奈米生物科技.ppt

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1、奈米生物科技 Nano Biotechnology 姜忠義 成國祥 編著路光予 校訂第三章生物晶片和生物電腦 本章章節l3.1生物晶片l3.1.1概況l3.1.2DNA晶片l3.1.3蛋白質晶片l3.2奈米通道技術l3.2.1溶血素的結構和特性l3.2.2奈米通道技術研究進展l3.2.3奈米通道技術的應用前景l3.3生物分子計算技術和生物電腦l3.3.1生物電腦的特點l3.3.2生物計算研究進展第一節 生物晶片 概況l生物晶片（biochip）l生物晶片和微處理器晶片的不同 l微處理器晶片是由矽、鍺等半導體材料經微電子加工技術製作的積體電路設備l生物晶片只是一種執行生物檢測和分析的微型設備l生

2、物晶片起源l最早起始於20世紀末期 lBains將短的DNA片段固定在支持物上，採用反向分子雜合方式進行序列測定，在設計思路上是對傳統電泳方法的突破l不過由於當時DNA片段的固定採用的是人工印跡方法l一張印跡膜上只能固定數十個DNA片段，測定100多個鹼基對的片段可能需要好幾百個印跡膜，效率十分低生物晶片的誕生l提高效率l提高DNA片段的點陣密度，即需要在同樣大小的支持物上固定更多的DNA片段l借鑑積體電路製造的技術l自然成為超大型雜合測序技術的發展方向l20世紀90年代l光引導合成技術lDNA壓電打印噴印技術l雷射共聚焦顯微掃描技術生物晶片技術l多學科相互整合l微電子學、微機械、電腦、生命科

3、學、化學以及物理學等l推動l胺基酸序列分析、基因表現、蛋白組學、基因組學研究以及基因診斷l構建縮微晶片l透過生物晶片技術、樣品製造方法（如晶片細胞分離技術）以及生化反應方法（如晶片免疫分析和晶片核酸擴增）l引起基因組學的革命生物晶片分類l根據支持介質劃分l根據製造方法劃分l原位合成l光引導聚合法（light-directed synthesis）l噴墨打印合成法（壓電打印法）l合成點樣 l電子晶片l流過式晶片 l根據晶片上的探針劃分l根據晶片的結構和工作原理劃分支持介質劃分l固相介質l玻片、矽片、巨分子凝膠、尼龍膜、微型磁球等l選擇固相介質時，應考慮因素l螢光背景的大小、化學穩定性、結構複雜性

4、、介質對化學修飾作用的反應、介質表面積及其承載能力以及非專一性吸附的程度等l常用的支持介質是玻片l無論是原位合成法還是合成點樣法都可以使用l對該介質的預處理也簡單易行原位合成光引導聚合法llight-directed synthesisl合成前l對介質進行處理l使衍生出羥基或胺基與光敏保護基建立共價連接l合成單體的一端用固相合成法活化，另一端與光敏保護基相連。l合成反應l透過蔽光膜使特定的位點透光，其餘位點不透光l只有受光的位點才能脫掉保護基並與特定單體活化端相連l單體的光敏保護端露出l經過若干上述循環反應後l每個位點按需要合成特定序列的探針l哪些位點上連接哪種單體，由更換不同的蔽光膜來控制原

5、位合成噴墨打印合成法l又叫壓電打印法l原理類似噴墨打印機l透過4個噴印頭將4種鹼基按序列要求依次噴印在晶片的特定位點上合成點樣法l預先合成好的探針用點樣機點到介質上l點樣前需將介質表面包被胺基矽烷或多聚賴胺酸，使之帶上正電荷來吸附核酸分子l其他l聚丙烯醯胺凝膠作為支持介質l將膠塊（40m40m20m，間隔80m；或100m 100m20m，間隔200m）固定在玻璃上l將合成好的不同探針分別加到不同的膠塊上，製成以凝膠塊為陣點的晶片l透過導電的吡咯單體的聚合形成微陣列l原理l在矽片上鍍一層500nm厚的金層，透過蝕刻技術在矽片上形成金微電極l吡咯單體經過聚合在微電極上形成一層聚吡咯膜，其中與吡咯

6、單體相連的探針在吡咯的聚合過程中連到電極上l每種探針的位置透過特定電極的開啟與關閉來控制光纖生物感測微陣列lFerguson利用光纖束建立l每根光纖維（直徑200m）的一端共價連接上寡核苷酸探針l將這些連有不同寡核苷酸探針的光纖維裝配成光纖束，構成光纖微陣列l檢測時只需將光纖束連有不同探針的一端直接浸入靶樣品溶液中即可l產生的螢光雜合信號可透過光纖維傳導至光纖束的另一端l進行檢測l透過螢光顯微電荷偶聯攝影系統對傳導過來的信號電子晶片和流過式晶片 l電子晶片l帶有陽離子的矽晶片l在電場作用下將生物素標記的探針結合在特定的電極上l雜合速度快，可大大縮短分析時間l流過式晶片l需在晶片上製成柵格狀微通

7、道l並將特定的寡核苷酸探針結合於微通道內的特定區域l自待測樣品中分離的DNA經MA螢光標記後流過晶片，固定的寡核苷酸探針捕獲與之相互補的核酸l進行信號檢測分析l特點在於敏感性高、分析速度快、價格低，可反覆使用晶片上的探針劃分l依探針的不同可分：l基因晶片（Genechip,DNA chip,或microarray）l固定的分子是寡核苷酸探針或靶DNAl包括l模式l指將靶DNA固定於支持物上，適合於大量不同靶DNA的分析l模式l模式則是將大量探針分子固定於支持物上，適合於對同一靶DNA進行不同探針序列的分析l蛋白晶片（protein chip）l固定的是胜肽或蛋白晶片的結構和工作原理劃分 l生物

8、晶片可分為l微陣列晶片（microarray chip）l基因的片段、蛋白質、細胞組織l以微點樣技術或其他技術固定在玻片等基片上製作形成l微流體晶片（microfluidic chip）l結合生物技術、微機械l晶片的加工借用l微電子工業l其他加工工業l光學掩模光刻技術、反應離子蝕刻、微注入澆鑄和聚合膜澆鑄法l在玻璃、塑料、矽片等基底材料上加工出用於生物樣品分離或者反應的微米尺寸的微結構l第一代生物晶片微陣列晶片l第二代生物晶片微流體晶片DNA晶片l研究背景l技術原理和特點l技術原理l主要應用方向l基本應用l擴展應用 l問題與展望研究背景 l人類基因組計畫（Human Genome Projec

9、t,HGP）l1986年3月7日由Dulbecco首先提出l1990年10月在美國正式啟動l總目標為l測定人類基因組310bp全序列，鑑定約45萬個人類編碼基因l20世紀80年代初l提出將寡核苷酸分子也集合在晶片上的構想lW.Bains等將短的DNA片段固定在支持物上，透過雜合進行序列分析，做了有益的嘗試l20世紀90年代初l美國的Stephen Fodorl在矽晶片表面塗布一種光敏材料，採用光蝕刻技術，在光引導下原位合成多鏈技術原理和特點lDNA晶片有許多同義詞l基因晶片（gene chip）lDNA微晶片（DNA microchip）lDNA陣列（DNA array）lDNA微陣列（DNA

10、 microarray）l寡核苷酸陣列晶片（oligonucleotide array）lDNA晶片技術l採用寡核苷酸原位合成（in situ synthesis）或顯微打印l將數以萬計的DNA探針片段有序地固定於支持物表面上，產生平面的DNA探針陣列l與標記的樣品進行雜合，透過檢測雜合信號來進行對生物樣品的快速、並行、高效地檢測或診斷l常用矽晶片作為固相支持物l在製造過程中運用了電腦晶片的製造技術l晶片實驗室lBurke等將樣品的分離、PCR擴增及標記等樣品準備工作以及信號檢測過程顯微安排在一塊很小的半導體晶片內部l即所謂的三維DNA晶片DNA晶片形式l主要有兩種形式：l原位合成的DNA晶片

11、（簡稱DNA合成晶片，synthetic genechip）l利用顯微光蝕刻（photolithography）或壓電打印（piezoelectric printing）技術l在晶片的特定部位原位合成寡核苷酸而製成lDNA微陣列或微晶片l透過將選殖基因或PCR擴增出的基因片段有序地顯微打印到矽晶片或普通的玻片表面製成lDNA晶片l大小為1cm左右l上面有幾十萬至上百萬個探針位點（feature）l每個位點含有幾百萬個相同的探針l探針位點的空間解析度為20ml在1.28cm矽晶片上l原位合成的DNA探針陣列集成度可達40萬點陣l顯微打印的DNA微集陣列的集成度可達15萬點陣技術原理lDNA晶片的

12、製造l支持物的選擇與處理 l探針製造及固化 lDNA晶片的操作 l樣品的準備l分子雜合l檢測分析DNA晶片的製造支持物的選擇與處理lDNA合成晶片 l剛性支持物l半導體矽片l普通玻片l合成寡核苷酸前，要使支持物表面衍生出活性團基如羥基或胺基，使這些團基與光敏材料的光敏保護基因形成共價聯結而被保護起來l顯微打印的DNA微集陣列l薄膜型支持物l聚丙烯膜l硝酸纖維素膜l尼龍膜l支持物上通常要包被胺基矽烷（amino silane）或多聚賴胺酸等，使其帶上正電荷以吸附帶負電的DNA探針lRobert Matsonl以聚丙烯膜為支持物，用傳統的亞磷醯胺固相法原位合成探針陣列，也可將DNA顯微打印到玻片上

13、DNA晶片的製造探針製造l探針製造方法：l在晶片上原位合成寡核苷酸l採用兩種技術l美國Affymetrix公司採用的顯微光蝕刻技術顯微光蝕刻技術l美國Incyte 公司等採用的壓電打印法壓電打印法l在晶片上原位合成寡核苷酸探針後，該探針即被有序地固化於支持物上 l晶片以外（off-chip）的探針片段製造lPCR、RT-PCR等方法擴增l分子選殖技術l人工合成DNA片段，在傳統的DNA固相合成儀上可以合成少於100 mer（聚體）的單鏈DNA片段顯微光蝕刻技術顯微光蝕刻技術-1l實際操作過程如下l合成前l支持物經處理後，表面活性團基上連接有光敏保護團基而受到保護l合成時l四個反應步驟l1.選擇

14、合適的光罩（light mask）保護不需聚合的部位l2.需要聚合部位因沒有光罩而在紫外光或可見光等照射下，除去該部位的光敏保護團基l3.活性團基釋放出來，就可以和加入的單核苷酸（如dAMP）的亞磷醯胺活化端發生化學反應，該單核苷酸的另一端用光敏保護團基保護，以便下一位核苷酸的加入l4.更換光欄，在支持物其餘部位分別加上dGMP、dCMP、dTMPl完成第一循環（即第一位核苷酸的合成）l如此循環，直至目的寡核苷酸合成出來為止l優點l合成速度快，步驟少，合成探針陣列量大顯微光蝕刻技術顯微光蝕刻技術-2l如：合成八核苷酸陣列，只需4832步，不到8h，可合成4（65536）個探針l缺陷l合成反應產

15、率較低，不到0.95l探針長度較短，一般28mer（聚體）l且每步去保護不徹底會導致雜合信號比較模糊，背景值較高使信噪比降低l用電子射線和酸作為去保護劑以提高產率及點陣密度壓電打印法壓電打印法l美國Incyte 公司l技術原理l噴墨印表機相似l由打印機將四種鹼基合成試劑分別打印到經包被的支持物的特定區域上，然後沖洗、去保護，進行寡核苷酸合成的下一循環l合成的探針可達4050mer（聚體）l每步產率可達0.99DNA晶片的製造探針固化l透過顯微打印方式l分別固化於晶片上不同區域，製成DNA微陣列l探針可以是：l合成的短寡核苷酸片段l從基因組中製造的、較長的基因片段或cDNAl雙鏈l單鏈的DNA或

16、RNA片段l肽核酸（peptide nucleic acids,PNA，一類DNA類似物，以胺基酸取代糖磷酸主鏈）DNA晶片的操作lDNA晶片操作的基本過程如下：l分離純化的生物樣品先進行擴增、標記l然後與晶片上探針陣列雜合l透過對雜合信號的檢測與分析l得出待測樣品的遺傳資訊l樣品的準備l分子雜合l檢測分析DNA晶片的操作樣品的準備l靈敏度有限l從血液或組織活體中得到的生物樣品（DNA或mRNA）通常要進行高效而專一的擴增l擴增l由聚合酶鏈鎖反應（聚合酶鏈鎖反應（polymerase chain reaction,PCR）完成 聚合酶鏈鎖反應聚合酶鏈鎖反應-1l20世紀80年代中期l在生物體外

17、模擬生物的DNA複製過程的核酸擴增技術l又稱無細胞分子選殖技術l以待擴增的兩條DNA鏈為模板，在一對人工合成的寡核苷酸引子（primer）的介導下，透過耐高溫DNA聚合酶的催化作用l擴增出特定的DNA片段l優點：l有專一、敏感、產率高、快速、簡便、重複性有專一、敏感、產率高、快速、簡便、重複性好、易自動化好、易自動化聚合酶鏈鎖反應聚合酶鏈鎖反應-2l能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷l類似於DNA的天然複製過程l專一性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引子l引子就是與待擴增的引子就是與待擴增的DNA片段兩翼互補的寡核苷酸片段兩

18、翼互補的寡核苷酸l3個基本反應步驟l模板模板DNA的變性的變性模板模板DNA與引子的專一配對與引子的專一配對引引子的延伸子的延伸l每一個步驟的轉換則是透過溫度的改變來控制的l傳統PCR這種線性擴增存在一定缺陷傳統PCR的改良-1lMosaic Technologies公司l固相PCR系統l在靶DNA上設計一對雙向引子，將其排列在丙烯醯胺薄膜上l無整合污染且省去液相處理的繁瑣傳統PCR的改良-2lLynx Therapeutics公司l超大型平行固相選殖（massively parallel solid phase cloning）l對一個樣品中數以萬計的DNA片段同時進行選殖l不必分離和單獨處

19、理每個選殖反應l標記主要採用螢光標記法，也可用生物素、放射性同位素等標記l樣品的標記在其PCR、RT-PCR擴增過程中進行傳統PCR的改良-3l常用螢光色素Cy-3、Cy-4或生物素標記dNTP，後者可用抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin）偶聯的螢光素（fluorescein）或麗絲胺（1assamine）或藻紅蛋白（phycoerythrin）等引導進一步檢測lDNA聚合酶選擇螢光標記的dNTP作為受質，參與引子延伸l這樣新合成的DNA片段（即擴增的靶序列）中摻入了螢光分子l待測樣品和對照可採用雙色螢光標記，如：待測用綠色，對照用紅色DNA晶片的操作分子雜合-1l與DNA晶片上探針

20、陣列進行分子雜合l雜合反應的條件要根據探針的類型和長度以及晶片的應用來選擇l用於基因表現監測，雜合的嚴格性較低、低溫、時間長、鹽濃度高l用於突變檢測，則雜合的嚴格性高、高溫、時間短、鹽濃度低DNA晶片的操作分子雜合-2l晶片上的雜合與常規分子雜合過程不同的是：l前者採用探針固化，樣品螢光標記的方式l後者是固定樣品，標記探針（以放射性標記為主），一次只檢測一到幾個樣品，一般需一天左右時間或甚至更長lDNA晶片將大量探針集合在晶片上，所以一次可以對大量的生物樣品信息進行檢測分析，且雜合過程只需30 minl美國Nanogen公司採用控制電場的方式，使分子雜合速度縮至1min，甚至幾秒鐘DNA晶片的

21、操作分子雜合-3l德國癌症研究院的Jorg Hoheisell肽核酸（PNA）製成探針，試圖解決DNA二級結構干擾雜合的問題lDNA-DNA雜合需要Mg中和鏈內糖磷酸骨架上所帶的負電荷lPNA-DNA雜合不需要鹽，DNA鏈沒有折疊，靶序列片段可以進去lPNA-DNA穩定性高，結合專一性更高DNA晶片的操作檢測分析-1l雜合後，漂洗以除去未雜合分子l攜帶螢光標記的樣品結合在晶片的特定位置上，在雷射的激發下，令螢光標記的DNA片段發射螢光l樣品與探針嚴格配對的雜合分子，其熱力學穩定性較高，所產生的螢光強度最強；不完全雜合（含單個或兩個錯配鹼基）的雙鏈分子的熱力學穩定性低，螢光信號弱（不到前者的1/

22、351/5）DNA晶片的操作檢測分析-2l不能雜合則檢測不到螢光信號或只檢測到晶片上原有的螢光信號（背景值）l螢光強度與樣品中靶分子的含量有一定線性關係l晶片上這些不同位點的螢光信號被雷射共聚焦顯微鏡、雷射掃描儀或落射螢光顯微鏡等檢測到，由電腦記錄下來，然後透過特製的軟件對每個螢光信號的強度進行定量分析、處理l與探針陣列的位點進行比較，就可得到待測樣品的遺傳信息的分析結果l上述螢光檢測法重複性較好l缺點：l靈敏度較低l更靈敏、更快速的檢測方法：l如質譜法、化學發光法，光導纖維法及生物感測器法等擬取代螢光法主要應用方向基本應用-1lDNA晶片的基本應用l對大量的生物樣品l定性分析（即定序）l定量

23、分析（即基因表現的研究）l雜合定序（sequencing by hybridization,SBH）lDNA晶片利用固定的探針與生物樣品的靶序列進行分子雜合產生的雜合圖譜而排列出待測樣品的序列l如：一個12-mer的靶序列與原位合成的八核苷酸陣列65536個探針雜合，發出最強螢光信號的5個探針為TCGGATCG、CGGATCGA、GGATCGAC、GATCGACT、ATCGACTTl將雜合探針根據重疊序列進行排列，即得出靶DNA的互補序列：lTCGGATCGACTT，進而可推導出靶DNA序列主要應用方向基本應用-2lMurk Cheel用含135000個寡核苷酸探針的陣列測定了全長為16.6k

24、b的人類粒腺體基因組序列，準確率達99%l以DNA、cDNA或寡核苷酸為探針製造的DNA晶片，可直接平行檢測大量mRNA的豐度lLockhartl首先用寡核苷酸陣列來監測基因表現l每個細胞中少至幾個拷貝或多至幾個數量級的轉錄產物，均可被定量探測出來l可檢測出外界因素誘導下基因表現量的變化l一般20個探針對足以檢測一個基因的表現，因此一個晶片就可同時檢測大約10000個基因的表現情況lSchena、Shalon、DeRisil分別用cDNA微陣列成功地測定了擬南芥、酵母以及人黑色素瘤細胞株等基因表現的差異性主要應用方向基本應用-3l以DNA、cDNA或寡核苷酸為探針製造的DNA晶片，可直接平行檢

25、測大量mRNA的豐度lLockhartl首先用寡核苷酸陣列來監測基因表現l每個細胞中少至幾個拷貝或多至幾個數量級的轉錄產物，均可被定量探測出來l可檢測出外界因素誘導下基因表現量的變化l一般20個探針對足以檢測一個基因的表現，因此一個晶片就可同時檢測大約10000個基因的表現情況lSchena、Shalon、DeRisil分別用cDNA微陣列成功地測定了擬南芥、酵母以及人黑色素瘤細胞株等基因表現的差異性主要應用方向擴展應用 l擴展到突變檢測、新基因發現、基因差異顯示，多態性檢測、基因組作圖、後基因組研究以及基因診斷等l大致可分為兩個方面：l基因診斷l最具商業價值的應用l基因組研究l加快定序的速度

26、，降低其費用l可用於基因組作圖、新基因發現等擴展應用基因表現量的檢測1 l檢測生物體中不同基因的表現量l基因功能：l透過比較不同個體或物種之間以及同一個體在正常和疾病狀態下基因表現的差異、尋找和發現新的基因、研究發育、遺傳、演化l有助於研究l人類重大疾病如癌症、心血管疾病等相關基因及其相互作用機制l藥物研究方面l透過檢測藥物作用對生物體中基因表現量的影響l研究藥物對基因調控和表現網絡的影響l了解藥物的分子層面的作用機制和藥物對不同生物分子途徑的作用方式擴展應用基因表現量的檢測2l腫癌l相關基因的轉錄和表現量差異很大l便捷地在整個基因組上掃描，確定癌細胞中表現異常的基因l人類急性白血病的分類lG

27、olub等人應用50個cDNA探針組成的基因晶片，透過檢測基因表現的差異進行癌症分類和診斷l在沒有其他輔助診斷結果的情況下，可以區分：l急性髓細胞性白血病（Acute Myelogenous Leukemia,AML）l急性淋巴細胞性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL）擴展應用基因表現量的檢測3l尋找藥物作用點l結合酵母和大腸桿菌的基因組序列信息，透過組織表現差異來這種分析可以進行藥物的高效篩選l針對Cdc28p的活性作用點設計新的化學抑制劑lGray等把基因晶片藥物設計和組合化學集合在一起l檢測在基因組層面上對生物體的影響，獲得兩類化學結構擴展應用基因表

28、現量的檢測4lDuke大學人類基因組中心的Roses教授l鑑定肌萎縮側索硬化病（Lou Gehrig病）的基因l用基因晶片技術l鑑定出一種載脂蛋白E（apoprotein E,apo E）是引起該病的一個主要基因因子l表現型基因晶片的應用l使新藥物發現更為有效、安全和快捷，專一性強，降低製藥廠對新藥物投資的風險擴展應用基因表現量的檢測5lAffymetrix公司l製作一個把所有已知的EST（expressed sequence tag，表現序列標籤）序列製造在一個100萬種探針/cm的高密度基因晶片上l為基因功能的研究和新基因的尋找提供助力l對於診斷標誌物，藥物分子機制和作用，藥物代謝，安全評

29、價（臨床試驗前）等方面提供功能更為完善的分析工具擴展應用基因多樣性與藥物的應用1l人類基因組計畫完成的圖譜僅僅包含了一組特定個體的完整的基因序列。個體與個體之間的基因組DNA有千分之幾的差別l這種差別決定了個體對於疾病的易感性和對於特定藥物的代謝能力的差異l單核苷酸多樣性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）l最重要的DNA分子差異l在不同個體的基因組內之等位基因（allele）特定核苷位置上存在兩種或以上不同的鹼基種類l許多大的製藥公司都在建立人類基因組多資料庫擴展應用基因多樣性與藥物的應用2lSNP計畫首先希望鑑別出已知基因編碼區的SNP（以cSNP表

30、示）l尋找出cSNP對基因功能的影響l中國人基因多樣性的研究也已經啟動l美國FDA的批准並進入市場以前，大部分藥品要進行數以千計病人長達五年甚至更長時間的安全性研究以及臨床的檢驗l美國醫學學會雜誌1998年發表的研究報告l在1994年大約有220萬病人對藥物產生不良反應l基因型與藥物有效性關係是藥物基因組學（pharmacogenomics）l藥物的研究和開發正在從一種藥物適用於所有人的時代，轉變成根據基因組的差異開發出以適用於某一個體或人群的個體化藥物擴展應用基因多樣性與藥物的應用3l檢測個體與藥效關係的基因檢測試劑lACE抑制劑（angiotensin-converting enzymei

31、nhibitor升壓素轉變酵素抑制劑）l高血壓治療中應用較廣的藥物l瑞典的Gemini Gemomocs AB公司開發l一種基因檢測試劑來決定是否採用l美國每年約有2400個兒童和成人死於急性淋巴性白血病lAdverse topurine是一種特效藥l大約有10%15%的兒童對於該種藥物的代謝太快或太慢l代謝太快則正常的劑量就不可能獲得好的療效，而代謝太慢則藥物可能積蓄到致死量，產生過大的毒性l應用一種基於基因檢測的TPMT技術硫嘌呤甲基轉移酵素，thiopurine methyl-transferase（TMPT）活性測定技術l來判斷病人是否可以採用Adverse topurine治療l選擇

32、適合的化療藥物的劑量擴展應用基因多樣性與藥物的應用4lAffymetrix公司l在1999年生產出HuSNP Mapping Assay基因晶片l可以同時檢測覆蓋22條體染色體及X染色體的1500個已知位點SNPslWang等應用凝膠測序法和高密度基因晶片，對2.3Mb人類基因的SNP進行篩查l確定了3241 SNPs位點，其中2227位點用來構建基因圖譜。在此基礎上，發展了一種可以用於同時檢測500人類SNPs的基因晶片，顯示了超大型鑑別人類基因型的可能性lNalushka和范建斌等用高密度晶片在75個非洲和北歐居民的28Mb的基因序列中獲得了1480個等位基因。l對人類基因中SNP的性質、

33、圖像以及頻率進行了系統和全面的掃描，並尋找他們與血壓異常性疾病的關係擴展應用基因多樣性與藥物的應用5l晶片鑑別出874個人類SNPsl22%用DNA定序方法進行確認l檢出SNP的最低平均等位頻率為11%l其中在編碼區的SNPs（coding-region SNPs,cSNPs）有387個l54%會導致蛋白質序列的變化l引起蛋白質變化的SNPs占總的SNPs 38%l檢測這類基因突變將開發出新的基因藥物，透過基因藥物的治療來彌補人類基因組中缺陷擴展應用基因多樣性與藥物的應用6l透過基因晶片可以快速地檢測和確定致病微生物的基因l鑑定l不同亞型l突變株的病毒和細菌l分析和檢測外源性基因組l特別是尋找

34、確認病菌耐藥基因，將有利於幫助人們合理用藥和合理治療，開發新的抗耐藥菌株的新藥擴展應用基因多樣性與藥物的應用7lTroeschl應用基因晶片對具有重要臨床價值的分支桿菌（Mycobacterium包括肺結核菌及非典型分支桿菌）的所有基因型進行檢測l分支桿菌在人體中能引起肺結核l通常用藥物作為第一治療方案l基因晶片可鑑別出抗利福平（rifampin）的分支桿菌種群l用基因晶片從27個不同臨床表現病人的70株分支桿菌中分離出15種抗利福平的菌株l用基因晶片診斷分支桿菌感染以及指導用藥提供有效方法，對於新型的檢測試劑的研製，尋找高效的靶分子以及開發新一代藥物具有重要的價值擴展應用基因診斷 l從正常人

35、的基因組中分離出DNA與DNA晶片雜合就可以得出標準圖譜l比較、分析這兩種圖譜l得出病變的DNA信息lAffymetrix公司lP53基因全長序列和已知突變的探針集合在晶片上，製成P53基因晶片l在癌症早期診斷中發揮鑑識的作用lHellerl構建了96個基因的cDNA微陣列，用於檢測分析類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis,RA）相關的基因，以探討DNA晶片在感染性疾病診斷方面的應用lDrobyshevl用10-mer寡核苷酸微晶片，檢測了-地中海貧血症（-thalathemia）患者紅血球細胞中血紅素-球蛋白基因中的三個突變位點lNanogen公司l致力於開發一些用於傳染

36、病檢測的DNA晶片擴展應用藥物篩選-1l未來藥物篩選時之靶標基因l基因晶片技術能夠進行超大型地篩選工作，在藥物基因之間架起一座橋梁l從基因層面來解釋藥物的作用機制，即可以利用基因晶片分析用藥前後生物體在不同組織、器官基因表現上的差異l進而確認與一病症有關的基因中何者是藥物效應基因擴展應用藥物篩選-2l用mRNA構建cDNA表現基因庫，然後用得到的胜肽資料庫製作肽晶片，則可以從眾多的藥物成分中篩選出起作用的部分物質l用cDNA作為探針的基因晶片，則可進行反義寡核苷酸類藥物的篩選l用RNA與單鏈DNA能形成複雜的空間結構，並能與靶分子相結合的特點，可將核酸資料庫中的RNA或單鏈DNA固定在晶片上，

37、然後與靶蛋白培育，形成蛋白質RNA或蛋白質DNA複合物，可以篩選專一的藥物蛋白或核酸擴展應用藥物篩選-3l在HIV（Human Immunodeficiency Virus，人類免疫不全病毒，愛滋病毒）藥物lJellis用組合化學合成DNA晶片技術篩選654536種硫化磷酸八聚核苷酸，並從中確定了具有XXG4XX樣結構的抑制物l實驗顯示，這種篩選物對HIV感染細胞有明顯阻斷作用l基因晶片技術使得藥物篩選、靶基因鑑別和新藥測試的速度大大提高，成本大大降低擴展應用加速中藥的發展-1 l中藥藥理研究的重大問題l成分複雜l如何篩選出有效中藥l從有效中藥中篩選出有效成分l快速進行中藥毒理學研究l傳統的方

38、法學l對逐個單味藥進行分析，進而對其不同有效成分（單體）進行實驗，其過程複雜l耗時多，投入量大，但產品卻很少擴展應用加速中藥的發展-2l採取高通量基因晶片篩選方法l快速篩選出有效成分l快速完成毒理學實驗l利用電腦分析各種成分間相互作用關係l繪製出中藥複雜成分間相互作用的可能圖譜l從生物整體系統的角度出發，把分子層面的研究和中醫中藥的辯證思維方法結合擴展應用加速中藥的發展-3l中醫藥臨床治療的核心l中醫證l證的本質研究一直難以有重大進展l因為中醫理論涉及生命的整體l因而它牽涉到許多基因和蛋白質l傳統的方法學無法全面弄清證的實質l中醫證候可能是基因組和蛋白組背景的整體反應擴展應用加速中藥的發展-4

39、l理論來看l證候的形成是由先天的體質因素和後天的環境因素共同作用的結果l對證的研究可能要繪製三張圖譜l基因組圖譜（genomic map）l單核苷多樣性（SNP）圖譜（SNP map）l蛋白組學圖譜（proteomic map）擴展應用加速中藥的發展-5l透過比較基因組學技術發現，不同的人種及同一人種的不同個體之間基因組差異僅0.1%、這種差異表現在SNP譜中l這可能是決定人類個體間差異及疾病易感性的最根本因素之一，這也可能是中醫稟賦學說的基因組背景l透過建立人類SNP資料庫，只要將一個人的基因與SNP資料庫進行比較，便能知曉這個人的特徵lSNP的差異l最終體現於蛋白質的表現上，蛋白質是生命體

40、功能的真正執行者，生命體功能狀態也是由蛋白質來決定的l透過SNP資料庫和蛋白質資料庫的對比，有望剖析每個人的先天體質與後天的證候擴展應用加速中藥的發展-6l利用基因和蛋白質晶片技術l對不同個體的證狀態的基因組和蛋白組進行掃描l給出不同證的基因表現譜lSNP譜和蛋白質譜l透過電腦分析來建立證相關譜l可望為從基因分子層面揭示全面證的本質提供可能的分析方法l證本質被揭示，它可能會引起醫學治療學理論的重大革新或變化、尤其是個體化治療理論會出現飛躍性的發展，也會使中醫辨證論治理論得到全面的檢驗和應用l同時證基因譜和蛋白質譜的揭示，會指導臨床的診斷和治療擴展應用加速中藥的發展-7l未來人類每個人自出生後便

41、擁有三張圖譜：l基因組譜lSNP譜l蛋白質譜l根據這些圖譜便可以預測其將來對某些疾病的易感性，而且一旦發病，也可根據當時的基因和蛋白質進行針對性的處方用藥擴展應用在環境科學領域中的應用-1 l基因晶片技術在環境科學領域具有廣闊的應用前景l首先是環境污染物的檢測、監測與評估：l環境污染物主要包括l有機化學性污染物l無機污染物l微生物及毒素l可以用基因晶片檢測某些特定的代謝過程，鑑定環境中的不同微生物菌群l應用能與rRNA互補的專一性DNA探針建立微生物菌群分類的框架擴展應用在環境科學領域中的應用-2l可以利用生物晶片技術研究環境污染物對人體健康的影響：l環境污染物致癌機制研究l環境污染物對人體敏

42、感基因的作用研究l生物晶片技術l在環境污染物的分布與轉移研究l環境污染物治理效果評估l環境修復微生物的篩選l改造等領域發揮作用l毒理晶片（tox chip）l已成為環境毒理學研究的焦點ltox chip可幫助預防因環境暴露引起的疾病l用於新藥的臨床試驗甚至建議合適的治療劑量擴展應用生物戰劑和化學戰劑偵檢中的應用-1 l生物戰劑（biological weapon）與化學戰劑（chemical weapon）l偵檢是一項很複雜而又十分重要的工作l目前很難對所有的生物與化學戰劑進行快速而準確的檢測l採用生物晶片技術卻可以較容易地完成這一艱巨任務擴展應用生物戰劑和化學戰劑偵檢中的應用-2l我們可以用

43、基因晶片技術來檢測生物戰劑：l細菌及其毒素l真菌毒素l病毒l支原體l衣原體l立克次氏體l利用免疫晶片或酶晶片檢測各種蛋白毒素類生物戰劑和偵檢化學戰劑l軍工部門在積極研製用於生物戰劑與化學戰劑偵檢的生物晶片問題與展望-1l問題：l硬體lDNA晶片技術需要昂貴的尖端儀器l生產原位合成晶片需要光刻機器（lithography machine）l寡核苷酸合成儀（oligonucleotide synthesizer）l檢測晶片則要雷射共聚焦顯微鏡、落射螢光顯微鏡等設備l如Affymetrix的一套系統（包括流體站fludic station、掃描儀、軟體）問題與展望-2l軟體l即技術l首先，探針製造的

44、環節上，原位合成寡核苷酸技術複雜，且有專利保護，合成過程中可能摻入錯誤核苷酸及混入雜質，降低了專一性和信噪比l顯微打印技術較靈活易操作，但需收集或合成大量探針，且陣列的集成度不高l其次，在樣品和晶片雜合的環節上，因為雜合在固相上進行，空間因素會對雜合造成不利影響問題與展望-3l在一個晶片上存在多種探針，這對雜合條件是個挑戰，因為這種探針的最適條件未必適合另一種探針l複雜的探針l如長寡核苷酸容易自身形成二、三級結構l影響與靶序列的雜合或給出錯誤的陰性信號l當然在其他技術環節上也存在著一些難題l如樣品準備複雜、檢測的靈敏度低等等問題與展望-4l晶片上探針位點的空間解析度將達到1m水準，人體所有約4

45、6萬個基因有望集成在一塊1cm的晶片上lDNA晶片不僅可用於基因診斷和基因組研究等方面l藥物研究l人口健康普查l優生保健l法醫學等領域l農業、工業l食品、環境監測方面蛋白質晶片l又稱蛋白質微陣列l從研究對象和研究方法上大體可分：l受體配體檢測晶片l免疫晶片l多種感染因素篩選和腫瘤等疾病診斷的晶片l把製造好的蛋白質樣品固定於經化學修飾的玻片、矽片等載體上，蛋白質與載體表面結合，同時仍保留蛋白質的物化性質和生物活性l蛋白質組（proteome）研究的重要手段蛋白質晶片的類型與製造l特殊性質決定l蛋白質晶片lDNA晶片l蛋白質無法利用擴增方法提高拷貝數以達到檢測靈敏度的要求l蛋白質間的專一性作用是抗

46、原抗體反應或受體配體的反應，不僅僅決定於序列的特異性，還取決於其結構的專一性l蛋白質比DNA合成的難度大，並且把它們固定在載體上容易引起空間結構的改變而導致蛋白質變性。l直接點樣法l蛋白質或酶等樣品，透過自動點樣裝置分布於經過處理的玻片或其他材料上l可以分為兩種形式：l無活性的晶片l將已經合成好的蛋白質點在晶片上l活性的晶片l在晶片上點上生物體（如細菌），在晶片上原位表現蛋白質l提供模擬的有機體環境，對於蛋白質功能分析更為有利蛋白質晶片形式l可以分為兩種形式：l無活性的晶片l將已經合成好的蛋白質點在晶片上l活性的晶片l在晶片上點上生物體（如細菌），在晶片上原位表現蛋白質l提供模擬的有機體環境，

47、對於蛋白質功能分析更為有利無活性的蛋白質晶片製作方式無活性的蛋白質晶片製作方式l主要分3類：l原位合成原位合成 l點合成點合成l光蝕刻術光蝕刻術 原位合成原位合成lH.M.Geysenl採用螢光甲氧碳基胺基酸保護策略l由C端向N端，共合成了208個六排列在直徑為4mm的聚乙烯膜上l研究一個由213個胺基酸組成的蛋白質的結構活性域點合成點合成lA.Kramerl在纖維素膜上合成多肽資料庫l纖維素膜上有豐富的羥基l對於多肽的合成十分有利光蝕刻術光蝕刻術lS.P.A.Fodorl固相合成的多肽晶片密度為每平方厘米25萬點l多肽的平均長度為5肽，並透過了抗體檢測活性的蛋白質晶片lP.Uetzl利用酵母

48、細胞構建了第一個基因組規模l用來篩選蛋白質與蛋白質之間的相互作用l包含了約6千個酵母選殖株l每個選殖株所表現的蛋白質，其編碼開放閱讀框架（opening read frame,ORF）與Gal-4活化域相連l在晶片上進行l酵母雙雜合反應（yeast two-hybrid reaction）lDNA蛋白質lRNA蛋白質間的交互反應l檢測192種蛋白質l得到了281種蛋白質蛋白質間交互作用關係l透過將細胞裂解液蛋白成分做成晶片，科學家很快就可以查明某一開放閱讀框架（ORF）是否表現一種分泌蛋白抑或是一種胞內酶l在晶片上進行活細胞的遺傳性狀篩選蛋白質晶片的種類l可分為：l蛋白質微陣列蛋白質微陣列 l

49、微孔板蛋白質晶片微孔板蛋白質晶片 l立體凝膠塊晶片立體凝膠塊晶片l晶片實驗室（晶片實驗室（lab-on-chip）蛋白質微陣列蛋白質微陣列-1lMacBeath和Schreiberl透過點樣機械裝置製作蛋白質晶片的研究l將針尖浸入裝有純化的蛋白質溶液的微孔中，然後移至載玻片上，在載玻片表面點上1nL左右體積的溶液，然後機械手將針尖洗滌、乾燥l利用此裝置，在半個載玻片大小的玻璃基片表面固定了10000種蛋白質l研究蛋白質與蛋白質間、蛋白質與小分子間的專一性相互作用l關鍵在於保證被點在玻片上的蛋白質分子不失活而又能牢固地固定在基片表面蛋白質微陣列蛋白質微陣列-2l用一層小牛血清白蛋白（BSA）修飾

50、玻片l玻片表面就形成了一個親水的環境，可以防止固定在表面上的蛋白質變性l賴胺酸廣泛存在於蛋白質的鏈中lBSA中的賴胺酸透過活性劑與點樣的蛋白質樣品所含的賴胺酸發生反應，使其結合在基片表面l一些蛋白質分子的化學活性區域露出l用點樣裝置將蛋白質固定在BSA表面上微孔板蛋白質晶片微孔板蛋白質晶片-1l微滴定板廣泛應用於免疫學測定l陣列密度較低l檢測時需要耗費大量的試劑微孔板蛋白質晶片微孔板蛋白質晶片-2l蛋白質晶片模型l德國GeSim GmbH和美國普林斯頓Orchid生物計算公司l研製了毫微多孔式晶片（1001000nL/孔）lMendozal研製的晶片仍然採用了96孔板l每個孔的底部製造成微陣列