叶绿体的分离与荧光观察讲稿.ppt

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1、关于叶绿体的分离与荧光观察第一页，讲稿共七十三页哦v目的要求v基本原理v实验用品v方法与步骤v实验结果v实验报告第二页，讲稿共七十三页哦实验目的v1通过植物细胞叶绿体的分离了解细胞 器分离的一般原理和方法 v2了解荧光显微镜的使用原理和方法v3观察叶绿体的自发荧光和次生荧光第三页，讲稿共七十三页哦实验原理v将组织匀浆后悬浮在等渗的介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。在一给定的离心场中同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间就能使非均一悬浮液中的颗粒按照大小、密度先后沉降在离心管底部。第四页，讲稿共七十三页哦 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行

2、观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时能在短时间内放射出比照射波长更长的光（如可见光），称为荧光。有些生物体内物质受激发光照射后可直接发出荧光，称自发荧光，如叶绿素的火红色第五页，讲稿共七十三页哦 材料本身不发荧光，但吸收荧光染料后同样也能发荧光，称次生荧光，如叶绿体吸收吖啶橙后发的橘红色荧光。第六页，讲稿共七十三页哦实验方法v1选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称40克于150ml0.35mol/lNaCL中，装入组织捣碎机低速匀浆5min，将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。然后用手动匀降器手动匀浆2到3min。v2取滤液4m

3、l在1000r/min下离心2min，弃取沉淀第七页，讲稿共七十三页哦3将上清液在3000r/min下离心5min，弃上清，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）v4将沉淀用0.35mol/lNaCL溶液悬浮第八页，讲稿共七十三页哦v5取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后可在光学显微镜和荧光显微镜下观察v在普通光镜下观察v在荧光显微镜下观察v滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，荧光显微镜下观察第九页，讲稿共七十三页哦实验结果v普通光镜下可看到叶绿体为绿色橄榄形，高倍镜下可看到叶绿体内部有较深的小颗粒，就是基粒。v荧光显微镜下叶绿体发火红色荧光，加吖啶橙后发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。第

4、十页，讲稿共七十三页哦实验报告v 1、观察叶绿体的形态结构,测量510个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。v2、记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，分析结果。第十一页，讲稿共七十三页哦细胞的凝集反应细胞的凝集反应第十二页，讲稿共七十三页哦v目的要求v基本原理v实验用品v方法与步骤v实验结果v实验报告第十三页，讲稿共七十三页哦实验目的v理解凝集素使细胞发生凝集反应的原理，观察细胞的凝集现象。第十四页，讲稿共七十三页哦实验原理v细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞之间的联系，细胞的生长的分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分

5、枝状糖分子有关。第十五页，讲稿共七十三页哦v 凝集素（lectin）是一类含糖的（少数除外）并能与糖专一结合的蛋白质，它能具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用，凝集素使细胞凝集是由于他与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。第十六页，讲稿共七十三页哦实验用品v1、材料：土豆块茎v2、器材和仪器：显微镜，粗天平，载玻片，滴管2支，离心管2支。v3、PBS缓冲液 称取NaCl 7.2g，Na2HPO4 1.48g，KH2PO40.43g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH为7.2第十七页，讲稿共七十三页哦v4、2%的红细胞 以无菌方法抽取甲鱼血（加抗凝

6、剂），用生理盐水洗5次，每次离心2000rpm，5min；之后按红细胞压积（红细胞在血液中所占的容积比值称为红细胞压积）用生理盐水稀释为2%的红细胞悬液。第十八页，讲稿共七十三页哦实验方法v1、土豆凝集素的制备 称取去皮土豆块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液中即含有可溶性土豆凝集素。v凝集反应第十九页，讲稿共七十三页哦 用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞悬液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍镜下观察血球凝集现象。以PBS液加2%红细胞悬液作对照实验。第二十页，讲稿共七十三页哦实验结果v相较于对照，加上凝集素后，许多鸡红细胞凝集在一起结成球状。第二十一页，讲

7、稿共七十三页哦实验报告v简图表示红细胞凝集原理。第二十二页，讲稿共七十三页哦细胞膜的渗透性第二十三页，讲稿共七十三页哦v目的要求v基本原理v实验用品v方法与步骤v实验结果v实验报告第二十四页，讲稿共七十三页哦实验目的v 1 了解细胞膜的渗透性v 2 了解各物质进入红细胞的速度第二十五页，讲稿共七十三页哦实验原理v 当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透人的溶质分 子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞 内溶质浓度增加时，导致水的摄人。第二十六页，讲稿共七十三页哦v红细胞膨胀 到一定程度时，细胞膜破裂，即红细胞发生溶血.

8、由于溶质透人速度不同，溶血时间也不同。第二十七页，讲稿共七十三页哦实验用品v 试剂：0.17 molL氯化钠，0.17 molL 氯化铵，0.17 molL硝酸钠，0.12 molL硫酸 钠，0.12 molL草酸钠，0.12molL醋酸钠，0.32 molL葡萄糖，0.32 molL甘油，0.32 molL乙醇，0.32molL丙醇。仪器：显微镜，载玻片，盖玻片，吸管，小烧杯，试管，试管架第二十八页，讲稿共七十三页哦实验方法v 1、低渗溶液：取试管1支，加入10mL蒸馏水，然后再加入1 mL稀释的鸡血，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为红色透明，红细胞发生破裂，造成所有红细胞溶血

9、，使光线容易通过。显微镜下观察溶血前后红细胞的形态。第二十九页，讲稿共七十三页哦v2、鸡血红细胞的渗透性：取试管10支，分别加入上述10种溶液各10 mL，再 加入1mL稀释的鸡血，记下时间，轻轻摇动使混匀，注意是否发生溶血；若发生溶血，记录溶血过程所需的时间（自加入稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。第三十页，讲稿共七十三页哦实验结果不同的试剂导致细胞的不同反应。1，溶血，注意时间不同；2，不出现溶血，为什么？第三十一页，讲稿共七十三页哦实验报告第三十二页，讲稿共七十三页哦细胞融合细胞融合第三十三页，讲稿共七十三页哦v目的要求v基本原理v实验用品v方法与步骤v实验结果v实验报告第三十四

10、页，讲稿共七十三页哦实验目的v1.了解PEG诱导细胞融合的原理v2.掌握细胞融合技术第三十五页，讲稿共七十三页哦实验原理v聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可，用作细胞融合剂。聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的第三十六页，讲稿共七十三页哦 表面张力作用，从而使细胞发生融合，进而细胞质沟通，形成一个双核或多核细胞第三十七页，讲稿共七十三页哦实验用品v1.器材：离心机，移液枪，水涡锅，载玻片，盖玻片，血细胞计数板，刻度试管，刻度吸管，电炉

11、，冷冻离心管，显微镜，烧杯，吸管v2.试剂：Alsever溶液，GKN溶液，0.85%生理盐水，50%PEG，蒸馏水第三十八页，讲稿共七十三页哦v0.85生理盐水：生理盐水：0.85g氯化钠溶于氯化钠溶于 100mL重蒸水中。重蒸水中。vALsver液：液：葡萄糖葡萄糖 2.05g,枸橼酸钠枸橼酸钠 0.8g ,NaCl 0.42 加蒸馏水至加蒸馏水至100mlvGKN液：液：NaCl 8g ，KCl 0.4g ,Na2HPO42H2O 1.77g，NaH2PO4H2O 0.69g,葡萄糖葡萄糖 2g,苯酚红苯酚红 0.01g 溶于溶于1000ml蒸馏水中蒸馏水中第三十九页，讲稿共七十三页哦v

12、50PEG混合液：混合液：称取少许称取少许PEG(Mw 6000)放人刻度离心管内，在沸水浴中加放人刻度离心管内，在沸水浴中加热，热，使其溶化，待冷却至使其溶化，待冷却至50时，加入时，加入预热至预热至50 的等体积的的等体积的GKN液，混匀。液，混匀。注意使用前配制注意使用前配制。第四十页，讲稿共七十三页哦实验方法v1.取新鲜的鸡血与Alsever溶液以1：4的比例混匀，可在冰箱内存放一周（4）v2.取1ml贮存鸡血加入4ml0.85%生理盐水，充分混匀800r/min,3min弃上清，重复离心两次。v3.弃上清再加4mlGKN溶液离心，加GKN液，制成细胞悬液。第四十一页，讲稿共七十三页哦

13、v4.取上述细胞悬液1ml与刻度试管中，用血细胞计数板计数，用GKN液将其调整为5106个/mlv5.取上述细胞悬液1ml于另一刻度试管中，放入37水浴中，浴热20min，PEG液也浴热20min第四十二页，讲稿共七十三页哦v6、20min后，将0.5ml 50%PEG液逐滴沿管壁加入到1ml细胞悬液中，边加入边摇匀，然后再放入37水浴中保温20min。v7、20min后，取少量于载玻片上，置显微镜下观察。第四十三页，讲稿共七十三页哦实验结果v显微观察，应发现一些多核和双核的较大的细胞。表明细胞发生了融合。第四十四页，讲稿共七十三页哦实验报告第四十五页，讲稿共七十三页哦线粒体的分离与观察第四十

14、六页，讲稿共七十三页哦v目的要求v基本原理v实验用品v方法与步骤v实验结果v实验报告第四十七页，讲稿共七十三页哦实验目的v1、了解差速离心法分离线粒体的方法v2、学习体外活染的方法第四十八页，讲稿共七十三页哦实验原理v差速离心：在一定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间就能够使这些颗粒按其大小、重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。第四十九页，讲稿共七十三页哦v悬浮介质：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能够保

15、持细胞器的结构和酶的活性。v詹纳斯活染：詹纳斯绿B是对线粒体专一的、毒性很小的、活性染料，由于其碱性，解离后第五十页，讲稿共七十三页哦 带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。第五十一页，讲稿共七十三页哦实验用品v绿豆芽、烧杯、匀浆机、纱布、剪刀、1%詹纳斯绿B、0.25M蔗糖+0.01M Tris-Hcl缓冲液、低/高速离心机、显微镜、玻片、滤纸第五十二页，讲稿共七十三页哦实验方法v1、选取鲜嫩的绿豆芽用剪刀剪取芽体约30克加入200ml0.25M蔗糖tris-Hcl缓冲溶液，装入组织捣碎机匀浆

16、，将捣碎液用6层纱布过滤于烧杯中。v2、取滤液5ml于离心管中，1500r/min离心10min。第五十三页，讲稿共七十三页哦v3、取上清1ml于EP管中，13300r/min离心10min，弃上清。v4、将沉淀用1ml缓冲液悬浮，然后13300r/min离心10min，弃上清，沉淀即为线粒体。第五十四页，讲稿共七十三页哦v5、取沉淀涂片，不待干即滴加詹纳斯绿B染20min，盖上盖玻片，镜检。v6、注意v整个操作过程应注意使样品保持4摄氏度左右，避免酶失活。v涂片时勿太浓密第五十五页，讲稿共七十三页哦实验结果v线粒体呈小棒状或哑铃状，活的线粒体呈蓝绿色，失活的线粒体透明。第五十六页，讲稿共七十

17、三页哦实验报告第五十七页，讲稿共七十三页哦脂质体的制备脂质体的制备 第五十八页，讲稿共七十三页哦v目的要求v基本原理v实验用品v方法与步骤v实验结果v实验报告第五十九页，讲稿共七十三页哦实验目的v学习制备脂质体的方法。第六十页，讲稿共七十三页哦实验原理v脂质体常用类脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、胆固醇等制备。其中最常用的是磷脂酰胆碱和胆固醇的混合物。利用磷脂的双亲分子特性，加入水相后形成囊状或液晶态，用超声波处理，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。第六十一页，讲稿共七十三页哦实验用品v器材v超声波清洗机、光学显微镜、旋涡混合器、离心

18、机、试管、Ep管、移液枪v试剂v磷脂液：100mg经丙酮-乙醚法纯化的卵磷脂，57.2mg胆固醇，溶于1mL氯仿。第六十二页，讲稿共七十三页哦vTris缓冲液：称取Tris 0.12g,EDTA 0.288mg,溶于80mL去离子水中，用0.1mol/L盐酸调pH7.2，再加水至100mL。v1%番红花红染液。第六十三页，讲稿共七十三页哦实验方法v1配制磷脂液、Tris缓冲液。v2取 660L磷脂液于一小试管中，加入番红花红染液500L,再加入 1060LTris缓冲液。v3将混合液旋涡混合1min,然后于超声波清洗机中处理10min,取出静置30min,可见液体分为三层。第六十四页，讲稿共七

19、十三页哦v4取中层液体20L于 Ep管中，再加入550LTris缓冲液，5000rpm离心3min,取下层观察。第六十五页，讲稿共七十三页哦实验结果v光学显微镜下可看到大小不均一的包裹进染液的脂质体，呈红色。第六十六页，讲稿共七十三页哦实验报告第六十七页，讲稿共七十三页哦类坏死的处理及死、活细胞鉴别第六十八页，讲稿共七十三页哦试验目的v了解细胞损伤的过程及死、活细胞的鉴别第六十九页，讲稿共七十三页哦实验原理v类坏死细胞是介于生活和死亡之间的临界状态。引起类坏死的方法多种多样，如：高温，冷冻，紫外线照射，酸碱处理等。v细胞发生类坏死及死亡其生理和结构均发生一系列变化，这些变化可用活体染色法显现出

20、来。第七十页，讲稿共七十三页哦实验用品v一、材料v蟾蜍或青蛙的后肢芽期蝌蚪，培养的细胞悬浮液。v二、器材v蜡盘、昆虫针、解剖镊、眼科剪、培养皿 等。v三、试剂vRinger液、Hank液、台盼蓝等。第七十一页，讲稿共七十三页哦实验方法一、蝌蚪皮肤类坏死的处理及活体染色1、室温染色10-24h2、分组，处理，饲养3、观察，并设对照4、恢复处理，铺片观察，比较v二、培养细胞的类坏死处理及活体染色v1、编号，加细胞悬液v2、加不同浓度NH3COOH溶液，培养v3、加Hank液，混匀，离心，取上清，重复，加原培养液v4、加台盼蓝，混匀，静置v5、加悬液到细胞计数板，计算细胞总数和未染色细胞数v6、用不经NH3COOH处理的悬液对照，计数v7、换培养液，培养，计数第七十二页，讲稿共七十三页哦感感谢谢大大家家观观看看第七十三页，讲稿共七十三页哦