病毒学病毒的检验精选课件.ppt

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1、关于病毒学病毒的检关于病毒学病毒的检验验第一页，本课件共有105页常用的病毒检验方法包括：常用的病毒检验方法包括：一、病毒的分离鉴定一、病毒的分离鉴定二、病毒感染性的检测二、病毒感染性的检测三、病毒颗粒检测三、病毒颗粒检测四、病毒的血清学检查四、病毒的血清学检查五、病毒的分子五、病毒的分子(蛋白和核酸蛋白和核酸)检测检测第二页，本课件共有105页一、病毒的分离鉴定一、病毒的分离鉴定n病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直接可为病毒感染提供最为直接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学研究提的病原学证据，同时可为进一步的病毒学研究提供材料。供材料。n病毒的分离和鉴定（含义）病毒的分

2、离和鉴定（含义）：指从病人、带毒：指从病人、带毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理者、外界环境中采集标本经过适当的处理,采采用一系列物理、化学、生物学等手段用一系列物理、化学、生物学等手段,将病毒从将病毒从标本中分离出来标本中分离出来,并通过有关特异性方法鉴定并通过有关特异性方法鉴定属于何种病毒属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离与鉴定。这一方法称为病毒的分离与鉴定。这一方法称为病毒的分离与鉴定。这一方法称为病毒的分离与鉴定。第三页，本课件共有105页病毒的分离与鉴定包括：病毒的分离与鉴定包括：n1、病毒材料的采集与准备、病毒材料的采集与准备 2、病毒的、病毒的分离与培养分离与培养3、病毒的

3、形态学观察、病毒的形态学观察4、病毒的理化特性测定病毒的理化特性测定5、病毒的血清学、病毒的血清学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本过鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本过程。程。第四页，本课件共有105页（一）标本的采取与送检（一）标本的采取与送检n n病料采集适当与否病料采集适当与否病料采集适当与否病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。直接影响病毒的检测结果。n n一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等粪便等粪便等粪便等,主要因动物及病毒的种类而异主

4、要因动物及病毒的种类而异主要因动物及病毒的种类而异主要因动物及病毒的种类而异,n例如检测犬细小病毒或轮状病毒例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻幼一般应采腹泻幼犬或犊牛的粪便犬或犊牛的粪便;n怀疑为口蹄疫的猪或牛怀疑为口蹄疫的猪或牛,则应采其水疱液及水疱皮则应采其水疱液及水疱皮送检。送检。第五页，本课件共有105页应注意下列原则：n1.对本身带有杂菌对本身带有杂菌对本身带有杂菌对本身带有杂菌 (如咽喉拭子、粪便如咽喉拭子、粪便)或易受污或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生抗生素素。n2.因病毒在室温中易失去活性，标本应因病毒在室温中易失

5、去活性，标本应因病毒在室温中易失去活性，标本应因病毒在室温中易失去活性，标本应低温低温低温低温保存并保存并保存并保存并尽快送检。尽快送检。尽快送检。尽快送检。n n3.3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后23w内各取内各取1份血清，以便份血清，以便对比对比对比对比双份血清抗体双份血清抗体效价的动态变化。效价的动态变化。第六页，本课件共有105页标本处理：标本处理：n n采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适当的处都需要做适当的处都需要做适当的

6、处都需要做适当的处理理理理,以保证病毒分离的成功几率。以保证病毒分离的成功几率。以保证病毒分离的成功几率。以保证病毒分离的成功几率。n n采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等结等结等结等,可取一小块进行可取一小块进行可取一小块进行可取一小块进行充分研磨充分研磨充分研磨充分研磨,加入含青、链霉素的加入含青、链霉素的加入含青、链霉素的加入含青、链霉素的HanksHanks液液液液,离心取上清液作为接种物离心取上清液作为接种物离心取上清液作为接种物离

7、心取上清液作为接种物;n n鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入高浓度应加入高浓度应加入高浓度应加入高浓度的的的的抗生素抗生素抗生素抗生素,充分混匀后充分混匀后充分混匀后充分混匀后,置置置置4 4冰箱内处理冰箱内处理冰箱内处理冰箱内处理24h24h或过夜或过夜或过夜或过夜,离心离心离心离心后取上清做接种用后取上清做接种用后取上清做接种用后取上清做接种用;n n咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有咽喉拭

8、子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%2%小牛血清小牛血清小牛血清小牛血清和一定浓度的青、链霉素的和一定浓度的青、链霉素的和一定浓度的青、链霉素的和一定浓度的青、链霉素的HanksHanks液中液中液中液中,充分刷洗充分刷洗充分刷洗充分刷洗棉拭棉拭棉拭棉拭子子子子,反复冻融反复冻融反复冻融反复冻融3535次次次次,离心后取上清液作为接种材料。离心后取上清液作为接种材料。离心后取上清液作为接种材料。离心后取上清液作为接种材料。第七页，本课件共有105页（二）病毒的分离与培养（二）病毒的分离与培养n n细胞培养、鸡胚和实验动物细胞培养、鸡胚和实验动物细胞培养、鸡胚和实验动物细胞培养、鸡胚和实验动物可用

9、于病毒的分离与培养可用于病毒的分离与培养可用于病毒的分离与培养可用于病毒的分离与培养,其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。n n用于病毒分离与培养的细胞有用于病毒分离与培养的细胞有用于病毒分离与培养的细胞有用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞株和原代细胞、二倍体细胞株和原代细胞、二倍体细胞株和原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系传代细胞系传代细胞系传代细胞系,一般说来一般说来一般说来一般说来,本动物的原代细胞最为敏感本动物的原代细胞最为敏感

10、本动物的原代细胞最为敏感本动物的原代细胞最为敏感,但不如但不如但不如但不如传代细胞方便易得传代细胞方便易得传代细胞方便易得传代细胞方便易得.n n例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或二倍体细胞二倍体细胞二倍体细胞二倍体细胞,但该细胞生长缓慢但该细胞生长缓慢但该细胞生长缓慢但该细胞生长缓慢,通常用通常用通常用通常用PD5(PD5(猪甲状腺细胞猪甲状腺细胞猪甲状腺细胞猪甲状腺细胞系系系系)取代。取代。取代。取代。n n培养方法常用的有培

11、养方法常用的有培养方法常用的有培养方法常用的有静置培养和旋转培养静置培养和旋转培养静置培养和旋转培养静置培养和旋转培养,有的病毒如轮状有的病毒如轮状有的病毒如轮状有的病毒如轮状病毒病毒病毒病毒,初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。第八页，本课件共有105页1、病毒的分离、病毒的分离n不同的病毒分离时采用不同的分离方法不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要这主要取决于目的取决于目的病毒的生物学特性病毒的生物学特性病毒的生物学特性病毒的生物学特性。n主要有主要有细胞培养法

12、、鸡胚接种法、动物接种法细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法等等,而对细胞、鸡胚不敏感而对细胞、鸡胚不敏感而对细胞、鸡胚不敏感而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型又没有合适动物模型的病毒的病毒,可采用可采用基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆的方法。的方法。第九页，本课件共有105页（1）动物接种法）动物接种法n 是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。痘病毒可接种于家兔角膜或皮内

13、。n动物的接种途径要根据动物的接种途径要根据病毒种类病毒种类、实验动物种实验动物种类类、接种材料接种材料等选择合适的接种途径。动物接等选择合适的接种途径。动物接种途径的选择正确与否对提高病毒分离成功种途径的选择正确与否对提高病毒分离成功率也起到重要作用。率也起到重要作用。第十页，本课件共有105页常见病毒常用实验动物及接种途径P37P37第十一页，本课件共有105页n n在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特异性抗体。异性抗体。异性抗体。异性

14、抗体。n n实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。n n致死性采血致死性采血致死性采血致死性采血是指尽量采集动物血是指尽量采集动物血是指尽量采集动物血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。直至动物死亡。直至动物死亡。直至动物死亡。n n非致死性采血非致死性采血非致死性采血非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。n n对采血动物对采血

15、动物对采血动物对采血动物,应在禁食应在禁食应在禁食应在禁食24h24h后采血。采血应无菌操作。后采血。采血应无菌操作。后采血。采血应无菌操作。后采血。采血应无菌操作。n n不同动物采用不同的采血方法。常用的有不同动物采用不同的采血方法。常用的有不同动物采用不同的采血方法。常用的有不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏心脏心脏心脏采血法、采血法、采血法、采血法、眼眶眼眶眼眶眼眶采采采采血法、血法、血法、血法、颈静脉颈静脉颈静脉颈静脉采血法、采血法、采血法、采血法、颈动脉颈动脉颈动脉颈动脉采血法、采血法、采血法、采血法、耳静脉耳静脉耳静脉耳静脉采血法等。根采血法等。根采血法等。根采血法等。根据实

16、验动物和实验条件灵活选用。据实验动物和实验条件灵活选用。据实验动物和实验条件灵活选用。据实验动物和实验条件灵活选用。实验动物采血第十二页，本课件共有105页n n鸡胚对多种病毒敏感。鸡胚对多种病毒敏感。鸡胚对多种病毒敏感。鸡胚对多种病毒敏感。n n不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成功的关键。因此选择适当的接种途径是病毒分离成功的关键。n一般采用孵化一般采用孵化914天的鸡胚，根据病毒种类不天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本

17、同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵黄囊黄囊黄囊黄囊和和羊膜腔羊膜腔等。等。等。等。（2）鸡胚培养法）鸡胚培养法第十三页，本课件共有105页n是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。的基本方法。（3）细胞培养）细胞培养(cell culture)法或组法或组织培养法织培养法 (tissue culture)第十四页

18、，本课件共有105页n n一般选择一般选择一般选择一般选择生长旺盛生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离。的敏感细胞用于病毒分离。n n少数病毒例外少数病毒例外少数病毒例外少数病毒例外,例如犬、猪等的细小病毒例如犬、猪等的细小病毒,病毒的病毒的复制有赖于复制有赖于分裂旺盛分裂旺盛的细胞的细胞,因此需将病毒接种因此需将病毒接种与细胞培养与细胞培养同步同步进行。进行。进行。进行。n细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程中发挥着重要作用。中发挥着重要作用。第十五页，本课件共有105页常见人类病毒

19、的敏感细胞P36P36P36第十六页，本课件共有105页（4）分子生物学技术）分子生物学技术n对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病毒对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病毒,可采用现代分子生物学技术可采用现代分子生物学技术,如基因克隆技术如基因克隆技术,对病毒的全基因进行克隆对病毒的全基因进行克隆,构建表达载体构建表达载体构建表达载体构建表达载体,并能表并能表达出病毒样颗粒。达出病毒样颗粒。第十七页，本课件共有105页（三）病毒的鉴定（三）病毒的鉴定步骤：步骤：1、初步鉴定、初步鉴定2、接种动物的观察、接种动物的观察3、最终鉴定、最终鉴定第十八页，本课件共有105页1、初步鉴定、初步鉴定(1

20、)根据临床表现、流行病学特征与标本来源。根据临床表现、流行病学特征与标本来源。初步初步初步初步判定属于哪一类病毒判定属于哪一类病毒判定属于哪一类病毒判定属于哪一类病毒n脑炎患者脑炎患者脑脊液脑脊液 乙型脑炎病毒乙型脑炎病毒n秋季腹泻病人秋季腹泻病人粪便粪便轮状病毒轮状病毒n发烧小孩（下肢麻痹）发烧小孩（下肢麻痹）粪便粪便脊髓灰质炎病脊髓灰质炎病毒毒第十九页，本课件共有105页(2)病毒的生物学特性病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。不同的病毒具有不同的敏感

21、细胞，而又能引起不同的细胞病变不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细胞病变不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细胞病变不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细胞病变效应。效应。效应。效应。例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合出现细胞融合出现细胞融合出现细胞融合,产产产产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、肾生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、肾生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、肾生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒

22、、肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到WI-38WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使细胞圆缩、变小、分散，往往全部细

23、胞受到破坏；腺病细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。细胞病变效应哪三种现象？哪三种现象？第二十页，本课件共有105页血吸附和血凝作用n有些病毒感染细胞后有些病毒感染细胞后,细胞膜上可镶嵌着病毒基细胞膜上可镶嵌着病毒基因编码产生的糖蛋白因编码产生的糖蛋白,其中有些能吸附特定种其中有些能吸附特定种类的红细胞类的红细胞,

24、或将细胞培养单层刮下后或将细胞培养单层刮下后,经过适经过适经过适经过适当处理当处理当处理当处理,可以凝集特定种类的红细胞可以凝集特定种类的红细胞,此类糖蛋此类糖蛋白在细胞表面形成刺突白在细胞表面形成刺突,称为称为血凝素血凝素。n如流感病毒、副黏病毒、风疹病毒等感染细胞后如流感病毒、副黏病毒、风疹病毒等感染细胞后可产生血吸附现象可产生血吸附现象,或通过或通过或通过或通过血凝实验血凝实验来证实病毒来证实病毒的存在。的存在。第二十一页，本课件共有105页n n新城疫病毒新城疫病毒新城疫病毒新城疫病毒能吸附和凝集能吸附和凝集豚鼠豚鼠豚鼠豚鼠红细胞红细胞n n风疹病毒风疹病毒风疹病毒风疹病毒能吸附和凝集

25、能吸附和凝集鸽子鸽子、绵羊绵羊等红细胞等红细胞n病毒的血凝作用往往需要一定的病毒的血凝作用往往需要一定的pH和温度和温度,利利用血吸附和血凝集现象可以为初步判定属于用血吸附和血凝集现象可以为初步判定属于何种病毒提供重要思路。何种病毒提供重要思路。例子例子第二十二页，本课件共有105页干扰现象n n一种病毒感染细胞后一种病毒感染细胞后一种病毒感染细胞后一种病毒感染细胞后,可以干扰另一种病毒在该细胞内的增可以干扰另一种病毒在该细胞内的增可以干扰另一种病毒在该细胞内的增可以干扰另一种病毒在该细胞内的增殖殖殖殖,这种现象称为这种现象称为这种现象称为这种现象称为干扰现象干扰现象干扰现象干扰现象。n n利

26、用干扰现象可以检查出一些不引起细胞病变、血凝、血利用干扰现象可以检查出一些不引起细胞病变、血凝、血利用干扰现象可以检查出一些不引起细胞病变、血凝、血利用干扰现象可以检查出一些不引起细胞病变、血凝、血吸附的病毒。吸附的病毒。吸附的病毒。吸附的病毒。n n如：如：如：如：鼻病毒鼻病毒鼻病毒鼻病毒就可以利用干扰现象进行初步鉴定。就可以利用干扰现象进行初步鉴定。就可以利用干扰现象进行初步鉴定。就可以利用干扰现象进行初步鉴定。n n实验组：实验组：实验组：实验组：感染人胚肾细胞管或培养板细胞用人或豚鼠红细胞感染人胚肾细胞管或培养板细胞用人或豚鼠红细胞感染人胚肾细胞管或培养板细胞用人或豚鼠红细胞感染人胚肾

27、细胞管或培养板细胞用人或豚鼠红细胞做血吸附实验做血吸附实验做血吸附实验做血吸附实验,如果阴性如果阴性如果阴性如果阴性,用用用用HanksHanks液洗涤液洗涤液洗涤液洗涤3 3次次次次,然后接种然后接种然后接种然后接种仙台仙台仙台仙台病毒病毒病毒病毒,3333 培养培养培养培养48h,48h,做血吸附实验。做血吸附实验。做血吸附实验。做血吸附实验。n n对照组：对照组：对照组：对照组：正常细胞只接种正常细胞只接种正常细胞只接种正常细胞只接种仙台病毒仙台病毒仙台病毒仙台病毒。n n实验现象：如果对照组血吸附阳性实验现象：如果对照组血吸附阳性实验现象：如果对照组血吸附阳性实验现象：如果对照组血吸附

28、阳性,而实验组阴性而实验组阴性而实验组阴性而实验组阴性,说明先前说明先前说明先前说明先前接种的标本中存在能干扰仙台病毒增殖的病毒接种的标本中存在能干扰仙台病毒增殖的病毒接种的标本中存在能干扰仙台病毒增殖的病毒接种的标本中存在能干扰仙台病毒增殖的病毒,此结果即为此结果即为此结果即为此结果即为干扰试验阳性。干扰试验阳性。干扰试验阳性。干扰试验阳性。第二十三页，本课件共有105页（3）病毒的理化特性测定n包括病毒包括病毒核酸类型鉴定核酸类型鉴定、耐酸性试验耐酸性试验、脂溶剂脂溶剂脂溶剂脂溶剂敏感性试验敏感性试验敏感性试验敏感性试验、耐热性试验耐热性试验耐热性试验耐热性试验、胰蛋白酶敏感性试验胰蛋白酶

29、敏感性试验胰蛋白酶敏感性试验胰蛋白酶敏感性试验等等等等n n通常以细胞培养或鸡胚培养为观察体系通常以细胞培养或鸡胚培养为观察体系通常以细胞培养或鸡胚培养为观察体系通常以细胞培养或鸡胚培养为观察体系,应设立已应设立已应设立已应设立已知病毒为对照。知病毒为对照。知病毒为对照。知病毒为对照。病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据第二十四页，本课件共有105页代谢抑制法鉴定病毒核酸类型n病毒核酸类型鉴定病毒核酸类型鉴定是病毒理化特性测定的最是病毒理化特性测定的最主要指标。主要指标。添加添加添加添加氟脱氧尿

30、核苷氟脱氧尿核苷氟脱氧尿核苷氟脱氧尿核苷(FUDR)或类似物于病毒培养物或类似物于病毒培养物或类似物于病毒培养物或类似物于病毒培养物中中中中,病毒复制被抑制者病毒复制被抑制者病毒复制被抑制者病毒复制被抑制者,即为即为即为即为DNA病毒病毒病毒病毒,否则为否则为RNA病毒病毒,也可用也可用也可用也可用DNA酶或酶或RNA酶分别作用酶分别作用,以判定以判定核核核核酸的性质酸的性质酸的性质酸的性质。绿豆芽酶绿豆芽酶绿豆芽酶绿豆芽酶可降解单股核酸可降解单股核酸,用它可进一步鉴定核用它可进一步鉴定核酸是酸是单股或双股单股或双股。第二十五页，本课件共有105页n可直接用纯化的病毒核酸通过可直接用纯化的病毒

31、核酸通过电镜观察电镜观察，对其，对其，对其，对其进行鉴定。但技术要求较高。进行鉴定。但技术要求较高。进行鉴定。但技术要求较高。进行鉴定。但技术要求较高。n近年来近年来,PCR核酸测序技术核酸测序技术核酸测序技术核酸测序技术的应用使得病毒核酸的应用使得病毒核酸型鉴定的可行性大为增加。型鉴定的可行性大为增加。（观看观看PCR视频）视频）第二十六页，本课件共有105页脂溶性试验n用乙醚或氯仿处理待检病毒液用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理者比而后与未处理者比而后与未处理者比而后与未处理者比较其较其较其较其TCID50的变化的变化的变化的变化,以判断是否敏感。以判断是否敏感。以判断是否敏感。以判

32、断是否敏感。n乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病毒的脂质包膜。毒的脂质包膜。n n有包膜的病毒对脂溶剂敏感有包膜的病毒对脂溶剂敏感有包膜的病毒对脂溶剂敏感有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理能受脂溶剂的处理能使病毒失去感染性使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂溶剂无包膜的病毒往往对脂溶剂无包膜的病毒往往对脂溶剂无包膜的病毒往往对脂溶剂有抵抗力。因此有抵抗力。因此有抵抗力。因此有抵抗力。因此,用乙醚等可以鉴定所分离的病毒用乙醚等可以鉴定所分离的病毒用乙醚等可以鉴定所分离的病毒用乙醚等可以鉴定所分离的病毒是否有包膜是否有包膜。第二十七页，本课件共有1

33、05页病毒粒的结构模式图病毒粒的结构模式图壳粒壳粒衣壳衣壳核心（核样物）核心（核样物）核心（核样物）核心（核样物）核衣壳核衣壳包膜包膜包膜包膜包膜病毒包膜病毒包膜子粒包膜子粒包膜子粒包膜子粒第二十八页，本课件共有105页处理方法处理方法:n n将病毒悬液将病毒悬液将病毒悬液将病毒悬液20003000r/min20003000r/min离心离心离心离心20min,20min,取上清液取上清液取上清液取上清液,分成两分成两分成两分成两组：组：组：组：n n一组为试验组：按与乙醚一组为试验组：按与乙醚一组为试验组：按与乙醚一组为试验组：按与乙醚4:14:1的比例振荡混合均匀的比例振荡混合均匀的比例振

34、荡混合均匀的比例振荡混合均匀,管口密管口密管口密管口密封好封好封好封好,4,4过夜后过夜后过夜后过夜后,20003000r/min,20003000r/min离心离心离心离心20min20min。此时液体分。此时液体分。此时液体分。此时液体分为两层为两层为两层为两层,上层为乙醚上层为乙醚上层为乙醚上层为乙醚,下层为病毒液下层为病毒液下层为病毒液下层为病毒液。吸取下层部分。吸取下层部分。吸取下层部分。吸取下层部分,避免混避免混避免混避免混有乙醚。有乙醚。有乙醚。有乙醚。n n另一组为对照组：不加乙醚另一组为对照组：不加乙醚另一组为对照组：不加乙醚另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。处理方

35、法同试验组。处理方法同试验组。处理方法同试验组。n n将两组的病毒液同时将两组的病毒液同时将两组的病毒液同时将两组的病毒液同时测定病毒滴度测定病毒滴度测定病毒滴度测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度如果试验组病毒滴度如果试验组病毒滴度如果试验组病毒滴度明显降低明显降低明显降低明显降低,与对照组有明显差异与对照组有明显差异与对照组有明显差异与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感说明病毒对乙醚敏感说明病毒对乙醚敏感说明病毒对乙醚敏感,属于属于属于属于有有有有膜病毒膜病毒膜病毒膜病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异。如果两组的病毒滴度没有显著差异。如果两组的病毒滴度没有显著差异。如果两组的病毒滴度没有显

36、著差异,说明病毒对说明病毒对说明病毒对说明病毒对乙醚有抵抗力乙醚有抵抗力乙醚有抵抗力乙醚有抵抗力,属于属于属于属于无膜病毒无膜病毒无膜病毒无膜病毒。第二十九页，本课件共有105页耐酸性试验n n耐酸性试验和脂溶剂敏感性试验是最常做的两项理耐酸性试验和脂溶剂敏感性试验是最常做的两项理耐酸性试验和脂溶剂敏感性试验是最常做的两项理耐酸性试验和脂溶剂敏感性试验是最常做的两项理化指标。化指标。化指标。化指标。n n耐酸性试验设置缓冲液耐酸性试验设置缓冲液耐酸性试验设置缓冲液耐酸性试验设置缓冲液pH为为为为3和和7的病毒做比较。的病毒做比较。n通过肠道传播的病毒对酸有抵抗力通过肠道传播的病毒对酸有抵抗力,

37、借此可鉴别某借此可鉴别某借此可鉴别某借此可鉴别某些病毒。些病毒。些病毒。些病毒。n如如肠道病毒肠道病毒与与与与鼻病毒鼻病毒同为同为RNA病毒病毒,肠道病毒对肠道病毒对酸有抵抗力酸有抵抗力,而鼻病毒则没有。而鼻病毒则没有。第三十页，本课件共有105页处理方法处理方法:n n试验组：病毒悬液用试验组：病毒悬液用试验组：病毒悬液用试验组：病毒悬液用0.1mol/L的的的的HCl调调pHpH至至3.0,373.0,37放置放置放置放置2h后后,用用5.6%的的的的NaHCO3调调pH至至至至7.2n对照组：除了不加酸外对照组：除了不加酸外,其他步骤和试验组相同。其他步骤和试验组相同。n n将两组同时将

38、两组同时将两组同时将两组同时测定病毒滴度测定病毒滴度测定病毒滴度测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度明显如果试验组病毒滴度明显降低降低,与对照组有显著差异与对照组有显著差异,说明说明病毒对酸敏感病毒对酸敏感,不属不属不属不属于肠道病毒于肠道病毒于肠道病毒于肠道病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说明病毒说明病毒对酸有抵抗力对酸有抵抗力,属肠道病毒属肠道病毒。第三十一页，本课件共有105页2、接种动物的观察、接种动物的观察n根据动物的感染范围根据动物的感染范围,可初步推断属于何种病毒。可初步推断属于何种病毒。n n接种动物的观察是非常重要的接种动物的观察是非常重要的

39、接种动物的观察是非常重要的接种动物的观察是非常重要的,通过观察试验动物通过观察试验动物的反应有时也可初步鉴定何种病毒。的反应有时也可初步鉴定何种病毒。n n每天都需要观察每天都需要观察每天都需要观察每天都需要观察,有时有时1d需要观察数次。需要观察数次。第三十二页，本课件共有105页观察指标:n n动物发病的动物发病的动物发病的动物发病的潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期,病毒感染都有一定的潜伏期。因此病毒感染都有一定的潜伏期。因此病毒感染都有一定的潜伏期。因此病毒感染都有一定的潜伏期。因此,潜潜潜潜伏期在病毒的初步鉴定方面也是非常重要的。如乙脑小鼠脑伏期在病毒的初步鉴定方面也是非常重要的。如乙脑小鼠脑

40、伏期在病毒的初步鉴定方面也是非常重要的。如乙脑小鼠脑伏期在病毒的初步鉴定方面也是非常重要的。如乙脑小鼠脑内接种潜伏期一般为内接种潜伏期一般为内接种潜伏期一般为内接种潜伏期一般为4d,4d,狂犬病脑内接种潜伏期一般为狂犬病脑内接种潜伏期一般为狂犬病脑内接种潜伏期一般为狂犬病脑内接种潜伏期一般为68d68d。n n接种动物的接种动物的接种动物的接种动物的饮食情况饮食情况饮食情况饮食情况是否有变化是否有变化是否有变化是否有变化,活动活动活动活动与饮食能力是否发生与饮食能力是否发生与饮食能力是否发生与饮食能力是否发生改变改变改变改变,粪便粪便粪便粪便是否有变化。是否有变化。是否有变化。是否有变化。n

41、n每天在同一时间测量动物的每天在同一时间测量动物的每天在同一时间测量动物的每天在同一时间测量动物的体重体重体重体重和和和和体温体温体温体温,比较接种前后比较接种前后比较接种前后比较接种前后变化情况。变化情况。变化情况。变化情况。n n观察观察观察观察局部或全身性反应局部或全身性反应局部或全身性反应局部或全身性反应,如出现毛松、软弱无力、震颤、不如出现毛松、软弱无力、震颤、不如出现毛松、软弱无力、震颤、不如出现毛松、软弱无力、震颤、不安、抽搐安、抽搐安、抽搐安、抽搐,甚至死亡等全身症状甚至死亡等全身症状甚至死亡等全身症状甚至死亡等全身症状,可考虑神经系统感染的可能性。可考虑神经系统感染的可能性。

42、可考虑神经系统感染的可能性。可考虑神经系统感染的可能性。n n对照组不接种病毒对照组不接种病毒对照组不接种病毒对照组不接种病毒,用生理盐水代替用生理盐水代替用生理盐水代替用生理盐水代替,其他步骤和观察指标与其他步骤和观察指标与其他步骤和观察指标与其他步骤和观察指标与试验组完全相同。试验组完全相同。试验组完全相同。试验组完全相同。第三十三页，本课件共有105页3、最终鉴定、最终鉴定n n病毒的最终鉴定需要病毒的最终鉴定需要病毒的最终鉴定需要病毒的最终鉴定需要免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法、分子生物学方分子生物学方法、电子显微镜法、电子显微镜与与免疫电子显微技术免疫电子显微技术等特异性等

43、特异性等特异性等特异性方法加以鉴定。方法加以鉴定。方法加以鉴定。方法加以鉴定。n n（1 1）病毒的血清学鉴定）病毒的血清学鉴定n n（2 2）病毒的分子生物学鉴定）病毒的分子生物学鉴定n（3）电子显微镜技术）电子显微镜技术）电子显微镜技术）电子显微镜技术第三十四页，本课件共有105页（1）病毒的血清学鉴定n病毒分离后病毒分离后,可用已知的抗病毒血清或单克隆抗可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体体,对分离毒株进行血清学鉴定对分离毒株进行血清学鉴定对分离毒株进行血清学鉴定对分离毒株进行血清学鉴定,以确定病毒的种类、以确定病毒的种类、以确定病毒的种类、以确定病毒的种类、血清型及其亚型。血清型及其亚型。

44、血清型及其亚型。血清型及其亚型。n常用的血清学试验有常用的血清学试验有血清中和试验血清中和试验血清中和试验血清中和试验、血清抑制试血清抑制试血清抑制试血清抑制试验、免疫荧光试验验、免疫荧光试验验、免疫荧光试验验、免疫荧光试验等。等。n此外此外,可采用一些血清学技术如免疫沉淀技术和可采用一些血清学技术如免疫沉淀技术和免疫转印技术分析病毒的结构蛋白成分。免疫转印技术分析病毒的结构蛋白成分。第三十五页，本课件共有105页中和试验n基本原理：基本原理：特异性的抗病毒免疫血清（即中特异性的抗病毒免疫血清（即中和抗体）和病毒体表面的抗原结合后和抗体）和病毒体表面的抗原结合后,使病毒使病毒不能吸附于敏感细胞

45、不能吸附于敏感细胞,或两者结合后抑制了病毒或两者结合后抑制了病毒的穿入和的穿入和/或脱壳过程。因此或脱壳过程。因此,病毒就失去了感染病毒就失去了感染的能力。的能力。n n中和试验中和试验中和试验中和试验是以是以测定病毒的感染力测定病毒的感染力为基础的为基础的,试验试验必须在培养的细胞内必须在培养的细胞内,或动物、鸡胚等活体内进或动物、鸡胚等活体内进行行,而且都必须是对病毒敏感的。而且都必须是对病毒敏感的。以病毒受免以病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据疫血清中和后的残存感染力为依据,判定中和抗判定中和抗体的滴度。中和试验需要设对照试验。体的滴度。中和试验需要设对照试验。第三十六页，本课件共有

46、105页结果判定的科学依据：结果判定的科学依据：n n用细胞培养进行试验时用细胞培养进行试验时用细胞培养进行试验时用细胞培养进行试验时,可依据可依据细胞病变情况细胞病变情况细胞病变情况细胞病变情况、蚀蚀斑数量斑数量、颜色反应颜色反应等。等。n n用鸡胚进行试验时用鸡胚进行试验时用鸡胚进行试验时用鸡胚进行试验时,可依据鸡胚的可依据鸡胚的可依据鸡胚的可依据鸡胚的死亡数死亡数死亡数死亡数、绒毛尿绒毛尿囊膜斑点数量和特征囊膜斑点数量和特征、血凝素产生情况血凝素产生情况等等;n用动物进行试验时用动物进行试验时,可依据可依据可依据可依据动物死亡数动物死亡数、发病数发病数、出现症状数出现症状数等。等。等。等

47、。第三十七页，本课件共有105页操作步骤：操作步骤：中和试验常用的有两种方法：中和试验常用的有两种方法：n一种是一种是固定病毒数量固定病毒数量,一般用一般用100TCID50的病毒的病毒与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试验。与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试验。然后接种于动物、鸡胚或细胞中，用然后接种于动物、鸡胚或细胞中，用Reed-Muench法计算法计算50%感染的血清中和终点。感染的血清中和终点。n另一种是另一种是固定血清用量固定血清用量固定血清用量固定血清用量与等量一系列对数稀释的与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。病毒进行中和试验。第三十八页，本课件共有105页病毒毒价单位：

48、病毒毒价单位：u半数致死量半数致死量(LD(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的作为毒价测定单位，即经规定的作为毒价测定单位，即经规定的作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。能致半数试验动物死亡的剂量。能致半数试验动物死亡的剂量。能致半数试验动物死亡的剂量。u用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELDELD50)或鸡胚半数感染量或鸡胚半数感染量或鸡胚半数感染量

49、或鸡胚半数感染量(EID5050)。u用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。u在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量或半数保护量或半数保护量或半数保护量(PD50)。第三十九页，本课件共有105页病毒毒价的测定（微量法）病毒毒价的测定（微量法）(1)(1)(1)(1)病毒的制备病毒的制备病毒的制备病毒的制备将病毒接种于单层细胞，将病毒接种于单层细胞，3737吸附吸附1h1h后加入维后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPECP

50、E）达）达75%75%以上，收获病毒悬液冻融或超以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以声波处理，以3 000r/min3 000r/min离心离心10min10min10min10min，取上清，取上清液，定量分装成液，定量分装成1ml1ml小瓶置小瓶置-70-70-70-70保存备用，选保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。第四十页，本课件共有105页(2)(2)病毒毒价测定病毒毒价测定病毒毒价测定病毒毒价测定取置取置-70-70-70-70冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在9696孔孔培养板上作培养板上作1010倍递进