实时荧光定量PCR的原理操作及其应用.pptx

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1、会计学1实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理操作及其应用的原理操作及其应用大纲大纲一一一一.原理概述原理概述原理概述原理概述二二二二.操作及结果分析操作及结果分析操作及结果分析操作及结果分析 (一一).).样品制备样品制备 (二二).).引物及探针的设计与合成引物及探针的设计与合成 (三三).).标准品的制备标准品的制备-质粒或纯化后的质粒或纯化后的PCRPCR产物产物 (四四).).通道的选择及增益的选择通道的选择及增益的选择 (五五).).标准曲线的建立标准曲线的建立 (六六).).加样时应注意的细节加样时应注意的细节 (七七).).阈值的选定阈值的选定 (八八).).熔解曲线分析熔解曲线

2、分析 (九九).).操作流程操作流程三三三三.应用应用应用应用 (一一).).绝对定量分析绝对定量分析 (二二).).相对定量分析及实验方案相对定量分析及实验方案 (三三).SNP).SNP检测分析检测分析第1页/共42页一、原理概述一、原理概述1.Real-Time PCR 1.Real-Time PCR 概论概论 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术于技术于19961996年由美国年由美国Applied BiosystemsApplied Biosystems公司推出，由于该技术不公司推出，由于该技术不仅实现了仅实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃，而且与常规从定性到定量的飞跃，而且与

3、常规PCRPCR相比，它具有特异性更强、有效解相比，它具有特异性更强、有效解决决PCRPCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR：在在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。法。定量定量PCRPCR仪是在普通仪是在普通PCRPCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光

4、检测装置，PCRPCR扩增扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。常常 规规 PCRPCR技术：对技术：对PCRPCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量实时定量PCRPCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测利用荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中每一个循环扩增产扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过物量的变化，通过C

5、tCt值和标准曲线的分析对起始模板进行定量值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 分析。分析。第2页/共42页一、原理概述一、原理概述2.2.定量定量PCRPCR常用的三个常用概念常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值 (1).(1).扩增曲线：反映扩增曲线：反映PCRPCR循环次数和荧光强度的曲线，定量循环次数和荧光强度的曲线，定量PCRPCR仪每次轮仪每次轮PCRPCR扩增都会自动扩增都会自动 录荧光强度的变化录荧光强度的变化每个循环进行一次荧光信号的收集第3页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述2.2.定量定量PCRPCR常用的三个常

6、用概念常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值 (2).(2).荧光阈值：荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动手动 设置的原则要大于样本的荧设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于段，并且保证回归系数大于0.990.99。(3).CT(3).CT值：值：PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经

7、过的扩增循环 次数。次数。第4页/共42页一、原理概述一、原理概述3.3.荧光定量荧光定量PCRPCR所用的荧光报告基所用的荧光报告基团团(1).(1).非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：SYBR Green SYBR Green(2).(2).特异性荧光标记：特异性荧光标记：TaqManTaqMan探针探针 Molecular BeaconMolecular Beacon分子信标分子信标第5页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述4.4.非特异性荧光染料非特异性荧光染料-SYBR Green-SYBR Green的特性的特性(1).SYBR Green(1).SYBR

8、Green 能结合到双链能结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位(2).SYBR Green(2).SYBR Green 只有和双链只有和双链DNADNA结合受激后才发结合受激后才发 荧光荧光(3).(3).变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光双链分开，无荧光(4).(4).复性和延伸时，形成双链复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green DNA,SYBR Green 发发荧光，在此阶段采集荧光信号。荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR GreenSYBR Green第6页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述4.4.非特异性荧光染料非特异性荧光染料-S

9、YBR Green-SYBR Green的工作原理图解的工作原理图解5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation 伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。第7页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述5.5.非特异性荧光染料非特异性荧光染料SYBR GreenSYBR Green的优缺点的优缺点 优点：优点：(1).(

10、1).对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性-适用于任何适用于任何DNADNA (2).(2).使用方便使用方便-不必设计复杂探针不必设计复杂探针 (3).(3).非常灵敏非常灵敏 (4).(4).可做熔解曲线分析可做熔解曲线分析 (5).(5).便宜便宜 缺点：缺点：(1).(1).对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高 (2).(2).与非特异性双链与非特异性双链DNADNA结合，产生假阳性结合，产生假阳性,干扰实验的准确性干扰实验的准确性,尤其尤其 是分析表达量不高的基因时是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出这类情况尤其突出;需要不断的优化反需要不断的优化反 应体系应体系,

11、降低非特异性扩增降低非特异性扩增.第8页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述6.6.TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针与目标序列互补TaqMan探针的特性：(1).5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等(2).3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)(3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分 开，发荧光(4).Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针第9页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述6.6.TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针工作原理水解型杂交探针工作原理每扩

12、增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光第10页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述7.探针法的优缺点 (1).(1).极高的特异性和准确性极高的特异性和准确性 由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针 序列的特异性，从两个方面保证了所序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异扩增基因的特异 性。性。(2).(2).良好的重复性良好的重复性 (3).(3).目前合成价格较贵目前合成价格较贵.(4).(4).不能做熔解曲线分析不能做熔解曲线分析.第11页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理

13、概述一、原理概述8.8.荧光定量荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理理想的理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0*2n (*2n (扩增效率扩增效率=1)=1)实际的的实际的的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0*(1+Ex)n(1+Ex)n n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 X X：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量 X0X0：初始模板量：初始模板量 ExEx：扩增效率：扩增效率第12页/共42页一、原理概述一、原理概述一、原理概述一、原理概述8.8.荧光定量荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时:XC

14、t=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后在阈值线设定以后,它是一个常数它是一个常数,我们设为我们设为M M方程式方程式(1)(1)两边同时取对数得两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct (2)log M=log X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式整理方程式(2)(2)得得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)log(1+Ex)*Ct=-log

15、X0+log M (4)log(1+Ex)*Ct=-log X0+log M (4)Ct=Ct=-log X0+log M-log X0+log M (5)(5)log(1+Ex)log(1+Ex)LogLog（x0 x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（的初始模板量）与到达阈值时的循环数（CtCt值）呈线值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即CtCt值就可计算值就可计算出样品中所含的模板量出样品中所含的模板量第13页/共42页一、原理概述一、原理概述8.8.荧光定量荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越

16、少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量第14页/共42页一、原理概述一、原理概述8.8.荧光定量荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理25Sample确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量第15页/共42页一、原理概述一、原理概述9.9.认识一下荧光定量认识一下荧光定量PCRPCR仪仪 仪器本身的功能：仪器本身的功能：1 1、控制参数（温度）、控制参数（温度）2 2、控制循环数（时间）、控

17、制循环数（时间）3 3、记录整个循环过程中的荧光值的变化，在所有的时、记录整个循环过程中的荧光值的变化，在所有的时 间和温度条件下，仪器都会忠实的记录下荧光值的间和温度条件下，仪器都会忠实的记录下荧光值的 变化。变化。荧光定量荧光定量PCRPCR仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。循环数和荧光值曲线温度和荧光值曲线第16页/共42页一、原理概述一、原理概述ABI 7300型96孔荧光定量PCR仪，由于样品间存在光程差，需ROX校正。RoterGene3000型36孔荧光定量PCR仪，旋转加热式，不需ROX校正第17页/共42页二、

18、操作及结果分析二、操作及结果分析1 1、样品的制备、样品的制备 DNADNA样品，主要是样品，主要是DNADNA提取，提取的提取，提取的DNADNA可可TETE缓冲液溶解后缓冲液溶解后-20-20度保存；对于度保存；对于RNARNA样样 品，抽提品，抽提RNARNA后要迅速反转录，将后要迅速反转录，将RNARNA反转录为反转录为cDNAcDNA，TETE缓冲液溶解后可缓冲液溶解后可-20-20度度保保 存。存。DNADNA或或cDNAcDNA样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的DNADNA降解，从而降解，从而 影响样品中目的基因的含量。影

19、响样品中目的基因的含量。对于大量的样品最佳的检测方案是：对于大量的样品最佳的检测方案是：根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是RANRAN立即进行反转录立即进行反转录反反 应，并且将当天反转录的样品进行定量应，并且将当天反转录的样品进行定量PCRPCR检测；千万不可先将所有的样品都检测；千万不可先将所有的样品都提取提取RNARNA，提取完，提取完RNARNA后再统一反转录，然后在对后再统一反转录，然后在对cDNAcDNA样品进行定量检测，千万样品进行定量检测，千万不要这样做，因为不要这样做，因为RNARNA是极不稳定的，哪怕是存放于

20、是极不稳定的，哪怕是存放于-80-80度冰箱，一方面度冰箱，一方面RNARNA极极其容易降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故其容易降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停机或停电，那所有提取的障造成停机或停电，那所有提取的RNARNA将会很大程度的降解，对样品造成不可将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失！挽回的损失！最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量PCRPCR的检测，最大程度的检测，最大程度的减少的减少RNARNA的降解，这样测定的结果才更准确。的降解，这样测

21、定的结果才更准确。第18页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析2 2、定量、定量PCRPCR引物及探针的合成引物及探针的合成 定量定量PCRPCR所扩增的片段长度一般都不超过所扩增的片段长度一般都不超过300bp300bp，这样才能确保结果更准确；染，这样才能确保结果更准确；染料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩增的片段长度更短，一般都在增的片段长度更短，一般都在200bp200bp以下。引物和探针都要进行以下。引物和探针都要进行BlastBlast分析，以分析，以避免非特异性扩增。避

22、免非特异性扩增。第19页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析3 3、标准品的制备、标准品的制备-质粒或纯化后的质粒或纯化后的PCRPCR产物产物这一步骤一般在预实验时完成，严格意义上的操作要求将这一步骤一般在预实验时完成，严格意义上的操作要求将PCRPCR产物切胶后进行胶回产物切胶后进行胶回收，并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后收，并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后提取质粒，并用分光光度计测定含有提取质粒，并用分光光度计测定含有PCRPCR产物的质粒的产物的质粒的ODOD值，借此来确定质粒值，借此来确定质粒的摩尔量，将已知摩

23、尔量的质粒做的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做5 5倍或倍或1010倍的连续梯度稀释，做成质粒标准倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。品，这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCRPCR产物的摩尔量，然后梯度稀释产物的摩尔量，然后梯度稀释PCRPCR产物，产物，以此来作为标准品。以此来作为标准品。一般做四个标准品左右一般做四个标准品左右 5-25-125-625-31255-25-125-625-3125 10-100-1000-10000-100000 10-100-1000

24、-10000-100000第20页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析4 4、通道的选择及增益的选择、通道的选择及增益的选择对于任何一款荧光定量对于任何一款荧光定量PCRPCR仪来说，都有一组或几组激发光和滤光片以及相应的检仪来说，都有一组或几组激发光和滤光片以及相应的检测器和滤光片，这些就构成了定量测器和滤光片，这些就构成了定量PCRPCR仪的通道。不同的发光基团都有相应的仪的通道。不同的发光基团都有相应的激发光和相应的检测器。定量激发光和相应的检测器。定量PCRPCR仪从最初的单通道发展到现在的多通道，常仪从最初的单通道发展到现在的多通道，常用的通道有用的通道有FAM/HEX/J

25、OEFAM/HEX/JOE等。可根据自己所用的发光基团来选择相应的通道。等。可根据自己所用的发光基团来选择相应的通道。增益（增益（gaingain），是荧光信号的放大倍数，发光基团的荧光是很微弱的，必须经过适），是荧光信号的放大倍数，发光基团的荧光是很微弱的，必须经过适量的信号放大才能被检测，否则，整个扩增曲线的荧光强度非常小，以致无法量的信号放大才能被检测，否则，整个扩增曲线的荧光强度非常小，以致无法准确检测。所以在实验前，要选择合适的增益倍数。准确检测。所以在实验前，要选择合适的增益倍数。第21页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析5 5、标准曲线的建立、标准曲线的建立梯度稀释后

26、，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。第22页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析6 6、加样时的操作、加样时的操作所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的，除了样品外，其他试剂都所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的，除了样品外，其他试剂都要进行预混，预混后分装到各个要进行预混，预混后分装到各个PCRPCR管中，最后加样品，移液器要尽量准确，管中，最后

27、加样品，移液器要尽量准确，因为这一步的操作可以说是差之毫厘，谬以千里。因为这一步的操作可以说是差之毫厘，谬以千里。第23页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析7 7、阈值的设定、阈值的设定定量定量PCRPCR反应结束时开始对结果进行分析，此时需要划定阈值，也就是在扩增曲线反应结束时开始对结果进行分析，此时需要划定阈值，也就是在扩增曲线的指数期划一条直线，这条线就叫阈值线，在阈值线上，所有的样品的荧光值的指数期划一条直线，这条线就叫阈值线，在阈值线上，所有的样品的荧光值都一致相同，不同的只是所对应的都一致相同，不同的只是所对应的CTCT值和初始模板量！值和初始模板量！阈值的设定要尽量让

28、回归系数最大！阈值的设定要尽量让回归系数最大！图中的虚线即为阈值线第24页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析8.8.熔解曲线分析熔解曲线分析熔解曲线（熔解曲线（meltmelt分析）是指定量分析）是指定量PCRPCR反应结束后让样品继续升温直到反应结束后让样品继续升温直到PCRPCR产物的双链产物的双链全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光，这样荧光值会有一个陡然全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光，这样荧光值会有一个陡然的突降，借以检测的突降，借以检测PCRPCR产物的特异性，相当于进行电泳检测。因为不同的产物的特异性，相当于进行电泳检测。因为不同的PCRPCR产产

29、物片段其物片段其TMTM值不同，单一的双链值不同，单一的双链DNADNA其荧光陡降的温度一致，加入含有非特异其荧光陡降的温度一致，加入含有非特异性扩增产物，那么其荧光陡降的温度不止一个（两个或更多或杂乱无章）。如性扩增产物，那么其荧光陡降的温度不止一个（两个或更多或杂乱无章）。如图：图：特异性强的溶解曲线第25页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析8.8.熔解曲线分析熔解曲线分析第26页/共42页二、操作及结果分析二、操作及结果分析9 9、操作流程、操作流程确立实验方案确立实验方案样品制备样品制备设计引物及探针设计引物及探针预实验预实验标准品及标准曲线的建立标准品及标准曲线的建立定量

30、定量PCRPCR检测检测分析数据分析数据第27页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用1 1、绝对定量分析、绝对定量分析 这是荧光定量这是荧光定量PCRPCR技术的直接应用，可用于检测病毒及细菌的浓度！技术的直接应用，可用于检测病毒及细菌的浓度！第28页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用2 2、相对定量分析及实验方案、相对定量分析及实验方案 基因表达基因表达(gene expression)(gene expression)是指细胞在生命过程中是指细胞在生命过程中,把储存在把储存在DNADNA顺序中遗顺序中遗传信息经过转录和翻译传信息

31、经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子转变成具有生物活性的蛋白质分子.遗传物质遗传物质DNADNA首先首先要把所携带的遗传信息转录成为信使要把所携带的遗传信息转录成为信使RNARNA（mRNAmRNA）,携带遗传信息的携带遗传信息的mRNAmRNA从细胞从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNAmRNA携带的遗传信息被翻译成为携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNADNA完成了表达过程。完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤

32、，所转录的期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNAmRNA的多少直接的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNAmRNA含量多少的分含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。第29页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用2 2、相对定量分析及实验方案、相对定量分析及实验方案 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而

33、无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于RNARNA纯化后得率不同、纯化后得率不同、RNARNA反转录为反转录为cDNAcDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达

34、量恒定的基因，也称奢侈所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有参基因有GAPDHGAPDH基因、基因、-Actin-Actin基因，基因，18srRNA18srRNA基因等。因此，在做基因表达调基因等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。假定在假定在1 1生理时期，生理时期，X X基因的表达量为基因的表达量为X1X1；其内参基因表达量为；其内

35、参基因表达量为Y1Y1；X1/Y1X1/Y1就就将将1 1生理时期的取样、生理时期的取样、RNARNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在样在2 2生理时期，生理时期，X2/Y2X2/Y2就将就将2 2生理时期的取样、生理时期的取样、RNARNA提取、纯化、反转录等过程提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1X1/Y1）/（X2/Y2X2/Y2），所得的值就能就能较为真），所得的值就能就能较为真实的反应在实的反应在1 1、2 2生理时期，生理时期，X X基因的变化情况。基因的变化情况。常用

36、的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-delta CtDelta-delta Ct法。法。第30页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用2 2、相对定量分析及实验方案、相对定量分析及实验方案-双标准曲线法双标准曲线法所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值

37、相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。双标准曲线法思路直观、条理清晰，最大限度的避免了实验的误差，是一种很好的双标准曲线法思路直观、条理清晰，最大限度的避免了实验的误差，是一种很好的分析方法。分析方法。第31页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用2 2Delta-delta CtDelta-delta Ct法法 此法是经定量的数学原理推导而来此法是经定量的数学原理推导而来 该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个

38、基因扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。软存一定的偏差。在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。软件会自动给出两组标准曲线的件会自动给出两组标准曲线的R R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即率，即M M值的差小于值的差小于0.10.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用此法进行相对定量分析。反

39、之，如果中就可以用此法进行相对定量分析。反之，如果M M差值大于差值大于0.10.1，就无法用该方，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于线的斜率差值小于0.10.1，二是换用其它的相对定量方法。，二是换用其它的相对定量方法。第32页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用3 3、SNPSNP检测分析检测分析 基因组基因组DNADNA是生物体各种生理、病理性状的物质基础。人类众多个体的基因是生物体各种生理、病理性状的物质基础。人类众多个体的基因

40、组序列的一致性高达组序列的一致性高达99%99%以上，但个体之间各种性状的差异仍然很大，包括对以上，但个体之间各种性状的差异仍然很大，包括对疾病的易感性、对同一疾病治疗药物的反应性等。在同一生物种群中明显存在疾病的易感性、对同一疾病治疗药物的反应性等。在同一生物种群中明显存在两种以上不同的遗传性状，而且出现频率较高，称为遗传的多态性两种以上不同的遗传性状，而且出现频率较高，称为遗传的多态性(polymorphism)(polymorphism)，而遗传物质，而遗传物质DNADNA的多态性如的多态性如RFLPRFLP、STRSTR、ABOABO血型、血型、HLAHLA和单核和单核苷酸多态性苷酸多

41、态性(single nucleotide polymorphism,SNP)(single nucleotide polymorphism,SNP)是个体间差异的遗传学是个体间差异的遗传学基础。基础。SNPsSNPs是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换(C(C与与T T互换，在其互换，在其互补链上则为互补链上则为G G与与A A互换互换)或颠换或颠换(C(C与与A A，G G与与T T，C C与与G G，A A与与T T互换互换)等变异所引起等变异所引起的的DNADNA序列多态性。序列多态性。SNPSNP是人类可遗传的变异中最常见的一种是

42、人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态占所有已知多态性的性的90%90%以上。以上。SNPSNP在人类基因组中广泛存在，平均每在人类基因组中广泛存在，平均每50050010001000个碱基对中就个碱基对中就有有1 1个，估计其总数可达个，估计其总数可达300300万个甚至更多。万个甚至更多。第33页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用3 3、SNPSNP检测分析检测分析 通常所说的通常所说的SNPSNP都是二等位多态性的，转换的发生率总是明显高于都是二等位多态性的，转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的其它几种变异，具有转换型变异的SNP

43、SNP约占约占2/32/3，其它几种变异的发生，其它几种变异的发生几率相似。转换的几率之所以高，可能是因为几率相似。转换的几率之所以高，可能是因为CpGCpG二核苷酸上的胞嘧啶二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在基因组在基因组DNADNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNPSNP既有可能在既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于基因序列内，也有可能在基因以外的非

44、编码序列上。总的来说，位于编码区内的编码区内的SNP(cSNP)SNP(cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的列的1/51/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNPcSNP的研究的研究更受关注。更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNPcSNP又可分为又可分为2 2种：一种是同种：一种是同义义cSNP(synonymous cSNP),cSNP(synonymous cSNP),即即SNPSNP所致的编码序列的改变并不影响其所所致的编码序

45、列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP),cSNP(non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使以指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNPcSNP中约有一半为非同义中约有一半为非同义cSNPcSNP。第34页/共42页三、

46、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用3 3、SNPSNP检测分析检测分析SNP检测（1）.对未知SNP 进行分析,即找寻未知的SNP 或确定某一未知SNP 与某遗传病的关系。最有效的方法是对那些含有SNP 的DNA 链进行测序，确认突变的位置和碱基类别。（2）.对对已知SNP 进行分析,也就是基因分型，即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。比较成熟的技术有Taqman探针法，尤其适合样品量特别大的情况。第35页/共42页三、荧光定量三、荧光定量PCRPCR技术的技术的应用应用3 3、SNPSNP检测分析检测分析 根据已知的根据已知的SNP

47、SNP位点变化设计出两种不同的探针，一种和野生型完全匹配，位点变化设计出两种不同的探针，一种和野生型完全匹配，一种和突变型完全匹配；每一个样品都平行的做两次荧光定量一种和突变型完全匹配；每一个样品都平行的做两次荧光定量PCRPCR检测，一次检测，一次添加野生型探针，一次添加突变型探针；针对特定的添加野生型探针，一次添加突变型探针；针对特定的SNPSNP位点，进行荧光定量位点，进行荧光定量PCRPCR反应。由于反应。由于SNPSNP位点碱基的不同，所以扩增结果也有差异。探针序列和模板位点碱基的不同，所以扩增结果也有差异。探针序列和模板序列完全匹配时，扩增曲线正常；探针序列和模板不完全匹配时，扩增

48、曲线不序列完全匹配时，扩增曲线正常；探针序列和模板不完全匹配时，扩增曲线不起跳，或者荧光量很弱起跳，或者荧光量很弱CtCt值很大；当样品为杂合子时，由于样品中含有和两种值很大；当样品为杂合子时，由于样品中含有和两种探针序列匹配的模板，所以此时扩增曲线几乎完全重合。这种差异就反映在扩探针序列匹配的模板，所以此时扩增曲线几乎完全重合。这种差异就反映在扩增曲线上。如图：增曲线上。如图：野生型杂合型纯合型第36页/共42页荧光定量荧光定量PCRPCR图片图片第37页/共42页荧光定量荧光定量PCRPCR图片图片第38页/共42页荧光定量荧光定量PCRPCR图片图片第39页/共42页荧光定量荧光定量PCRPCR图片图片第40页/共42页