实时定量PCR技术的原理及应用-生命科学前沿-教学课件.ppt

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1、实时定量实时定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR医学和科研中的应用医学和科研中的应用实时定量实时定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团

2、荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时定量实时定量PCR PCR 原理原理 实时原理实时原理 常规常规PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一每一个循环扩增产物

3、量的变化个循环扩增产物量的变化实时定量实时定量PCRPCR原理原理-扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件实时定量实时定量PCR PCR 原理原理 -荧光荧光阈阈值值荧光信号荧光信号阈阈值值 （threshold threshold）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 真正的信号:荧光信号超过域值阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺

4、旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct (2)log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)q 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线

5、性关系标准曲线标准曲线q 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample25非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -DNA -DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记QQR实时荧光定量实时荧光定量PCR P

6、CR 方法方法 1-1-SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 荧光染料嵌合法(SYBR Green I)作用机理示意图实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析温度温度荧光强度荧光强度TmTmTm值：值：DNADNA解链一半时

7、的温度解链一半时的温度SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同利用SYBR Green 法定量检测样品DNASYBR Green SYBR Green 法优缺点法优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点

8、q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2-TaqMan2-TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法工作原法工作原理理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMa

9、nTaqMan法优缺法优缺点点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点以前对PCR引物的选择、PCR试剂的优化经验不足，Probe法较为广用。但是Real Time 将进入SYBR Green I 时代设计合适的引物，使用SYBR Green I将会更加便宜，更为方便，并拥有良好的特异性。讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量P

10、CRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量

11、的标准样品：绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNADNA和体外转入的和体外转入的RNA RNA 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNAcDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀分子量换算成拷贝数，做系列稀释释用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？数据分析分析结果：HBV DNA的精确copy数为3.7X105利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV已肝病人血液中HBV的绝对定量q目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据q方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测q设置对照：浓度为106、105、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照q实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序q结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数利用利用TaqManTaqMan法法 检测血液中的检测血液中的HBVHBV