异常 Hb 引起的遗传性疾病的基因诊断中。I-1.2 Hb 电泳 2.1 原理 Hb 的分离和鉴定方法很多，其中以电泳法最为常用且最为重要，很多异常Hb 都是首先用电泳法发现的。其原理是 Hb 中的珠蛋白

6、和其他蛋白质一样为两性电解质，在不同的缓冲液中可带正或负电荷，在电场中向阴极或阳极移动。由于不同的蛋白质之间（正常 Hb 与异常 Hb）其等电点、分子大小、形状及所带电荷的不同，其移动速率不同（电泳迁移率不同），在一定的支持介质中可借以分离。不同的电泳方法具有不同的电场强度、pH、缓冲液或支持物。2.2 常用方法 最常用的方法是碱性缓冲液电泳。早期用醋纤膜作为支持介质，在碱性环境下（pH8.48.6）可快速分离 HbA、HbA2 和 HbF 及其他多种变异体。可是不能将 HbS与 HbD 和 HbG 分开，因为后 3 种 Hb 在这一电泳系统中具有相同的迁移率。同样，在碱性条件下，HbC、Hb

7、E、HbO 与 HbA2 也有相同的迁移率。1976 年美国疾病预防与控制中心（CDC）和美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）曾推荐用醋酸纤维素薄膜电泳（Helena实验室的方法与之基本相同）作为异常 Hb 检测的初级试验。现多用分辨率更高的琼脂糖凝胶进行电泳分析。而酸性缓冲液（pH6.06.2）电泳可用来分离那些在碱性缓冲液电泳中不能分离开的 Hb，如 HbS 及 HbC。在此酸性条件下，HbD、HbO（或 HbE）与 HbS 及 HbC可明显的分开。电泳后 Hb 可用丽春红 S、酸蓝或氨基黑 10B 进行染色，将电泳区带与已知的对照比较，并用光密度计进行扫描定量。对于一些特殊的 Hb

8、如 HbS、HbA2、HbF 和不稳定 Hb（如 HbM、HbH、HbE 等）可分别采用溶解度试验、柱层析法、碱变性法（Singer法）及不稳定试验（异丙醇试验）进行鉴定。珠蛋白链电泳、等电聚焦和氨基酸序列分析可用来证实稀有的 Hb 存在，多用于研究。目前已有多种自动化电泳分析仪可应用于临床常规Hb 电泳，如 Helena 公司的 REP、SPIEF 等型号，Sieba 公司的 HYDRASYS。其中碱性缓冲液电泳为常用筛选方法。2.3 电泳结果 2.3.1 碱性缓冲液电泳 在碱性缓冲液中所有 Hb 均向阳极移动，其移动顺序为：HbHHbA3 HbA1HbFHbS/HbD/HbGHbC，HbA

9、2/HbC/HbE/HbOCA1CA2（CA1 为碳酸酐酶 1，CA2 碳酸酐酶 2）。正常人可见 4 条区带：HbAHbA2CA1CA2（若用联苯胺染色，CA1 与 CA2 则不显色）。在点样处有一条蛋白带，它是非 Hb 成分，为细胞基质和膜蛋白。2.3.2 酸性缓冲液电泳 在酸性缓冲液中，HbA、HbD、HbE 和 HbG 向阴极移动，而 HbF比它们更靠近阴极。HbC 向阳极移动得最快，HbS 也向阳极移动，但比较接近点样点。2.3.3 结果报告 有两种报告方式：定性：将染色后的电泳胶片用质控胶片对比即可判断胶片有无 Hb。定量：染色后的电泳胶片用光密度计扫描，报告各条带的百分比值。各区

10、带参考值，根据不同年龄有不同的范围。例：正常成人：Hb（A+F）94.5%98.5%HbA2 2.5%3.5%新生儿(1 个月)：HbA 12%40%HbF 6%93%HbA2 0.1%1.0%婴儿（3 个月）：HbA 1.00%65.00%HbF34.3%82.95%HbA2 0.042%婴儿(6 个月)：HbA 86%98%.HbF 0.84%10.7%HbA2 0.87%2.9%I-2 3 临床意义 足月的初生婴儿血液中的约 70%80%的 Hb 为 HbF，同时也存在少量的 HbA 和 HbA2。不久 HbF 浓度迅速下降，同时 HbA 相应增加，绝大多数于出生后 6 个月至 2 年后

11、，HbF 降至成人的正常水平。HbA2 增高是轻型地中海贫血的一个重要特征。HbA2 减低见于缺铁性贫血及其它Hb合成障碍性疾病（常见如地中海贫血）。电泳发现异常Hb如HbH、Hb Barts、HbC-S、HbK 等则可确诊为相应的 Hb 分子病。据广东省人民医院资料统计，该院一年所做Hb 电泳 5800 人次（所有产前检查及贫血待查病人），共检出地中海贫血和异常 Hb 病患者1375 人，阳性率 23.7%。其中（1）地中海贫血基因携带者（HbH 病患者、PCR 确诊-地中海贫血、新生儿 Hb Barts 区带者）1018 人，阳性率 17.6%。（2）-地中海贫血基因携带者 327 人，阳

12、性率 5.6%。(3)异常 HbJ、HbK、HbN、HbG、HbD 和 HbE 共 30 人占总人数 0.52%。3.1 -地中海贫血 是由于珠蛋白基因缺失或突变，导致珠蛋白肽链合成障碍所致。我国多数是珠蛋白基因缺失。3.1.1 静止型-地中海贫血 无临床症状、体征、无贫血，红细胞形态正常。HbA2 和HbF 正常，新生儿期可出现 1%3%Hb Barts，出生后 3 个月消失。父母任一方有-地中海贫血。3.1.2 标准型轻型 患者无症状。呈轻型小细胞低色素性贫血。有轻度红细胞形态改变。HbA2 含量为正常低限（1.5%2.5%），/约 1.4/1，HbF 正常。新生儿期 Hb Bart 可达

13、5%8%，6 个月完全消失。父母任一方有-地中海贫血。3.1.3 HbH 病 临床表现有轻、中度贫血，2/3 以上病例有肝脾肿大，常反复出现黄疸。在妊娠、感染及使用氧化剂时，Hb 显著下降。父母双方常有-地中海贫血。实验室检查：有溶血性贫血的特征，骨髓中红细胞系统增生极度活跃。HbH 明显增高（2.540），HbA2及 HbF 含量正常。Hb 电泳可出现 HbH 区带。红细胞渗透脆性试验降低，红细胞包涵体阳性。3.1.4 Hb Barts 胎儿水肿综合征 临床表现：该病为-地中海贫血中最严重者，胎儿常于妊娠后期死亡或早产。胎儿生下时，全身水肿，皮肤苍白，黄疸，肝脾肿大，常于产后数小时内死亡。父

14、母双方均有 HbH 病或标准型-地中海贫血。实验室检查：有溶血性贫血的特征，骨髓红系增生活跃。红细胞形态靶形红细胞明显增多，外周血可见有核红细胞。Hb 电泳：Hb Bart 成分80，抗碱 Hb 增加，出现少量 Hb Portland 或少量 HbH。3.2 -地中海贫血 是由于珠蛋白链合成减少或完全不能合成所致。完全不能合成珠蛋白链的地贫基因称为0，合成减少的称为+。3.2.1 重型 临床表现：又称库利氏贫血（Cooleyanlsnua）患者症状严重，多在儿童期夭折。少数症状较轻，可活至成年，此型又常称为中间型。库利氏贫血在婴儿期 69 个月开始出现贫血，黄疸、肝脾肿大。儿童患者发育不良、智

15、力迟钝、骨骼改变如颧骨隆起，眼距增宽，鼻梁低平。线可见外板骨小梁条纹清晰呈直立的毛发样等。多在幼儿时死于重度贫血或感染。若能生长超过 10 岁，可出现个体矮小，性功能、甲状腺及甲状旁腺等功能低下，可继发血色病，出现心律系乱、心力衰竭、肝硬化、糖尿病等。父母常均有轻型-地中海.贫血。实验室检查：Hb30。3.2.2 轻型 临床表现：无症状或有轻度分血症状，肝脾无肿大或轻度肿大。父母一方为-地中海贫血杂合子。实验室检查：Hb 稍降低或正常，外周血少量靶形细细胞。HbA13.5，HbF 轻度增加（不超过 5）。3.2.3 中间型 临床表现：症状和体征介于重型和轻型-地中海贫血之间。实验室检查：同重型

16、-地中海贫血。遗传学：父或母均为-地中海贫血杂合子状态。根据临床表现，小细胞低色素性贫血，Hb 电泳及 HbF、HbA2 含量测定有家族史，一般不难作出诊断。3.3 异常 Hb 病 异常 Hb 病指因正常成人 HbA 的产生受到部分或完全的抑制，被另一种或几种异常的Hb 部分或完全取代而产生的病症，例如 HbS 和 HbC 等常与溶血性贫血、镰状红细胞或靶形红细胞等特征联系在一起。实际上，某些异常 Hb 的存在，并不引起生理上的任何特征，也并不是所有异常 Hb 携带者都有特殊的临床表现。有些异常 Hb 携带者，可以终生健康地生活，仅在居民普查或因其它疾病就医时才被发现。当然，这些 Hb 变异体

17、仍有其生物化学、遗传学及人类学意义。那些有临床意义的异常 Hb，涉及到预防，治疗等一系列问题。早期发现的一些 Hb 变异体，如 Hb、等，多出现在溶血性贫血患者身上。现在看来，有一些可能伴有地中海贫血。镰状细胞贫血是由纯合子 HbS 引起的是一种很严重且致命的疾患，患婴多在 56 个月时就会出现临床症状，如疼痛、发热，并随着病情的恶化而加重，患者全身器官都会渐渐萎缩，衰竭。镰状细胞贫血也是一种溶血性贫血，只是它的溶血机制与细胞的镰变有关。轻度血友病贫血是由纯合子 HbC 引起，其主要特点是 Hb 在红细胞内沉积并结晶，其症状较镰状细胞贫血轻。Hb是在先天性高铁血红蛋白症患者血中发现的，可能与先天性青紫有关。近来又发现不少与先天性亨氏（Heinz）小体溶血性贫血有关的不稳定 Hb。红细胞增多症与异常 Hb 的关系问题，也越来越引起人们关注。I-4 I-3