抗药性突变株分离.ppt

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1、抗药性突变株的分离抗药性突变株的分离u目的要求u基本原理u器材u操作步骤 学习用梯度平板法分离抗药性突变株一、目的要求二、基本原理基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中戚下来，抗药性突变就是一个例子。微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性空变的细胞会在平板上长成菌落。将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以等到所需要的抗药性菌株。抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握

2、分离抗药性突变株的方法是十分必要的。1)基因突变：基因突变：是微生物是微生物DNA分子的某一特分子的某一特定位置的特定结构改变所致，导致细菌发生定位置的特定结构改变所致，导致细菌发生不同的生理、生化变化不同的生理、生化变化,与药物的存在无关。与药物的存在无关。微生物产生抗药性的原因微生物产生抗药性的原因 2)耐药性基因转移耐药性基因转移:耐药质粒耐药质粒,转座子转座子,NDM-1(金金属属-内酰胺酶内酰胺酶):对对-内酰胺类抗生素（青霉素类抗生素内酰胺类抗生素（青霉素类抗生素和头孢菌素）、大环内酯类抗生素（红霉素、罗红霉素、和头孢菌素）、大环内酯类抗生素（红霉素、罗红霉素、阿奇霉素等）、氨基糖

3、苷类抗生素（庆大霉素、链霉素阿奇霉素等）、氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、链霉素等）、四环素类抗生素（四环素、强力霉素、金霉素等，等）、四环素类抗生素（四环素、强力霉素、金霉素等，替加环素除外）、喹诺酮类抗菌药（环丙沙星、司帕沙替加环素除外）、喹诺酮类抗菌药（环丙沙星、司帕沙星等）、磺胺类药、利福平等这些常用抗生素有极强的星等）、磺胺类药、利福平等这些常用抗生素有极强的耐药性耐药性 .抗生素诱导的微生物抗药性产生抗生素诱导的微生物抗药性产生l 获得性耐药性获得性耐药性：是指以前敏感细菌，接触抗是指以前敏感细菌，接触抗生素后生素后,由于遗传基因的变化、生存代谢途径的改由于遗传基因的变化、生存代谢途径

4、的改变而产生的耐药性。变而产生的耐药性。为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变菌株常用性突变菌株常用梯度平板法梯度平板法。不含药物含药物抗药菌株梯度平板法筛选抗药菌株l本实验拟用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板，如右图：三、器材1.菌株 大肠杆菌：Strs2.培养基 LB液体培养基,10mlLB琼脂培养基，试管2支3.溶液或试剂 链霉素4.仪器或其他用具 1ml 无菌吸管，盛有70 乙醇的烧杯，玻璃涂棒，水浴锅等。四、操作步骤 1菌种培养（第一次培养）接种大肠杆菌于盛有5mL LB液的试管中，37震荡培养24h。2.梯度平板制作 （1）

5、在热水中溶化LB琼脂培养基。（2）倒10mL已溶化的不含药物的LB于无菌平板，并将平板一端垫起，使培养基在倾斜的位置凝固。不含药物的LB琼脂培养基（3）在已凝固的平板底部高琼脂的一边标上“低”，水平放置，倒入100g/mL链霉素（在培养基温度下降至50 左右加入）的LB琼脂10ml。过夜，以便于抗生素渗透，获得0g/mL至100g/mL链霉素梯度平板。含有链霉素的LB琼脂培养基不含药物的LB琼脂培养基 3.涂布和培养（第二次培养）用1 mL无菌吸管吸取0.2 mL大肠杆菌培养液Strs涂布于梯度平板上。用无菌玻璃棒将菌液涂布到整个平板表面。平板倒置于37培养48h。4.抗性突变菌株分离(第三次培养)选择1-2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高药物浓度的方向划线。平板倒置于37培养48h。