淀粉酶活性测试.pptx

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1、淀粉酶活性测试淀粉酶活性测试淀粉酶活力的测定一、测试原理：淀粉遇碘产生蓝色，可以在一定量的淀粉中加入不同量的淀粉酶制剂，一定时间后，不出现蓝色且酶制剂用量最少的那个试液可以认为刚好将淀粉全部分解，可根据酶制剂的用量、淀粉的用量以及反应时间来计算该淀粉酶的活力。二、仪器与试剂1.仪器恒温水浴锅；比色管(或试管)；温度计。2.淀粉试液分别称取可溶性淀粉50g(精确至0.01g)和食盐5g,用少量蒸馏水分别溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。0.1mol/L的碘液：碘溶液：称取1.3g碘片及3.5g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中，在棕色瓶中保存。酶制剂溶液：称取(精确至0

2、.01g)淀粉酶制剂25g(或吸取25mL)，溶解后移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。三、操作步骤在已编号的10只比色管中分别加人5mL淀粉试液，另取一只比色管，内盛蒸馏水，插入温度计。一起放人恒温水浴锅中保温(BF-7658 酶 60，胰酶40)，当温度恒定在所需温度后，按管号分别加入1.0-1.9mL(间隔为0.1mL)配制好的酶制剂溶液，计时保温60min。60min后，在每管中加人数滴0.1mol/L碘溶液。记录不呈蓝色且加入酶制剂溶液最少的试管中加入酶制剂溶液的体积V(mL)。四、计算酶活力=mg/(gh)=W15(W2/1000)V1=5000W1W2V式中：

3、wl称取淀粉的质量，g；W2称取酶制剂的质量，g；V不呈蓝色试管中淀粉酶用量最少所加酶制剂溶液的体积，mL。五、说明由于酶制剂的活力变化较大，如完全按上述操作，所加酶制剂溶夜体积可能不一定在测试范围中，因此可以先加大酶制剂溶液体积的间隔，找到一个大致用量，再在其左右用0.1mL的间隔较精确测定使淀粉刚好完全分解时所加入酶制剂溶液的体积。酶活力也可用酶的转化力来表示，即计算每小时每克(或毫升)酶制剂转化淀粉的克数。淀粉酶活力测定一、原理酶作用于淀粉溶液生成还原糖，然后加入费林制剂，在加热的情况下，定量地生成氧化亚铜沉淀。在加入碘化钾和硫酸后，生成游离碘，此时，立即用硫代硫酸钠溶液滴定。二、试剂和

4、溶液 30%碘化钾溶液：碘化钾150g溶解于水350ml中，保存在褐色试剂瓶中，避免阳光直射；25%硫酸溶液：硫酸125g溶于375ml水中；0.05mol/L硫代硫酸钠溶液：将滴定分析用的0.1mol/L硫代硫酸钠500ml用煮沸过的冷却水稀释，所得溶液的中体积为1000ml。配制好后，应进行标定，求出浓度校正系数f值；1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）：将1mol/L乙酸钠溶液加入到1mol/L的乙酸溶液中，调pH到5.0。可溶性淀粉溶液（pH5.0）：将可溶性淀粉（试剂级）在105干燥4h后称量计算含水量。然后，根据可溶性淀粉的含水量称取0.50g（折干）的可溶性淀粉，缓慢加

5、入到沸水50ml中，煮沸5min，用自来水冷却后加入1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）5ml用水定容至100ml。费林试剂-铜溶液：硫酸铜34.66g溶解在水中，定容至500ml-酒石酸钾钠碱溶液：酒石酸钾钠173g和氢氧化钠50g溶解在水中，定容至500ml；-使用前，精确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。三、操作3.1 样品溶液的制备 用水稀释酶样品，使得到酶也的（T0-T30）f1.62值为3mg-6mg葡萄糖量。示例：真菌-淀粉酶：n=50000稀释1ml250ml，再稀释1ml200ml3.2 测定将可溶性淀粉溶液10ml加到100m三角瓶中，置于（400.5）恒温水浴中

6、。预热10-15min,加入样品稀释酶液1ml。准确加热30min后。加入费林试剂4ml使酶失活。将三角烧瓶直接在煤气喷灯（或电炉）上加热2min后，立即放在自来水中冷却。随后，加入30%碘化钾溶液2ml和25%硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定游离出的碘，以蓝色消失作为滴定终点T30（ml）空白对照实验：以水取代酶液。在另一个三角烧瓶中用上述同样的操作步骤测定空白对照值T0(ml)。临近终点时，加入1%可溶性淀粉溶液1-2滴，以蓝色消失作为滴定终点。四、计算在本条件下，反应30min，反应液中产生相当于10mg葡萄糖的还原糖所需的酶量，定义为一个淀粉糖化酶活力单位。淀粉糖

7、化酶活力按下式计算 淀粉糖化酶活力（u/ml）=（T0-T30）f1.621/10n式中：T30-酶反应液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mlT0-空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mlf-0.05mol/l硫代硫酸钠溶液浓度的校正系数1.62-换算系数1/10-该分析方法的常数（相当于10mg葡萄糖的还原糖）n-样品的稀释倍数淀粉酶活力测定一、原理淀粉酶主要包括-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是-淀粉酶和-淀粉酶。-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分-1,4糖苷键，单独使用时

8、最终生成寡聚葡萄糖、-极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。-淀粉酶从非还原端作用于-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的-1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和-极限糊精。-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl-等辅助因子，最适pH偏酸，与-淀粉酶相反，它不耐热但耐酸，70保温15min可使其钝化。通常提取液中-淀粉酶和-淀粉酶同时存在。可以先测定（+）淀粉酶总活力，然后在70加热15min，钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶活力，用总活力减去-淀粉酶活力，就可求出-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨

9、酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。二、仪器、试剂和材料1.仪器1）电子天平；2）研钵；3）容量瓶100mL2个4）具塞刻度试管25Ml15支；5）试管8支6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支7）离心机；8）离心管9）恒温水浴锅；10）分光光度计2.试剂1）1%淀粉溶液；2）0.4mol/L氢氧化钠；3）pH5.6柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，为A液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000m

10、L，为B液。取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸：精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，防止CO2进入。5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。3.材料：萌发3天的小麦芽。三、操作步骤1.酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1次，提取20m

11、in。3000rmin离心l0min，转出上清液备用。2.a-淀粉酶活力测定1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。2）于每管中各加酶液lml，在70士0.5恒温水浴中准确加热15min，钝化-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。3）在对照管中加入4m10.4mol/L氢氧化钠。4）在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。5）将4支试管置另一个40士0.5恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40下预热的1淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。3.淀粉酶总活力测定取酶液5ml，

12、用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后加入稀释之酶液lml。在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠。4支试管中各加1mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。4.麦芽糖的测定1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml，再各加3，5-二硝基水杨酸试剂2.0m1，置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记

13、录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中，各加入2m13,5-二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。五、结果处理（AA0）xVT式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；B为（a+）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Bo为（a+）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）；VU为比色时所用样品液体积（ml）；W为样品重（g）。六、注意事项1）酶反应时间应准确计算。2）试剂加入按规定顺序进行。七、思考题1.淀粉酶活性测定原理是什么？2.酶反应中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40进行保温？3.测定酶活力，应注意什么问题？