抗原抗体反应的应用免疫学导论.ppt

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1、关于抗原抗体反应的应用免疫学导论现在学习的是第1页，共59页免疫沉淀和免疫凝集 免疫沉淀免疫沉淀和和免疫凝集免疫凝集利用抗原与抗体特异性利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析是最经典的血清学方法。是最经典的血清学方法。现在学习的是第2页，共59页溶液中的沉淀反应 在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀反应，可用于抗原或抗体的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀试验。现在学习的是第3页，共59页现在学习的是第4页，共59页环状沉淀试验原理

2、将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面，将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面，抗原与抗体在两液交界面处特异性结合，形成白抗原与抗体在两液交界面处特异性结合，形成白色沉淀环色沉淀环。【评价】：简便快速 只能定性 敏感性低现在学习的是第5页，共59页凝胶中沉淀反应抗原分子和抗体分子在凝胶介质中自由扩散形成梯度浓度，抗原与抗体在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。可用于测定抗原与抗体的相对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、纯度及相互关系。主要有两种方法：单向免疫扩散、双向免疫扩散现在学习的是第6页，共59页单向免疫扩散基本原理基本原理 待测抗原从局部含有相应定量抗体的凝胶内待测抗原从局部含

3、有相应定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在二者自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在二者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环大小比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环大小与抗原的浓度成正相关。与抗原的浓度成正相关。现在学习的是第7页，共59页方法：将适当浓度的抗体混于琼脂（0.8%1%）中，琼脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉淀。沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。单向免疫扩散单向免疫扩散现在学习的是第8页，共59页影响因素1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关 2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊 3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环

4、小 4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长 5.扩散温度：437内温度与扩散速度正相关 6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关现在学习的是第9页，共59页双向免疫扩散【原理】：将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。现在学习的是第10页，共59页染色标本图染色标本图1.1.抗原抗体双向自由扩散抗原抗体双向自由扩散2.242.24小时出结果小时出结果3.3.呈现沉淀线或弧呈现沉淀线或弧模拟图模拟图现在学习的是第11页，共59页结果分析：结果分析：抗原或抗体是否存在；抗原或抗体是否存在；抗原或抗体的纯度抗原或抗体的纯度：若在两孔内

5、有两对或两对以上的若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。抗原或抗体相对浓度：抗原或抗体相对浓度：抗原浓度越高，形成的沉淀线抗原浓度越高，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越高，形成的沉淀线距抗距离抗原孔越远，抗体浓度越高，形成的沉淀线距抗体孔越远；体孔越远；抗原或抗体相对分子量：抗原或抗体相对分子量：抗原或抗体在琼脂内的扩抗原或抗体在琼脂内的扩散受分子量影响，分子量大者扩散速度慢，扩散圈小，散受分子量影响，分子量大者扩散速度慢，扩散圈小，局部浓度高，因此形成的沉淀圈弯向分子量大的一方，局部浓度高，因此形成的沉淀

6、圈弯向分子量大的一方，若二者分子量相等，则沉淀线呈直线；若二者分子量相等，则沉淀线呈直线；现在学习的是第12页，共59页抗原性质：抗原性质：观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是否有共同成分。同样的纯抗原否有共同成分。同样的纯抗原a a放在两个邻近的孔放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原a a和和b b，则两线互相交叉；若两个抗原有部分

7、相同成，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分分a a和和abab，则两线除有相连部分以外还有一伸出部，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。分。滴定抗体效价：滴定抗体效价：固定抗原浓度，稀释抗体，出现固定抗原浓度，稀释抗体，出现沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。现在学习的是第13页，共59页抗原、抗体相对分子量Ag分子量大于AbAb分子量大于AgAg分子量等于Ab现在学习的是第14页，共59页抗原决定簇部分相同抗原决定抗原决定簇完全相簇完全相同同两个抗原的抗原决定簇完全不同现在学习的是第15页，共59页双向琼脂扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体2.抗原性

8、质分析 3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定现在学习的是第16页，共59页电泳条件下的沉淀反应 免疫电泳是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率免疫电泳是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离的特性与免疫扩散结合进行分析的不同能被分离的特性与免疫扩散结合进行分析的方法方法。原理：原理：混合的蛋白质抗原在时带负电混合的蛋白质抗原在时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，使混荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，使混合的抗原组分得以分离。抗体可以通过自由扩散，合的抗原组分得以分离。抗体可以通过自由扩散，也可以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性也可以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线，从而

9、提高免疫沉淀的灵敏度。沉淀线，从而提高免疫沉淀的灵敏度。常用的免疫方法有：常用的免疫方法有：血清免疫电泳、火箭电泳和血清免疫电泳、火箭电泳和对流免疫电泳对流免疫电泳现在学习的是第17页，共59页血清免疫电泳 将患者血清和正常人血清分别放在凝胶将患者血清和正常人血清分别放在凝胶上近负极端的小孔中进行电泳分离后，在两中抗上近负极端的小孔中进行电泳分离后，在两中抗原之间沿电泳方向挖一条平行的小槽，加入抗血原之间沿电泳方向挖一条平行的小槽，加入抗血清进行双扩散。清进行双扩散。现在学习的是第18页，共59页-+免疫电泳示意图免疫电泳示意图现在学习的是第19页，共59页根据沉淀线的位置及粗细，可分析样品中

10、的抗根据沉淀线的位置及粗细，可分析样品中的抗原含量；原含量；根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其它特根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其它特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质。现在学习的是第20页，共59页火箭电泳 将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定 量检测技术。原理：电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与样本中的抗原浓度呈正相关。现在学习的是第21页，共59页现在学习的是第22页，共59页注意要点：注意要点：选择无电渗或电渗

11、很小的琼脂糖，否则火箭形选择无电渗或电渗很小的琼脂糖，否则火箭形状不规则；状不规则；若火箭顶部形状呈不清晰的云雾状，提示电泳若火箭顶部形状呈不清晰的云雾状，提示电泳时间不够，未到达终点；时间不够，未到达终点；作作IgGIgG定量时，由于琼脂中的抗定量时，由于琼脂中的抗IgGIgG抗体也是抗体也是IgGIgG，免疫反应中的抗原抗体性质相同，由于电渗，免疫反应中的抗原抗体性质相同，由于电渗作用影响了待测作用影响了待测IgGIgG的泳动，火箭峰呈纺锤状。的泳动，火箭峰呈纺锤状。为了抵消电渗作用，可用甲醛使样本为了抵消电渗作用，可用甲醛使样本IgGIgG上的氨上的氨基甲酰化，使本来带两性电荷的基甲酰化

12、，使本来带两性电荷的IgGIgG只带负电荷，只带负电荷，加快泳动速度，出现伸向阳极的火箭峰。加快泳动速度，出现伸向阳极的火箭峰。火箭电泳的检测灵敏度在火箭电泳的检测灵敏度在g/mlg/ml水平。可采用水平。可采用竞争法放射自显影技术来进行火箭免疫电泳，竞争法放射自显影技术来进行火箭免疫电泳，灵敏度可达灵敏度可达ng/mlng/ml。现在学习的是第23页，共59页对流免疫电泳 在在pH8.6的琼脂凝胶中，的琼脂凝胶中，大部分蛋白质抗原在碱性溶液中带负电荷，且大部分蛋白质抗原在碱性溶液中带负电荷，且分子较小，电泳时，泳向正极。分子较小，电泳时，泳向正极。抗体带弱负电荷，但分子量大，电泳力小于电渗力

13、，泳抗体带弱负电荷，但分子量大，电泳力小于电渗力，泳向负极。向负极。抗原和抗体相遇，比例合适时形成肉眼可见的抗原和抗体相遇，比例合适时形成肉眼可见的沉淀线。沉淀线。现在学习的是第24页，共59页AgAb-+1.Ag阳性 2.Ag弱阳性 3.Ag强阳性 4.Ag强阳性对流免疫电泳示意图对流免疫电泳示意图现在学习的是第25页，共59页免疫共沉淀 在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作用，在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作用，可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分离。可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分离。蛋白质相互作用通过非共价结合，用针对蛋白质相互作用通过非共价结合，用针对其中一种蛋白质的特异性抗体进行的免疫沉淀

14、，其中一种蛋白质的特异性抗体进行的免疫沉淀，与该蛋白相互作用的其他蛋白也同时被沉淀下与该蛋白相互作用的其他蛋白也同时被沉淀下来。来。如果第一抗体结合后再加入第二抗体或如果第一抗体结合后再加入第二抗体或A A蛋白可使抗原抗体形成更大的复合物易于沉淀，蛋白可使抗原抗体形成更大的复合物易于沉淀，也可通过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形也可通过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形成。成。现在学习的是第26页，共59页免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解现在学习的是第27页，共59页1.关键因素关键因素2.1.抗原的丰富度抗原的丰富度3.2.抗体的结合能力抗体的结合能力4.3.蛋白质和抗体的蛋白质和抗体的5

15、.可接触性可接触性现在学习的是第28页，共59页免疫凝集 大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝集小块，即为免疫凝集。凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的凝集现象。现在学习的是第29页，共59页 最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细胞表面的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可以通过交联将红细胞连接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝试验。现在学习的是第30页，共59页细菌的血凝试验常用来 对细菌进行鉴定与分型，如沙门菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度的

16、限制，在实际应用越来越少。现在学习的是第31页，共59页 女科学家 R.Yalow（美,1921）1950末发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖1.基本原理（1）竞争结合分析：Ag+Ab AgAb *Ag+Ab *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用标记核素：（1）125I：射线，半衰期 60 天（2）3H：射线，半衰期 12.3 年3.测量仪器（1）计数仪（2）液闪仪免疫标记一、放射免疫分析（一、放射免疫分析（RIA RIA）现在学习的是第32页，共59页一、放射免疫分析（一、放射免疫分析（RIA RIA）基本原理基本原理 采用定量的标记抗原（采用定量的标记抗原（AgAg）和

17、非）和非标记抗原（标记抗原（AgAg）竞争性结合有限量特异性）竞争性结合有限量特异性抗体（抗体（AbAb）的反应。）的反应。采用定量的标记抗原（采用定量的标记抗原（AgAg）和非标记抗原）和非标记抗原（AgAg）竞争性结合有限量特异性抗体（）竞争性结合有限量特异性抗体（AbAb）的）的反应反应现在学习的是第33页，共59页4.基本试剂（1）标准品与质控品a.意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据b.要求：化学结构上与待测物有相同的化学结构 化学纯度上对竞争反应有干扰的杂质的含量低 含量准确 注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期c.种类：国际标准、国家标准、企业标准现在学习

18、的是第34页，共59页（2）标记物a.a.对标记物的要求对标记物的要求 比活度高：即单位物质的放射性强度高比活度高：即单位物质的放射性强度高 生物活性及免疫活性与标记前改变小生物活性及免疫活性与标记前改变小 放射化学纯度高：应放射化学纯度高：应 95%95%稳定性好：标记的同位素不易脱落稳定性好：标记的同位素不易脱落现在学习的是第35页，共59页b.标记方法：氯胺-T 法：最常用的 125I 标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法简便，但易造成蛋白质的损伤 乳过氧化酶法：Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应时间长 置换法：3H 最常用c.标记产物的纯化：常用 Sephade

19、x 层析，也可用硅胶 G 薄板层析或 HPLC 分离d.标记产物的鉴定：常用 RIA 法 最大结合百分率 标准曲线比较法e.半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），再对载体作标记现在学习的是第36页，共59页（3）特异性结合抗体a.对特异性结合抗体的要求：亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度 特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应）低 滴度（效价）高：指结合 50%标记抗原时抗体的稀释度高 稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定b.抗体的制备 选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊 应用佐

20、剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油+卡介苗）选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数现在学习的是第37页，共59页 c.抗体的纯化去除杂抗体：用抗原吸附法 提取特异性 IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和层析纯化d.抗体的鉴定 鉴定内容：效价、亲和力、特异性 鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA e.单克隆抗体的使用：用于 IRMA 或 RIA，特异性高 不一定优于传统的多克隆抗体现在学习的是第38页，共59页 非放射性免疫标记方法由于比放射性标记更非放射性免疫标记方法由于比放射性标记更为简便，同时又保持

21、了灵敏快速的特点而得到了为简便，同时又保持了灵敏快速的特点而得到了发展，其中酶标记免疫试验是广泛使用的方法。发展，其中酶标记免疫试验是广泛使用的方法。用于标记酶的种类也越来越多，常用的有碱用于标记酶的种类也越来越多，常用的有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、性磷酸酶、辣根过氧化物酶、-半乳糖苷酶半乳糖苷酶和脲和脲酶。酶。酶联免疫酶联免疫吸附试验吸附试验现在学习的是第39页，共59页酶免疫试验法有两类：1.均相法：抗原与抗体反应后，不必将游离的与结合的抗原抗体分离，就可测定被测分子的含量。固相法：将抗原抗体吸附在固相表面，抗原抗体反应后，将固相与液相分离出去游离的抗原抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的

22、酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附试验(ELISA).现在学习的是第40页，共59页ELISA有直接发、间接法及夹心法等不同反应方式直接法直接法现在学习的是第41页，共59页间接法现在学习的是第42页，共59页夹心法现在学习的是第43页，共59页特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 现在学习的是第44页，共59页荧光与发光免疫分析 用于标记抗体的荧光化合物有异硫氰荧光素（FITC）和罗丹明荧光素等。目前较好的是时间分辨荧光免疫分析法（TrFIA），提高了免

23、疫分析技术的灵敏度和特异性。现在学习的是第45页，共59页直接法优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。现在学习的是第46页，共59页间接法优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。现在学习的是第47页，共59页亲和标记免疫分析 金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgG Fc段有高度的亲和力。用酶、同位素、荧光素等标记A蛋白，替代第二抗体直接与抗体结合，可用

24、于抗原抗体反应的分析。现在学习的是第48页，共59页免疫定位分析免疫荧光定位分析：常用的荧光素异硫氰荧光素和异硫氰四甲基罗丹明等具有特殊的激发波长和发射波长。用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+T细胞核CD8+T细胞亚群，在临床上有重要意义。现在学习的是第49页，共59页抗原抗体反应的其他应用免疫亲和色谱 原理：利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性和可结合的特点以及色谱技术的差速迁移理论而建立的一种新型色谱技术。就是将被测物的特异性抗体固定在适当的固相载体上，制备成免疫亲和色谱的固定相（免疫亲和色谱柱），根据被测物的反应原性、抗原抗体结合的特异性记忆，抗原抗体复合物在一定条件下能够可逆解离

25、的特性进行色谱分离。现在学习的是第50页，共59页一种高效、简便的样品前处理技术，大大简化了提取、净化、衍生化等复杂的前处理过程，在食品分析中属于痕量检测，检测线非常低（达10-12数量级）。生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。现在学习的是第51页，共59页影响亲和作用的因素1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲

26、和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失现在学习的是第52页，共59页免疫亲和色谱的特点选择性，专属性强 因为IAC是利用抗原抗体的特异性反应，所以只有与色谱固定相抗原决定簇相吻合的被测物才能被结合。可通过制备高纯度的抗体以及有多个活性位点的抗体来尽可能地提高抗原的选择性和专属性。现在学习的是第53页，共59页免疫亲和色谱的特点纯化、浓集效果好 本方法灵敏度高，分析时间短，分析效率高。但有一定的仪器费用支出。既可作为样品的制备技术，

27、也可作为样品的分离手段，还可用于样品的浓缩纯化。现在学习的是第54页，共59页免疫亲和色谱的特点可循环（再生）使用 与传统的固相萃取技术相比，免疫亲和柱可在适当的缓冲液冲洗后再生重复使用。现在学习的是第55页，共59页免疫生物传感器与抗体芯片 生物传感器由三部分组成：生物受体、转导体和电子放大处理器。抗体是理想的生物受体，可通过直接或间接的方式连接至转导体上。抗原抗体反应可以通过电化学、光学、压电和热量改变等的变化表现出来，从而能被转导体直接或间接检测到。现在学习的是第56页，共59页抗体芯片 抗体芯片是固相化间接免疫反应和免疫生物感应器的综合。大量不同种类的抗体通过密集布阵在玻片或其他经过修饰的载体上，经过不同处理的细胞蛋白质用荧光染料染色后再与玻片上的抗体温育，经过洗涤处理后出去非特性吸附的蛋白质，结合的蛋白质通过光电扫描测定其强度。现在学习的是第57页，共59页由于细胞蛋白质种类数量庞大，通常无法得到所有蛋白质的抗体，目前的商用抗体芯片大多数为特定蛋白谱，如特定肿瘤蛋白谱，特定信号转导通路蛋白谱或某些基因的表达蛋白谱等。现在学习的是第58页，共59页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第59页，共59页