实验二叶绿体的分离与荧光观察精选PPT.ppt

《实验二叶绿体的分离与荧光观察精选PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验二叶绿体的分离与荧光观察精选PPT.ppt（23页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于实验二叶绿体的分离与荧关于实验二叶绿体的分离与荧光观察光观察第1页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验实验目的实验目的v1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。器分离的一般原理和方法。v2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。熟悉荧光显微镜的使用方法。第2页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验实验原理实验原理细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离细胞组分的分离在等渗溶液中进行

2、组织匀浆、分离在等渗溶液中进行组织匀浆、分离叶绿体的分离采用叶绿体的分离采用差速离心差速离心或密度梯度离心法进行或密度梯度离心法进行利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生（次生/诱发荧光）诱发荧光）第3页，讲稿共23张，创作于星期日常用的细胞破碎方法常用的细胞破碎方法方法技术 原理效果成本举例机械法匀浆法细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎适中适中动植物组织或细胞研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜植物组织超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎剧烈昂贵细胞悬浮液小规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞大规模处理化学法渗透

3、冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破坏酶消化法细胞壁或细胞膜被消化，使细胞破碎温和昂贵动植物细胞增溶法表面活性剂溶解细胞膜温和适中破碎大肠杆菌脂溶法有机溶剂溶解细胞壁适中便宜甲苯破碎酵母细胞碱处理法碱的皂化作用使细胞壁溶解剧烈便宜破碎大肠杆菌第4页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验离心分离技术离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。分离各种细胞组分的方法主要有：分离各种

4、细胞组分的方法主要有：差速离心差速离心 密度梯度离心密度梯度离心 l速率速率-区带梯度离心区带梯度离心 l等密度离心等密度离心第5页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，

5、达到分离不同大小颗粒的目的。颗粒的目的。差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取用于其他分离手段之前的粗制品提取 第6页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验密度梯度离心密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。场的作用使细胞器分层、分离的方

6、法。这类分离又可分为这类分离又可分为速率速率-区带梯度离心区带梯度离心和和等密度梯度离心等密度梯度离心两种。两种。优点是一次离心可优点是一次离心可分离提纯样品中几种分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。组份，用于较精细的分离。第7页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验速率速率-区带梯度离心区带梯度离心和和等密度梯度离心等密度梯度离心原理：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同沉降速度的不同，通过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法。A、速率、速率-区带梯度离心流程图区带梯度离心流程图B、等密度梯度离心流程图、等密度梯度离心流程

7、图原理：根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着浮力密度差浮力密度差，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。第8页，讲稿共23张，创作于星期日两种密度梯度离心方法的异同两种密度梯度离心方法的异同 特 点速率-区带梯度离心等密度离心分离方法的主要依据主要依赖分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同沉降速度的不同依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的 介质密度梯度选择 最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高 离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离

8、颗粒分辨率范围沉降系数相差20%的物质 颗粒密度差异大于1%离心后区带形成位置易变(样品易扩散）不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因素离心时间（过长或过短都不利）颗粒样品密度一般操作方法介质梯度应预先形成，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心后形成区带。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用介质蔗糖、甘油蔗糖、甘油、CsCl、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。第9页，讲稿共23张，创作于星期日表表1:各种亚细胞构造在各种亚细胞构造在不同的离心介质不同的离心介质中分离所需的中分离所需的离心力与时间离心力

9、与时间 结结 构构 差速离心差速离心(在在0.25M0.25M蔗糖溶液中蔗糖溶液中)速率速率-区带梯度离心区带梯度离心(5(5 50%蔗糖蔗糖)等密度离心等密度离心(其他介质其他介质,如如CsClCsCl等等)细胞核800-1000g 10min500g 10min4000g 60min 线粒体10,000g20min5000g 10min80000g100min 溶酶体10,000g20min5000g 10min80000g100min质膜(大片)100,000g15min100,000g100min 150,000g600min内质网片段150,000g40min1000g20min10

10、0,000g200min微粒体100,000g60min10,000g30min100,000g360min小颗粒100,000g60min第10页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验各种细胞器、大分子和病毒的各种细胞器、大分子和病毒的密度密度及相应的及相应的沉降系数沉降系数图图:各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数沉降系数 根据1924年Svedberg（离心法创始人-瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为120010-13秒范围，10-13这个因子叫

11、做沉降单位S,即1S=10-13秒看图思考：看图思考：要将细胞匀浆液中要将细胞匀浆液中的得到更纯的分离，选用哪种离的得到更纯的分离，选用哪种离心方法较好？心方法较好？(线粒体线粒体:1.18g/ml、溶酶体、溶酶体:1.12g/ml、微体微体:1.23g/ml)第11页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验离心力与离心机转速转换公式：离心力与离心机转速转换公式：图图2:离心力与离心机转数的转换列线图离心力与离心机转数的转换列线图RCF1.11810-5r(n)(g)式中式中,RCF表示相对离心力表示相对离心力,单位是重力加速度单位是重力加速度g（980厘米厘米/秒秒2）,(g

12、)表示表示重力加速度的倍数重力加速度的倍数,r 为离心转子为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；单位为厘米；n为转子每分钟的转数（为转子每分钟的转数（rpm）。）。为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在此公式的基础上制作了离心力的列线图。见图2.先在离心机半径标尺上取已知的离心半径和在转速标尺上取已知的转速，然后在这两点间取一条直线，与中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的相对离心力数值，也是文献中常用的g。r=8cmn=15,000rpmRCF20,000g第12页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞

13、生物学实验荧光荧光荧光显微镜观察荧光现象：荧光显微镜观察荧光现象：某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为种光就称为荧光荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光,称为称为自发荧光自发荧光。如叶绿素的火红色荧光。如叶绿素的

14、火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，称为也能发出荧光，称为间接荧光间接荧光。如叶绿体吸附吖啶橙后。如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。可发橘红色荧光。第13页，讲稿共23张，创作于星期日1.两组光源:透射照明光源(卤素灯)；荧光光源(超高压直流汞灯或氙灯)；2.有特殊的滤光片:激发滤激发滤激发滤激发滤色片和阻断滤片色片和阻断滤片色片和阻断滤片色片和阻断滤片3.激发光波长：较短，因此，分辨力高于普通显微镜；4.荧光光源荧光光源照明方式：通常为落射式。紫外光(UV)：激发光谱区域：330-400nm;紫光(V)：

15、激发光谱区域：395-415nm;蓝光(B)：激发光谱区域：420-485nm;绿光(G)：激发光谱区域：460-550nm；荧光显微镜的荧光显微镜的 特点：特点：图：落射式荧光显微镜的光路图：落射式荧光显微镜的光路第14页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验荧光染料荧光染料:吖啶橙吖啶橙(acridine orange)吖啶橙是一种与吖啶橙是一种与DNA和和RNA都能结合的荧光染料都能结合的荧光染料在在紫外光或蓝光紫外光或蓝光(330485nm)激发下，激发下，DNA可被激发出可被激发出530nm的荧光发射峰的荧光发射峰(细胞核发细胞核发亮亮绿色荧光绿色荧光)，RNA可被

16、激发出可被激发出640nm的荧光发射峰的荧光发射峰(核仁和胞质核仁和胞质RNA发发桔红色荧光桔红色荧光)。产生两种不同荧光是由于产生两种不同荧光是由于吖啶橙吖啶橙与双链与双链DNA 和单链和单链DNA或或RNA的的结合方式和结合量不同结合方式和结合量不同而决定的。而决定的。DNA是高度聚合是高度聚合物，它与物，它与DNA结合是潜入双链之间，结合量相对少；而结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链与单链DNA或或RNA的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。结合量相对多些。我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附我们推测，叶绿体的次生

17、荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的作用，极少部分来自叶绿体中的RNA.RNA.第15页，讲稿共23张，创作于星期日加入吖啶橙后叶绿体的加入吖啶橙后叶绿体的自发荧光自发荧光（火红色）消失了（火红色）消失了？原因：是荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种原因：是荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种芳香杂环阳离子型染料，可透过细胞膜，因此而推测吖染料，可透过细胞膜，因此而推测吖啶橙啶橙阳离子是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分子的结构或所处的化学环境使子的结构或所处的化学环境使自发荧光淬灭自发荧光淬灭的。的。荧光淬灭荧光淬灭：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等

18、物质会使溶液的：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使溶液的吸光度下降而荧光强度变小的现象。吸光度下降而荧光强度变小的现象。荧光淬灭现象产生原因荧光淬灭现象产生原因：分子结构和化学环境是影响物质发射荧光：分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素（和荧光强度的重要因素（pH、温度、光、淬灭剂）.第16页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验 实验用品实验用品材料材料：菠菜叶片菠菜叶片试剂试剂：蒸馏水，蒸馏水，0.35mol/L0.35mol/L氯化钠溶液，氯化钠溶液，0.01%0.01%吖啶橙吖啶橙(AO)(AO)仪仪器器：普通离心机，：普通离心机，组织捣组织

19、捣碎机，天平，碎机，天平，荧荧光光显显微微镜镜，显显微微镜镜，镊镊子，培养皿，子，培养皿，纸纸，移液管，滴管，移液管，滴管，烧烧杯，无杯，无荧荧光光载载片，片，盖玻片，离心管盖玻片，离心管,吸水纸等吸水纸等配制方法：配制方法：称取称取0.1g0.1g吖啶橙加蒸馏水吖啶橙加蒸馏水100ml100ml做干液，放冰箱备用，做干液，放冰箱备用，临用前取临用前取1ml1ml干液加干液加1/15mol/L1/15mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH4.8pH4.8）9ml9ml。第17页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验菠菜叶片菠菜叶片(去叶脉去叶脉)3g 0.35mol/L氯化钠

20、氯化钠15ml研磨研磨(冰浴冰浴)匀浆过滤匀浆过滤(2层尼龙网层尼龙网)滤液在滤液在1000rpm离心离心2min弃沉淀，上弃沉淀，上清液清液3000rpm离心离心5min 去上清液去上清液沉淀为叶绿体沉淀为叶绿体(混有部分混有部分细胞核细胞核)，用，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮氯化钠溶液悬浮 滴片观察滴片观察取叶绿体悬液取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构镜观察叶绿体的形态结构和和荧光显微镜观察自发荧光荧光显微镜观察自发荧光将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加

21、再滴加1 1滴滴0.01%0.01%吖啶橙荧光吖啶橙荧光染料染料，盖上无荧光的盖玻片，盖上无荧光的盖玻片,使用使用荧光显微镜荧光显微镜观察观察间接荧光间接荧光 取叶表皮临时装片荧光染色观察取叶表皮临时装片荧光染色观察 实验步骤实验步骤第18页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验实验结果实验结果普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。荧光显微镜下，选用荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光，叶绿体自发荧光为火红

22、色，间接荧光为桔红色。细胞核呈黄绿色。为火红色，间接荧光为桔红色。细胞核呈黄绿色。图：图：叶绿体自发荧光为火红色叶绿体自发荧光为火红色第19页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验第20页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验叶绿体的分离应在等渗溶液叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L(0.35mol/L氯化钠氯化钠)中进行中进行,以免渗透压以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在分离过程最好在0505的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。察。离心机使用：离心管要平衡离

23、心机使用：离心管要平衡荧光显微镜使用荧光显微镜使用 荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等淬灭剂等在荧光观察时应抓紧时间在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。有必要时立即拍照。在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。汞灯开启后汞灯开启后15min内不要关闭内不要关闭注意事项注意事项第21页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验记录荧记录荧光光显显微微镜镜下下观观察的叶察的叶绿绿体自体自发荧发荧光和光和次生次生荧荧光光现现象，并分析象，并分析结结果，解果，解释释叶叶绿绿体体发发出的自出的自发荧发荧光和次生光和次生荧荧光的作用机理有何不光的作用机理有何不同？同？实验报告实验报告第22页，讲稿共23张，创作于星期日细胞生物学实验细胞生物学实验感谢大家观看第23页，讲稿共23张，创作于星期日