实验十二 血清肌酸激酶测定与应用.pptx

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1、实验十二实验十二 血清肌酸激酶测定与应用血清肌酸激酶测定与应用1 1 1 1 实验目的实验目的实验目的实验目的 了解血清肌酸磷酸激酶测定的方法。了解血清肌酸磷酸激酶测定的方法。掌握其测定的应用与意义。掌握其测定的应用与意义。第1页/共20页2 2 2 2 实验原理实验原理实验原理实验原理肌肌酸酸激激酶酶（Creatine Creatine phosphokinasephosphokinase，简简称称CKCK）广广泛泛存存在在于于骨骨骼骼肌肌、心心肌肌和和脑脑组组织织中中，肝肝脏脏和和红红细细胞胞等等不不含含此此酶酶。骨骨骼骼肌肌中中含含量量最最丰丰富富，占占全全身身总量的总量的96%96%之

2、多。之多。肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶在在肌肌肉肉收收缩缩中中很很重重要要，它它催催化化下下列列反应：反应：第2页/共20页上上述述反反应应保保证证肌肌肉肉收收缩缩时时的的能能量量供供应应和和运运动动后后ATPATP和和肌肌酸酸磷磷酸酸的的再再合合成成。正正常常人人血血清清中中肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶主主要要由由骨骨骼骼肌肌和和心心肌肌细细胞胞透透过过细细胞胞膜膜进进入入血血液液的的结结果果，其其活活力力很很小小。正正常值每升血液中常值每升血液中100100活力单位以下。活力单位以下。运运动动训训练练能能使使血血清清肌肌酸酸酸酸磷磷酸酸活活性性升升高高。其其原原因因一一般般认认为为运运动动时时缺缺

3、氧氧,代代谢谢产产物物积积累累，供供能能相相对对不不足足等等原原因因，引引起起肌肌细细胞胞膜膜通通透透性性升升高高。或或肌肌细细胞胞膜膜受受到到损损伤伤，促促使使CKCK从从细细胞胞内内释释放放增增加加，进进入入血血液液循循环环，其其中中以以肌肌肉肉牵牵拉拉的的机机械械性性损伤或产生血肿等原因最为重要。损伤或产生血肿等原因最为重要。第3页/共20页滑滑雪雪运运动动和和马马拉拉松松赛赛跑跑后后，血血清清CKCK的的活活性性较较高高，特特别别是是大大强强度度的的马马拉拉松松赛赛跑跑最最高高。在在运运动动后后4 4小小时时升升高高，8-168-16小小时时达达最最高高值值。跳跳跃跃、短短跑跑等等短短

4、时时间间激激烈烈运运动动，冲冲击击性性运运动动，也也易易引引起起CKCK活活性性升升高高。大大运运动动量量的的训训练练和和100m100m、200m200m跑跑比比赛赛后后，血血清清中中CKCK活活性性都都显显著著升升高高，尤尤其其是是在在比比赛时，升高更为显著。赛时，升高更为显著。应应用用肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶来来作作机机能能评评定定时时，一一般般认认为为2-32-3天天取取血血测测定定一一次次,在在负负荷荷后后经经常常处处于于100-200100-200国国际际活活力力单单位位/L/L。如如果果超超过过200200IU/LIU/L，就就是是运运动动量量过过大大，身身体体尚尚未未恢恢复复，

5、此此时应调整运动量。时应调整运动量。第4页/共20页3 3 3 3 实验器材与试剂实验器材与试剂实验器材与试剂实验器材与试剂 器材器材器材器材 器材器材 试管、分光光度计、分析天平、采血试管、分光光度计、分析天平、采血装置（注射器）、水浴箱、离心机装置（注射器）、水浴箱、离心机第5页/共20页 试试试试剂剂剂剂 试剂试剂 混合底物混合底物pH pH 7.4 7.4 三三羟羟甲甲基基氨氨基基甲甲烷烷-盐盐酸酸缓缓冲冲液液：称称取取三三羟羟甲甲基基氨氨基基甲甲烷烷（TrisTris）2.4g2.4g，加加蒸蒸馏馏水水至至100 100 mlml，再再加加入入0.2 0.2 N N盐盐酸酸88.8

6、88.8 mlml及及无无水水硫硫酸酸镁镁0.34g0.34g，调调节节pHpH至至7.47.4。此此液液在在室室温温下可保存数月。下可保存数月。0.012 0.012 M M磷磷 酸酸 肌肌 酸酸 溶溶 液液：称称 取取 磷磷 酸酸 肌肌 酸酸 钠钠（C C4 4H H8 8O O5 5-O O4 4PNaPNa3 36H6H2 2O O）4 436 36 mgmg，加加蒸蒸馏馏水水至至100 100 mlml，调调节节PHPH至至7.47.4，保存于，保存于-25-25或普通冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。或普通冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。0.001 0.001 M M ADPADP溶

7、溶液液：称称取取ADPADP钠钠盐盐0.233g0.233g，加加蒸蒸馏馏水水至至100 100 mlml，调调节节PHPH至至7.47.4，保保存存于于-25-25或或冰冰箱箱上上层层冰冰盒盒中中，可可用用一个月左右。一个月左右。第6页/共20页临用前，取上述（临用前，取上述（1 1）（）（2 2）（）（3 3）试剂各）试剂各10 ml10 ml混合。混合。在在此此混混合合底底物物液液30 30 mlml中中，加加入入盐盐酸酸半半胱胱氨氨酸酸0.105g0.105g，调调节节PHPH至至7.47.4。此此试试剂剂最最好好新新鲜鲜配配制制，也也可可以以保保存存于于冰冰盒盒中中。一一般般可可放放

8、5-5-7 7天，若空白管光密度太高，说明有游离肌酸产生，即不能再用。天，若空白管光密度太高，说明有游离肌酸产生，即不能再用。0.3 N 0.3 N 氢氧化钡溶液氢氧化钡溶液 称称取取氢氢氧氧化化钡钡（Ba(OH)Ba(OH)2 28H8H2 2O O）4.73g4.73g，加加蒸蒸馏馏水水使使之之溶溶解解（可加热助溶），并稀释到（可加热助溶），并稀释到100 ml100 ml。5%5%硫酸锌溶液硫酸锌溶液称称取取硫硫酸酸锌锌（ZnSOZnSO4 47H7H2 2O O）8.82g8.82g，加加蒸蒸馏馏水水溶溶解解，并并稀稀释释到到100 ml100 ml。上上述述2 2、3 3两两种种溶溶

9、液液配配好好后后，需需进进行行滴滴定定，即即吸吸取取5%5%硫硫酸酸锌锌溶溶液液5 5 mlml，放放入入50 50 mlml三三角角烧烧瓶瓶中中，加加入入酚酚酞酞指指示示剂剂2 2滴滴，用用0.3 0.3 N N Ba(OH)Ba(OH)2 2溶溶液液滴滴定定至至出出现现粉粉红红色色3030秒秒钟钟不不褪褪色色为为止止。Ba(OH)Ba(OH)2 2用用量与量与ZnSOZnSO4 4相等，如不相等，可稀释较浓的溶液。相等，如不相等，可稀释较浓的溶液。第7页/共20页标准肌酸溶液（标准肌酸溶液（1.71.7MM/ml/ml）准准确确称称取取无无水水肌肌酸酸22.3mg22.3mg，置置于于10

10、0ml100ml容容量量瓶瓶中中，加加蒸蒸馏水使之溶解，并稀释到刻度，置冰箱中保存，可用数日。馏水使之溶解，并稀释到刻度，置冰箱中保存，可用数日。双乙酰液双乙酰液 先先配配成成1%1%溶溶液液，置置棕棕色色瓶瓶中中放放冰冰箱箱保保存存。临临用用时时用用蒸蒸馏水稀释馏水稀释2020倍。倍。贮存碱溶液贮存碱溶液 称称取取30g 30g NaOHNaOH，无无水水碳碳酸酸钠钠（Na2CO3Na2CO3）64g64g，加加蒸蒸馏馏水水使使溶溶解解并并稀稀释释至至500 500 mlml，室室温温低低时时可可析析出出沉沉淀淀，此此时时应应放放于于3737水浴中待沉淀溶解后再使用。水浴中待沉淀溶解后再使用

11、。-萘酚溶液萘酚溶液 称称取取-萘萘酚酚1g1g，用用上上述述贮贮存存碱碱液液使使溶溶解解，并并稀稀释释到到100 ml100 ml，此液必须新鲜配制，否则空白管光密度读数增高。，此液必须新鲜配制，否则空白管光密度读数增高。第8页/共20页4 4 4 4 实验方法与步骤实验方法与步骤实验方法与步骤实验方法与步骤肌酸磷酸激酶显色法肌酸磷酸激酶显色法肌酸磷酸激酶显色法肌酸磷酸激酶显色法肌酸磷酸激酶显色法。肌酸磷酸激酶显色法。测测定定CKCK活活性性原原理理：利利用用上上述述反反应应所所生生成成的的肌肌酸酸与与-萘萘酚酚和和双双乙乙酸酸反反应应，生生成成红红色色化化合合物物。在在一一定定范范围围内内

12、，红红色色深深浅浅与与肌肌酸酸含含量量成成正正比比，与与同同样样处处理理的的肌肌酸酸标标准准液液比比色色，求得酶的活力。求得酶的活力。第9页/共20页加入物（加入物（mlml）空白管空白管标准管标准管测定管测定管混合底物混合底物0.750.750.750.750.750.75血清血清0.10.1标准肌酸标准肌酸（1.7M/ml1.7M/ml）0.10.1蒸馏水蒸馏水0.10.1 置置3737水浴保温水浴保温30 min 30 min Ba(OH)Ba(OH)2 2溶液溶液0.50.50.50.50.50.5ZnSOZnSO4 4溶液溶液0.50.50.50.50.50.5蒸馏水蒸馏水0.50.

13、50.50.50.50.5 混匀，离心混匀，离心5-10 min 5-10 min 测定操作步骤（如下表测定操作步骤（如下表3-143-14）：）：表表3-14 3-14 单位：单位：mlml第10页/共20页上清液上清液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5-萘酚溶液萘酚溶液1.1.1 11.1.1 11.1.1 1双乙酰液双乙酰液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5置置3737水浴保温水浴保温15 min 15 min 蒸馏水蒸馏水1.1.3 31.1.3 31.1.3 3离心离心35min35min，520nm520nm波长处进行比色波长处进

14、行比色 读取各管的光密度读取各管的光密度 第11页/共20页计算：第12页/共20页 肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：原理原理ATP+ATP+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+ADP +ADP 为作用酶为作用酶葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+NADP+NADP+6-6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖+NADPH+H+NADPH+H+为作用酶为作用酶第13页/共20页 器器材材与与试试剂剂：试试管管、可可见见光光分分光光光光度度计计、电电子子分分析析天天平平、采采血血装装置置（注注射射器器）、水水浴浴锅锅、离离心心机机、

15、试试剂剂盒盒测测定法。定法。如如：采采用用中中生生北北控控生生物物科科技技股股份份有有限限公公司司生生产产的的肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶检检测测试试剂剂盒盒，该该试试剂剂盒盒适适用用于于全全自自动动，半半自自动动生生化分析仪及分光光度计测定人血清中化分析仪及分光光度计测定人血清中CKCK的酶活浓度。的酶活浓度。基本参数：波长：基本参数：波长：340 nm340 nm，温度：，温度：25,30,3725,30,37，比，比色杯光径：色杯光径：1cm1cm。第14页/共20页试剂试剂主要成分主要成分实验浓度实验浓度R1 R1 己糖激酶己糖激酶(HK)(HK)3000 U/L3000 U/L葡萄糖葡萄

16、糖-6-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶(G6PDH)(G6PDH)2000 U/L2000 U/LADPADP2 mmol/L2 mmol/LAMPAMP5 mmol/L5 mmol/LAp5AAp5A10 mol/L10 mol/LNADPNADP2 mmol/L2 mmol/LNACNAC20 mmol/L20 mmol/L磷酸肌酸磷酸肌酸30 mmol/L30 mmol/LR2R2咪唑缓冲液咪唑缓冲液(pH 6.7(pH 6.7，25)25)100mmol/L100mmol/L葡萄糖葡萄糖20mmol/L20mmol/L原装试剂杂原装试剂杂2-8避光保存，有效期避光保存，有效期12个月。复溶后

17、在个月。复溶后在2-8可稳定可稳定7天，在天，在15-25可稳定可稳定12小时。小时。试剂盒主要成分与浓度，见表试剂盒主要成分与浓度，见表3-153-15：表表3-15 3-15 肌酸磷酸激酶检测试剂盒成分与浓度肌酸磷酸激酶检测试剂盒成分与浓度第15页/共20页加入物（加入物（mlml）空白管空白管样品管样品管工作液工作液2.502.500.500.50蒸馏水蒸馏水2.502.50样品样品0.500.50混合均匀，在混合均匀，在3737温育温育2 2分钟后，读取初始吸光度，然后在精分钟后，读取初始吸光度，然后在精确确1 1分钟，分钟，2 2分钟，分钟，3 3分钟时分别读取吸光度，确定每分钟平均

18、分钟时分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度变化吸光度变化A A。表表3-16 3-16 肌酸磷酸激酶检测试剂盒的操作肌酸磷酸激酶检测试剂盒的操作 操作步骤：取一定量操作步骤：取一定量R2R2（参看（参看R1R1瓶签）复溶瓶签）复溶1 1瓶瓶R1R1，溶解后即为工作液。工作液预先保温至测试温度。，溶解后即为工作液。工作液预先保温至测试温度。第16页/共20页 计算：计算：CKCK（U/LU/L）=（A A样品样品/分分AA空白空白/分）分）FF F=(Vt/Vs F=(Vt/Vs消光系数消光系数)1000=8095)1000=8095（3737）Vt=Vt=反应总体积反应总体积 Vs=Vs=样品

19、体积样品体积 NADPHNADPH在在340 nm340 nm波长下毫克分子消光系数波长下毫克分子消光系数=6.3=6.3 参考值：男：参考值：男：24-195 U/L24-195 U/L；女：；女：24-170 U/L24-170 U/L 线性上限：线性上限：CKCK活力可达活力可达1500U/L1500U/L（3737）注注 意意 事事 项项：当当 A/A/分分 大大 于于 0.03600.0360（F=4127F=4127），0.01900.0190（F=8095F=8095）时时，样样品品用用生生理理盐盐水水稀稀释释后后重重新新测测定定，结结果果乘乘以以稀稀释释倍倍数数；试试剂剂空空白

20、白吸吸光光度度大大于于0.60.6时时,勿勿用用；血血清清CKCK不不稳稳定定，样样品品收收集集后后要要尽尽快快分分析析，在在室室温温4 4小小时时，在在4 8-124 8-12小时后，小时后，CKCK活性即要下降。活性即要下降。第17页/共20页5 5 注意事项注意事项5 5 5 5 注意事项注意事项注意事项注意事项 红红细细胞胞中中肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶活活力力很很低低，故故溶溶血血标标本本不不影影响响测测定结果。定结果。混合底物的混合底物的pHpH要求准确。要求准确。氧氧氧氧化化钡钡和和硫硫酸酸锌锌要要滴滴定定至至恰恰好好等等量量，否否则则离离心心后后会会出出现现混混浊浊。特特别别是是

21、钡钡离离子子多多时时，不不能能完完全全被被硫硫酸酸根根清清除除尽尽，使显色混浊而影响测定结果。使显色混浊而影响测定结果。肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶活活力力单单位位定定义义：以以1 1 mlml血血清清在在3737与与底底物物作用作用1 1小时，生成小时，生成1M1M肌酸为肌酸为1 1个肌酸磷酸激酶活力单位。个肌酸磷酸激酶活力单位。酶酶的的活活力力太太高高时时，应应将将血血清清用用Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液稀稀释释后后再再行测定，结果乘以稀释倍数。行测定，结果乘以稀释倍数。因因-萘萘酚酚本本身身颜颜色色不不恒恒定定，试试剂剂空空白白每每次次深深浅浅不不同同，故故不能用标准曲线工作法。不能用标准曲线工作法。第18页/共20页6 6 思考题思考题6 6 6 6 思思思思考考考考题题题题 血血清清CKCK活活性性是是赛赛前前进进行行机机能能评评定定的的一一项项重要指标，试述其理由。重要指标，试述其理由。采血时挤压组织对结果有何影响？采血时挤压组织对结果有何影响？第19页/共20页