色谱聚焦亲和色谱.pptx

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1、会计学1色谱聚焦亲和色谱色谱聚焦亲和色谱第一页，编辑于星期二：八点 十三分。第1页/共71页第二页，编辑于星期二：八点 十三分。第2页/共71页第三页，编辑于星期二：八点 十三分。第3页/共71页第四页，编辑于星期二：八点 十三分。第4页/共71页第五页，编辑于星期二：八点 十三分。第5页/共71页第六页，编辑于星期二：八点 十三分。第三节第三节 PB与与PBE一、一、PBPB（polybufferpolybuffer）-多组分缓冲液多组分缓冲液为分子量不同的多羧基多氨基化合物（两性电解质性缓冲剂）特点：.I I不高，但缓冲力强；不高，但缓冲力强；.缓冲能力是均匀的。第6页/共71页第七页，编

2、辑于星期二：八点 十三分。二、二、PBE(polybuffer exchange)PBE(polybuffer exchange)PBE(polybuffer exchange)PBE(polybuffer exchange)多缓冲交换剂多缓冲交换剂以交联琼脂糖Sepharose CL-6B为基质，并在糖上通过醚键偶合上配基而成 如低聚乙烯亚胺要求：确保很宽的pH范围有均衡的缓冲容量。第7页/共71页第八页，编辑于星期二：八点 十三分。第四节第四节第四节第四节 实验要点实验要点实验要点实验要点步骤步骤样品样品pIpI的查阅或测定的查阅或测定选选PBEPBE，PBPB和起始缓冲液和起始缓冲液装柱

3、，平衡装柱，平衡安装仪器（增安装仪器（增pHpH计）计）加加PBPB少量入柱少量入柱第8页/共71页第九页，编辑于星期二：八点 十三分。加样加样加加PBPB洗脱洗脱 再生再生 PBE PBE 洗脱液洗脱液 脱脱PBPB一、一、PBEPBE，PBPB和起始缓冲液的选择和起始缓冲液的选择.查查pIpI或测定或测定.由由pIpI确定确定pHpH梯度范围梯度范围 最大范围最大范围 3 33.53.5第9页/共71页第十页，编辑于星期二：八点 十三分。为提高Rs,选择的pH范围应含要分离样品pI，并使其有2/31/2的柱长的吸附解吸时间。.由产品性能表选择由产品性能表选择.PBE94PBE94.选始缓冲

4、液选始缓冲液pH9.4pH9.4，乙醇胺乙醇胺-HAC HAC （0.0250.025）.选PB96 用HCl调pH7.0第10页/共71页第十一页，编辑于星期二：八点 十三分。二、二、装柱装柱.PBEPBE量量由样品量确定由样品量确定PBEPBE量量一般一般100100mgpr/10mlmgpr/10ml床体积、每床体积、每pHpH单位单位 .柱选择柱选择H/D=30H/D=306060.充填（同前）充填（同前）.平衡平衡 用始缓平衡，要求：用始缓平衡，要求：.缓冲液使用前应先脱气，以除去其中缓冲液使用前应先脱气，以除去其中COCO2 2.需平衡到进出液需平衡到进出液pHpH、I I、电导都

5、一样。电导都一样。.校验校验 柱装好坏，用有色的牛细胞色素柱装好坏，用有色的牛细胞色素C C检查。检查。第11页/共71页第十二页，编辑于星期二：八点 十三分。三、三、样品样品.V VS S因聚焦浓缩效应，VS最大可达50%2Vt但最好0.5Vt.I I0.050.05.加样加样要求：.上样前应先加上样前应先加5 5mlPBmlPB，以免以免 .需使样品均匀平整加在床面上第12页/共71页第十三页，编辑于星期二：八点 十三分。四、洗脱.洗脱剂用量洗脱剂用量 pH 取决于洗脱剂浓度 梯度 浓度大，峰间距小 范围 浓度小，峰宽大 梯度体积 一般：1213Vt第13页/共71页第十四页，编辑于星期二

6、：八点 十三分。.流速流速一般线速在3040cm/hr.检测检测主要是目的物浓度、pH五、五、PBPB的除去的除去1.1.沉淀法：加硫铵，再透析沉淀法：加硫铵，再透析 2.凝胶过滤：常用SephadexG-75第14页/共71页第十五页，编辑于星期二：八点 十三分。六、再生 一般：.先除去吸附的杂质 对 pI 6，在 柱 顶，可 用1mol/LNaCl 对pI很小，可用0.1mol/LHCl .用起始缓冲液平衡七、七、保存保存 24%乙醇第15页/共71页第十六页，编辑于星期二：八点 十三分。八、八、结果讨论结果讨论.顶替（取代）效应 带电量除与pI有关，还与滴定曲线有关，B在pH更高才被吸附

7、（如下图所示）静静电电荷荷+-ABpHpH洗脱洗脱VIIpH第16页/共71页第十七页，编辑于星期二：八点 十三分。后期后期I I的增加的增加 出现竞争性结合出现竞争性结合 影响影响B B类分子的吸附类分子的吸附 造成造成B B类分子提前洗脱类分子提前洗脱.陶南效应（阴陶南效应（阴IEIE）因表观因表观pIpI下降，出现滞后洗脱。下降，出现滞后洗脱。.溶解度溶解度造成滞后洗脱造成滞后洗脱因因pH pIpH pI时时S S，往往需更低往往需更低pHpH时，时，其其S S，才被洗出。才被洗出。第17页/共71页第十八页，编辑于星期二：八点 十三分。第五节第五节第五节第五节 技术的应用技术的应用技术

8、的应用技术的应用zz蛋白质类（包括酶）的分离zz蛋白质类（包括酶）等电点测定zzP175-177第18页/共71页第十九页，编辑于星期二：八点 十三分。第七章第七章 亲和色谱亲和色谱 Affinity Chromatography,ACAffinity Chromatography,ACAffinity Chromatography,ACAffinity Chromatography,AC 第一节第一节 概述概述原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、一、特点特点高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性第19页/共71页第二十页，编辑于星期二：八点

9、十三分。二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质；基于生物功能可把有活性与无活性分开三、三、基本过程基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）第20页/共71页第二十一页，编辑于星期二：八点 十三分。第21页/共71页第二十二页，编辑于星期二：八点 十三分。亲和层析法的作用原理示意第22页/共71页第二十三页，编辑于星期二：八点 十三分。说明：说明：1.1.偶联用偶联用GelGel（须是活化偶联介质）须是活化偶联介质）2.2.亲和吸附剂亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂类专一亲和吸附剂3.3.按相互作用力划分：按相互作用力划分：次级键次级键亲和色谱亲和色谱配

10、位键配位键螯合色谱螯合色谱共价键共价键共价色谱共价色谱疏水键疏水键疏水色谱疏水色谱第23页/共71页第二十四页，编辑于星期二：八点 十三分。亲和层析的必要条件:n n 合适的配体（配基、ligand)n n 合适的载体（Matrix)n n 合适的吸附和洗脱条件第24页/共71页第二十五页，编辑于星期二：八点 十三分。第二节 亲和色谱配基亲和色谱配基(ligandLligandL)作为配体的条件 亲和力大亲和力大;具有解离平衡具有解离平衡;与载体偶联不失活与载体偶联不失活常用系统酶酶:底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸核酸:互补顺序、组蛋白

11、、结合蛋白、核酸多聚物互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素激素:受体、运载蛋白受体、运载蛋白抗体抗体:抗原、病毒、细胞抗原、病毒、细胞外源凝集素外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞多糖、糖蛋白、细胞第25页/共71页第二十六页，编辑于星期二：八点 十三分。配体的浓度n n 一般使用较高的固定化配体浓度一般使用较高的固定化配体浓度n n 配体亲和力高，且本身带电则浓度配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低须降低n n 配体浓度过高引起色谱畸变。配体浓度过高引起色谱畸变。(与很与很多物质发生非特异性结合多物质发生非特异性结合)第26页/共71页第二十七页，编辑于星期二：八点 十三分。配体的选择配体的

12、选择1.考虑亲和势L+SLSKl=LS/LS要求Kl在10-410-8mol/L之间2.与L的偶联不破坏L与S的结合3.需了解L-S的作用机制 如 第27页/共71页第二十八页，编辑于星期二：八点 十三分。n n例：酶例：酶 有单底物反应、双底物有单底物反应、双底物反应反应n n单单 A P E E EA EP 底物A、产物P或它们的类似物都可以第28页/共71页第二十九页，编辑于星期二：八点 十三分。双底物依次双底物依次n n A B P Q E E EA EAB EPQ EQ 须选择A、若选B则吸附时须加A第29页/共71页第三十页，编辑于星期二：八点 十三分。双底物随机双底物随机n n

13、A（B）B（A）P（Q）Q（P）E E EA EA（B）EPQ A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。第30页/共71页第三十一页，编辑于星期二：八点 十三分。第三节第三节 亲和层析载体亲和层析载体一、作为载体的条件一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好第31页/共71页第三十二页，编辑于星期二：八点 十三分。二、载体的选择二、载体的选择二、载体的选择二、载体的选择 1.1.琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：亲水性强，理化性质稳定亲水性强，理化性质稳定 （商品名：（商品名：SepharoseSepharose）2.2.聚丙

14、烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，抗微生物能力抗微生物能力强，强，特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。3.3.葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶：有良好的化学及物理性质，孔径小。有良好的化学及物理性质，孔径小。4.4.纤维素：纤维素：非特异吸附严重，廉价，易得。非特异吸附严重，廉价，易得。5.5.多孔玻璃多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。：物理性能好，有非特异性吸附。第32页/共71页第三十三页，编辑于星期二：八点 十三分。三、手臂（Spacerarm）在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，

15、减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。示意图如下：第33页/共71页第三十四页，编辑于星期二：八点 十三分。第34页/共71页第三十五页，编辑于星期二：八点 十三分。n n连接臂往往为烃链的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大连接臂往往为烃链的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大*）或具氨基、羧）或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）n n疏水性手臂具体选择应考虑：疏水性手臂具体选择应考虑：分离物质分子量大小分离物质分子量大小 亲和势大小亲和势大小 过长手臂易弯曲、折叠等过长手臂易弯曲、折叠等n n最常用的连接臂有最常用的连接臂有6-6-氨基己酸、

16、氨基己酸、1,6-1,6-己二胺和己二胺和3,3-3,3-二氨基二丙胺。二氨基二丙胺。第35页/共71页第三十六页，编辑于星期二：八点 十三分。第36页/共71页第三十七页，编辑于星期二：八点 十三分。表7.3 接有连接臂的亲和层析用载体载体连接臂供应商琼脂糖3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基Bio-Rad3,3-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基Bio-Rad1,2-二氨基乙烷,1-二氨基己烷,3,3-二氨基二丙胺ICN1,6-己二胺,6-氨基己酸Pharmacia3,3-二氨基丙基胺,对苯甲酰基-3,3-二氨基丙基胺Serva氨基烷基(2,4,6,8,10)Miles聚丙烯酰胺-琼脂糖1,6-己二胺,

17、6-氨基己酸IBF多孔玻璃氨基丙基,氨基己基Merck第37页/共71页第三十八页，编辑于星期二：八点 十三分。四、四、四、四、偶联用偶联用偶联用偶联用Gel.CNBr活化型 Sepharose 第38页/共71页第三十九页，编辑于星期二：八点 十三分。溴化氰对多糖类载体的活化反应 溴化氰活化多糖的配体偶联反应 第39页/共71页第四十页，编辑于星期二：八点 十三分。溴化氰法的特点：活化效率高，速度快，配体结合量大，毒性大。（废液可用碱性硫酸亚铁中和）主要影响因素：活化：CNBr的用量，pH，温度，时间偶联：配体的用量，pH，温度，时间，封闭第40页/共71页第四十一页，编辑于星期二：八点 十

18、三分。第41页/共71页第四十二页，编辑于星期二：八点 十三分。环氧活化型Sepharose环氧氯丙烷法的特点：环氧氯丙烷法的特点：活化效率低，速度慢，重复性较差活化效率低，速度慢，重复性较差毒性低，可引入亲水手臂，易操作毒性低，可引入亲水手臂，易操作第42页/共71页第四十三页，编辑于星期二：八点 十三分。氨基琼脂糖氨基琼脂糖羧基琼脂糖羧基琼脂糖第43页/共71页第四十四页，编辑于星期二：八点 十三分。五、类专一性亲和吸附剂类专一性亲和吸附剂.固定化凝集素（本质是蛋白质）可用来分离糖、糖蛋白如.固定化多聚核苷酸可用来分离NA、核蛋白如.染料亲和吸附剂以染料为配基，用来分离酶类、干扰素等 第4

19、4页/共71页第四十五页，编辑于星期二：八点 十三分。第45页/共71页第四十六页，编辑于星期二：八点 十三分。第四节第四节第四节第四节 亲和吸附剂的制备亲和吸附剂的制备亲和吸附剂的制备亲和吸附剂的制备一、要求.L与基质结合，对L-S结合无干扰；.L为小分子有的需“手臂”，使L-S结合更有效；.非专一吸附不大，以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。第46页/共71页第四十七页，编辑于星期二：八点 十三分。二、二、偶联用Gel的选择需考虑：.L上可供偶联的基团.“手臂”.L的稳定pH三、由CNBr活化型Sep.4B制备商品名：CNBr-Sepharose第47页/共71页第四十八页

20、，编辑于星期二：八点 十三分。一般步骤：一般步骤：一般步骤：一般步骤：冻干粉冻干粉溶胀洗涤溶胀洗涤混合反应混合反应掩蔽掩蔽溶解溶解LL 洗去洗去L L（未结合）未结合）成品成品 第48页/共71页第四十九页，编辑于星期二：八点 十三分。亲和吸附剂的制备过程 第49页/共71页第五十页，编辑于星期二：八点 十三分。.溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子.偶联条件注意：前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH.掩蔽偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。.洗去未结合L用高-低交叉pH来洗（45次）第50页/共71页第五十一页，编辑于星期二

21、：八点 十三分。四四、由氨基-Sep或羧基-Sep制备Sep-(CH2)6-NH2L-COOHAH-SepSep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：第51页/共71页第五十二页，编辑于星期二：八点 十三分。还有多种方法可以完成琼脂糖多糖载体活化和配体还有多种方法可以完成琼脂糖多糖载体活化和配体偶联过程偶联过程 ,如如:双环氧法等双环氧法等 p140-145 p140-145 双环氧法制备亲和吸附剂的原理 第52页/共71页第五十三页，编辑于星期二：八点 十三分。其他亲和吸附剂其他亲和吸附剂n n聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛法和肼解法活化,

22、然后再将含氨基的配体固定到其活化基团上;n n硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载体引入氨基或环氧基团.第53页/共71页第五十四页，编辑于星期二：八点 十三分。第五节第五节一般实验方法一般实验方法一般实验方法一般实验方法是否有类专一吸附剂是否有类专一吸附剂有有 溶胀溶胀GelGel无无选选L L选偶联选偶联GelGel 偶联偶联L L装柱装柱第54页/共71页第五十五页，编辑于星期二：八点 十三分。安装仪器安装仪器安装仪器安装仪器 平衡（平衡（平衡（平衡（2 23 3V Vt t）加样吸附加样吸附加样吸附加样吸附 洗去非吸附物洗去非吸附物洗去非吸附物洗去

23、非吸附物亲和柱亲和柱亲和柱亲和柱洗脱液洗脱液洗脱液洗脱液 再生再生再生再生 脱盐脱盐脱盐脱盐 第55页/共71页第五十六页，编辑于星期二：八点 十三分。一、亲和吸附柱的预备.亲和吸附剂选择或制备亲和吸附剂选择或制备效能小试：效能小试：据资料等先选择始缓冲液种类、据资料等先选择始缓冲液种类、I I、pHpH、t t .用用1010V Vt t始始缓缓洗洗，若若目目的的物物未未流流出出，说说明明吸吸附附性性能能好，好，0.90.9.不断加样到目的物流出，确定吸附容量不断加样到目的物流出，确定吸附容量.柱柱H/DH/D高度专一高度专一短短类专一类专一长长 平衡平衡 一般一般2 23 3V Vt t始

24、缓始缓 第56页/共71页第五十七页，编辑于星期二：八点 十三分。二、二、加样吸附.样品平衡（透析或SephadexG-25）.样品体积Vs（一般5%）若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小.洗去非吸附物（10Vt始缓洗）三、洗脱（以S不变性为前提）类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、梯度或阶式洗脱。第57页/共71页第五十八页，编辑于星期二：八点 十三分。高专一：专一洗脱、无分级分离要求、单成分洗脱.pH变化（破坏静电引力）.I变化（减弱静电引力、范德华力）.亲和洗脱L的类似物L，S的类似物S*采用酶促反应的多元专一性洗脱.表面活性剂减少疏水作用、范德华力 种类常有：曲通X100 1%（V/

25、V）、乙二醇等 第58页/共71页第五十九页，编辑于星期二：八点 十三分。.解离试剂主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等.降低温度t较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力.电泳解吸+在柱两端连上电极进行电泳四、脱盐-五、再生 第59页/共71页第六十页，编辑于星期二：八点 十三分。*采用酶促反应的多元专一性洗脱采用酶促反应的多元专一性洗脱采用酶促反应的多元专一性洗脱采用酶促反应的多元专一性洗脱 三元复合物 两元专一性 负洗脱 E+A EA+B EAB A AE A -A洗脱 A 三元复合物 三元专一性 正洗脱 E+A EA+B EAB +A +C洗脱 C AE A EAC A C EAC第60页/共71

26、页第六十一页，编辑于星期二：八点 十三分。E=乳糖合成酶A蛋白 B=-乳清蛋白 E+A EA+B EAB A=N 乙酰 D 氨基葡萄糖两元专一性实例两元专一性实例负洗脱负洗脱第61页/共71页第六十二页，编辑于星期二：八点 十三分。三元专一三元专一性实例性实例正洗脱A=NAD+B=AMP C=Py E=LDH第62页/共71页第六十三页，编辑于星期二：八点 十三分。第第六六节节其它亲和色谱简介一、共价色谱利用形成和破坏共价键能力的差异分离其共价键常为二硫键S-S主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽基本层析过程第63页/共71页第六十四页，编辑于星期二：八点 十三分。第64页/共71页第六十五页

27、，编辑于星期二：八点 十三分。二、二、疏水色谱将疏水的L连到Gel上作用力蛋白质的疏水区与疏水性配基间形成疏水键 可高盐上柱，低盐洗脱或高温上，低温洗。第65页/共71页第六十六页，编辑于星期二：八点 十三分。三、螯合色谱三、螯合色谱原理HisCysTrp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。固定方法：将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂偶联成配基，再用金属离子处理。如 洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA 原原理理第66页/共71页第六十七页，编辑于星期二：八点 十三分。第67页/共71页第六十八页，编辑于星期二：八点 十三分。第68页/共71页第六十九页，编辑于星期二：八点 十三分。四四、有机染料亲和色谱(p158)原理 有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。第69页/共71页第七十页，编辑于星期二：八点 十三分。第七节第七节 应用应用（p161-166)p161-166)抗体和抗原的纯化 酶的纯化 糖蛋白和脂蛋白的纯化 其它蛋白质 细胞的纯化第70页/共71页第七十一页，编辑于星期二：八点 十三分。