实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳精选PPT.ppt

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1、关于实验一质粒的提关于实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳取及琼脂糖凝胶电泳第1页，讲稿共23张，创作于星期日载体构建过程载体构建过程一、质粒一、质粒DNA的提取及电泳检测的提取及电泳检测二、目的基因的二、目的基因的PCR扩增及产物检测扩增及产物检测三、三、DNA的定性定量分析及酶切产物检测的定性定量分析及酶切产物检测质粒双酶切PCR产物双酶切四、酶切产物及四、酶切产物及PCR产物的纯化及检测产物的纯化及检测五、五、DNA的连接及检测的连接及检测六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备七、质粒七、质粒DNA的原核转化和蓝白斑筛选的原核转化和蓝白斑筛选酶切产物

2、+酶切产物T载体+PCR产物第2页，讲稿共23张，创作于星期日实验学时：实验学时：6学时学时实验类型：综合性实验类型：综合性每组人数：每组人数：4人组人组实验一实验一 质粒质粒DNA的提取的提取及及琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测第3页，讲稿共23张，创作于星期日一、实验目的一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法。粒的技术和方法。一、碱裂解法小量制备质粒一、碱裂解法小量制备质粒DNA第4页，讲稿共23张，创作于星期日质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 20200个拷贝/细胞 严紧型质粒 12个拷贝/细胞实验背景实验背景质粒是细菌细

3、胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNADNA分子，能稳定地独立存在分子，能稳定地独立存在分子，能稳定地独立存在分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒

4、是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质质粒粒DNADNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNADNA；如果质粒；如果质粒DNADNA的两条链在同一处断裂，则形成线状的两条链在同一处断裂，则形成线状DNADNA。当提取的质粒。当提取的质粒DNADNA电泳时，同一质电泳时，同一质粒粒DNADNA其其超螺旋超螺旋形式的泳动速度要比形式的泳动速度要比开环开环和线状分子的泳动速度快。和线状分子的泳动速度快。第5页，讲稿共23张，创作于星期日由由pUC18载体改建而成，在载体

5、改建而成，在pUC18载体的载体的MCS处的处的XbaI和和SalI识别位点之间插入识别位点之间插入了了EcoRV识别位点，用识别位点，用EcoRV进行酶切进行酶切反应后，再在两侧的反应后，再在两侧的3端添加端添加“T”而成。而成。因大部分耐热性因大部分耐热性DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR反应反应时都有时都有PCR产物的产物的3末端添加一个末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产产物的连接、克隆效率。物的连接、克隆效率。复制起点复制起点筛选标记基因筛选标记基因多克隆位点多克隆位点第6页，讲稿共23张，创作于星期日二、实验原理二、实验原理高

6、碱高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体染色体DNADNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNADNA；线性双链线性双链DNADNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒质粒DNADNA不发生断裂，保持双链闭合环状；不发生断裂，保持双链闭合环状；双链双链DNADNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNADNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNADNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复

7、天然构型，溶解在上清液中纯化纯化RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质，并用酚抽提法除去残留的蛋白质第7页，讲稿共23张，创作于星期日三、仪器、材料与试剂三、仪器、材料与试剂(一)仪器 1恒温培养箱 2恒温摇床 3台式离心机 4高压灭菌锅(二二)材料材料1含连接外源基因质含连接外源基因质粒的粒的E.coli 21.5mLEppendorf管管3吸头、微量移液器吸头、微量移液器第9页，讲稿共23张，创作于星期日SolutionI50mmolL葡萄糖葡萄糖25mmolLTrisHCl(pH8.0)10mmolLEDTA(三三)主要试剂主要试剂溶液溶液：由葡萄糖、

8、：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成组成(保护、缓冲保护、缓冲)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的机械剪切作用机械剪切作用,防止破防止破坏质粒坏质粒(保护作用保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对质粒分子的降解作酶对质粒分子的降解作用（保护作用）用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）范围（缓冲作用）第10页，讲稿共23张，创作于星期日SolutionII 0.4mol/LNaOH，2SDS,用前等体积混合用前等

9、体积混合溶液溶液II：由：由SDS（十二烷基硫酸钠）与（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成组成(裂解、变性裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性分子变性（DNA变性作用）变性作用）第11页，讲稿共23张，创作于星期日 溶液溶液溶液溶液IIIIII：HAcHAc和和和和 KAcKAc组成的高盐溶液组成的高盐溶液组成的高盐溶液组成的高盐溶液(复性，分离复性，分离复性，分离复性，分离)HAcHAc溶液溶液溶

10、液溶液能中和溶液能中和溶液能中和溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNADNA变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，变性而发生缠绕，并使质粒并使质粒并使质粒并使质粒DNADNA复性。复性。复性。复性。KAcKAc会与会与会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的去；溶液中的去；溶液中的去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS复合物缠绕成大

11、分子而与复合物缠绕成大分子而与复合物缠绕成大分子而与复合物缠绕成大分子而与小分子质粒小分子质粒小分子质粒小分子质粒DNADNA分离。分离。分离。分离。SolutionIII5molL乙酸钾乙酸钾60mL冰乙酸冰乙酸115mL水水285mL 第12页，讲稿共23张，创作于星期日TE缓冲液缓冲液10mmo1LTrisHCl1mmo1LEDTA(pH8.0)胰胰RNA酶溶液酶溶液将将RNA酶溶于酶溶于10mmo1/LTrisHCl(pH75)和和15mmo1/LNaCl中，配成中，配成10mg/mL的浓度，于的浓度，于100加热加热15min，缓慢冷却至室温，缓慢冷却至室温，保存于保存于-20。第1

12、3页，讲稿共23张，创作于星期日四、四、实实验验步步骤骤加加加加1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml培养物于培养物于培养物于培养物于EPEPEPEP管，管，管，管，12000g30S12000g30S12000g30S12000g30S 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的200 200 200 200 l l l l 溶液溶液溶液溶液I I I I，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡，剧烈振荡EPEPEPEP管，室温管，室温管，室温管，室温3min3min3min3min 加入加入加入加入300300300300 l l l l 溶液溶液溶液溶液IIIIII

13、II，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴3min3min3min3min 加入加入加入加入400400400400 l l l l 冰冰冰冰溶液溶液溶液溶液IIIIIIIIIIII，温和振荡，温和振荡，温和振荡，温和振荡10s10s10s10s，冰浴，冰浴，冰浴，冰浴5min5min5min5min，12000g12000g12000g12000g5min5min5min5min转移上清到新转移上清到新转移上清到新转移上清到新EPEPEPEP管，加入等体积管，加入等体积管，加入等体积管，加入等体积酚酚酚酚/氯仿氯仿氯仿氯仿(1:1)(1:1)(1:1

14、)(1:1)，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴3min3min3min3min，12000g12000g12000g12000g5min5min5min5min 上层水相转移到新上层水相转移到新上层水相转移到新上层水相转移到新EPEPEPEP管管管管，加入，加入，加入，加入2 2 2 2倍体积倍体积倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇，颠倒混匀，颠倒混匀，颠倒混匀，颠倒混匀，-20 -20 -20 -20 冰箱中放置冰箱中放置冰箱中放置冰箱中放置15min15min15min15min，12000g12000g12000g12000g 10min10min

15、10min10min 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加1ml 1ml 1ml 1ml 70%70%70%70%乙醇乙醇乙醇乙醇，12000g12000g12000g12000g5min 5min 5min 5min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置10min10min10min10min，20 20 20 20 l TE l TE l TE l TE 溶解溶解溶解溶解DNADNADNADNA 第14页，讲稿共23张，创作于星期日一、实验目的一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶

16、电泳检测DNA的的方法和技术。方法和技术。2.琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA第15页，讲稿共23张，创作于星期日DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应电荷效应和和分子筛效分子筛效应应,DNA分子在高于等电点的分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度

17、下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动片段泳动速度不一样，可进行分离。速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。子质量的对数值成反比关系。二、实验原理二、实验原理第16页，讲稿共23张，创作于星期日凝胶电泳不仅可分离凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的不同相对分子质量的DNA，也可以分离也可以分离相对分子质量相同，但构相对分子质量相同，但构型不同的型不同的DNA分子分子。如上次实验提取的

18、质粒如上次实验提取的质粒DNA，有，有3种构型种构型,这这3种构型的质粒种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。分子在凝胶电泳中的迁移率不同。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。因此电泳后呈因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次泳动最快，其次为线状为线状DNA，最慢的为开环质粒，最慢的为开环质粒DNA。第17页，讲稿共23张，创

19、作于星期日三、仪器、材料与试剂三、仪器、材料与试剂(一一)仪器仪器1微波炉微波炉2琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统3移液器移液器4凝胶成像系统凝胶成像系统第18页，讲稿共23张，创作于星期日(二)试剂 1（1）5TBE(50倍体积的倍体积的TBE贮存液）配贮存液）配1000mL5TBETris54g硼酸硼酸27.5g0.5molLEDTA20mLpH8.0或（或（2）50TAE(50倍体积的倍体积的TAE贮存液）贮存液）Tris242g乙酸乙酸57mL0.5molLEDTA100mLpH8.02凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液(6x)3琼脂糖琼脂糖4溴化乙锭溶液溴化乙锭溶液(EB)0.5ugm

20、L第19页，讲稿共23张，创作于星期日四、实验步骤四、实验步骤(一一)、称取、称取0.5g0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50 mL 0.5xT50 mL 0.5xTA AE E缓冲液，缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至60 60 左右时加入少许左右时加入少许EBEB溶溶液，摇匀，则为液，摇匀，则为1 1琼脂糖凝胶液。琼脂糖凝胶液。(二二)胶板的制备胶板的制备 1 1将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。2 2将冷到将冷到6060左右的琼脂糖凝胶液，加入左右的

21、琼脂糖凝胶液，加入EBEB后，缓缓倒入有机玻后，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(不要形成气泡不要形成气泡)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。污染环境。3 3待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。4 4加入电泳缓冲液至电泳槽中。加入电泳缓冲液至电泳槽中。第20页，讲稿共23张，创作于星期日(三三)加样加样用移液枪将已加入上样缓冲液的用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入样品加入加样孔加样孔(记录点样

22、顺序及点样量记录点样顺序及点样量)。(四四)电泳电泳1 1接通电泳槽与电泳仪的电源接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，注意正负极，注意正负极，注意正负极，DNADNA片段从负极向正极移动片段从负极向正极移动片段从负极向正极移动片段从负极向正极移动)。DNADNA的迁移速度与电的迁移速度与电的迁移速度与电的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过压成正比，最高电压不超过压成正比，最高电压不超过压成正比，最高电压不超过5V/cm5V/cm。2当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1 12cm2cm处，停处，停处，停处，停止电泳。止电泳。止电泳。止电泳。第21页，讲稿共23张，创作于星期日五、实验结果五、实验结果在紫外灯在紫外灯(360nm或或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带存在处应显出桔红色荧光条带(在在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用紫外线对眼睛有伤害作用)。M 1 第22页，讲稿共23张，创作于星期日感谢大家观看第23页，讲稿共23张，创作于星期日