第5章酶1教学ppt课件.ppt

《第5章酶1教学ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第5章酶1教学ppt课件.ppt（93页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第第5 5章酶章酶1 1酶的概念酶的概念酶的命名与分类酶的命名与分类酶的化学本质酶的化学本质酶的结构与功能的关系酶的结构与功能的关系酶作用的专一性酶作用的专一性酶作用的机理酶作用的机理酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素酶活力的测定酶活力的测定酶的应用酶的应用酶的制备酶的制备例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：3.3.水解酶水解酶(hydrolase):(hydrolase):催化底物的加水分解反应。催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及

2、脂酶等。4.4.裂解酶类：裂解酶类：催化非水解性地除去底物中的基团的反应或催化非水解性地除去底物中的基团的反应或其逆反应。其逆反应。CC键CH3C=OCOOHCH3C=OH+CO2脱羧酶丙酮酸乙醛CO键CH2COOHHOCHCOOHHCCOOHHOOCCH+H2O2-羟基丁二酸延胡索酸反丁烯二酸水合酶CN键COOHCHNH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH36.6.合成酶类合成酶类：又称：又称连接酶，能够催化连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-NC-N以及以及C-SC-S键的形成反应。这类反应必须与键的形成反应。这类反应必须与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶

3、联。A+B+ATPAB+ADP+Pi5.5.异构酶异构酶：催化各种同分异构体的相互转化，即底物分催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。子内基团或原子的重排过程。例如，例如，6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖6-磷酸果糖磷酸果糖己糖磷酸异构酶己糖磷酸异构酶OCH2OHHOOHOHOHP123456OCH2OHOCH2POHOHOH三、酶的化学本质(一一)大多数酶是蛋白质大多数酶是蛋白质酶是蛋白质的证据：酶是蛋白质的证据：19811981年年CechCech发现发现RNARNA具有催化功能具有催化功能核酶核酶。对热不稳定对热不稳定;两性电解质两性电解质;变性因素与蛋白质相同变性因素

4、与蛋白质相同;有胶体特性有胶体特性;蛋白水解酶使之失活蛋白水解酶使之失活;已获得结晶的酶已获得结晶的酶;序列分析。序列分析。(二二)酶的组成酶的组成酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶(全酶全酶)=)=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶:与酶蛋白结合得比较松与酶蛋白结合得比较松并可用透析方法除去并可用透析方法除去辅基辅基:与酶蛋白结合牢固与酶蛋白结合牢固,不能用透析方法除去不能用透析方法除去金属激活剂金属激活剂:金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于蛋白质部分，辅因子通常是酶的催化专一性主要决定于蛋白质部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。作为

5、电子、原子或某些化学基团的载体。金属离子的作用1.1.稳稳定定构构象象：稳稳定定酶酶蛋蛋白白催催化化活活性性所所必必需需的的分分子子构构象；象；2.2.构构成成酶酶的的活活性性中中心心：作作为为酶酶的的活活性性中中心心的的组组成成成成分，参与构成酶的活性中心；分，参与构成酶的活性中心；3.3.连连接接作作用用：作作为为桥桥梁梁，将将底底物物分分子子与与酶酶蛋蛋白白螯螯合合起来。起来。金属离子以配合物的形式发挥作用大部分的辅酶与辅基衍生于维生素。大部分的辅酶与辅基衍生于维生素。维生素的重要性就在于维生素的重要性就在于它们是体内一些重要的代谢酶的辅酶或辅基的组成成分。它们是体内一些重要的代谢酶的辅

6、酶或辅基的组成成分。辅酶与辅基的来源及其生理功用维生素可按其溶解性的不同分为维生素可按其溶解性的不同分为脂溶性脂溶性维生素和维生素和水水溶性溶性维生素两大类。维生素两大类。脂溶性维生素：有脂溶性维生素：有VitAVitA、VitDVitD、VitEVitE和和VitKVitK四种。四种。水溶性维生素：有水溶性维生素：有VitB1VitB1，VitB2VitB2，VitPPVitPP，VitB6VitB6，VitB12VitB12，VitCVitC，泛酸，生物素，叶酸等。，泛酸，生物素，叶酸等。维生素B族几乎全部参与辅酶的形成B B族维生素及其辅酶形式族维生素及其辅酶形式CoACoA或或CoA-

7、SHCoA-SH的分子结构泛酸泛酸CH3CSCoAOFMN和FAD的分子结构核核黄黄素素(VitB2)异咯嗪异咯嗪氧化型氧化型2H2HHH还原型还原型2H2HNAD+(辅酶I)和NADP+(辅酶II)的分子结构尼克酰胺尼克酰胺在体内，由尼克酰在体内，由尼克酰胺参与构成的两种胺参与构成的两种辅酶均有氧化型辅酶均有氧化型(NAD(NAD+，NADPNADP+)和和还原型还原型(NADH+H(NADH+H+，NADPH+HNADPH+H+)两种形两种形式。式。(三三)单体酶、寡聚酶和多酶复合物单体酶、寡聚酶和多酶复合物1.1.单体酶单体酶(monomeric enzyme)(monomeric en

8、zyme)：一般是由一条多肽链组成，全部为参与水解反应的水解酶一般是由一条多肽链组成，全部为参与水解反应的水解酶。2.2.寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)：由两个或两个以上亚基组成，这些亚基可以是相同的，也由两个或两个以上亚基组成，这些亚基可以是相同的，也可以是不同的。亚基之间以非共价键连接，可以是不同的。亚基之间以非共价键连接，单个亚基没有催化单个亚基没有催化活性。活性。一些寡聚酶是调节酶，在代谢调控中起重要作用。一些寡聚酶是调节酶，在代谢调控中起重要作用。3.3.多酶复合物多酶复合物(multienzyme system)(multi

9、enzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。例如几个酶镶嵌而成的复合物。例如,丙酮酸脱氢酶系：丙酮丙酮酸脱氢酶系：丙酮酸脱羧酶酸脱羧酶(E(E)、硫辛酸乙酰移换酶、硫辛酸乙酰移换酶(E(E)和二氢硫辛酰脱氢酶和二氢硫辛酰脱氢酶(E(E)。中间物中间物2 2 中间物中间物2 2酶酶2 2底物底物1中间物中间物1 1中间物中间物1 1 底物底物1 酶酶1 1底物底物2产物产物酶酶3 3这些酶催化底物通过一系列顺序反应转化为产物。这些酶催化底物通过一系列顺序反应转化为产物。四、酶的结构与功能的关系(一一)活性部位和必需基团活性部位和必需基团必需基团必需基团：这些基团与酶的活性有关，若经化学

10、修饰使：这些基团与酶的活性有关，若经化学修饰使这些基团改变，则酶的活性丧失。这些基团改变，则酶的活性丧失。活性中心活性中心：酶分子上具：酶分子上具有一定空间构象有一定空间构象的部位，该部位的部位，该部位化学基团化学基团集中，直接与底物结合，参与将底物转变为产集中，直接与底物结合，参与将底物转变为产物的反应过程。物的反应过程。必需基团必需基团活性中心活性中心维持酶的空间结构维持酶的空间结构结合基团结合基团专一性专一性催化基团催化基团催化性质催化性质酶的活性中心示意图酶的活性中心示意图 酶的活性中心都位酶的活性中心都位于酶分子的表面呈裂于酶分子的表面呈裂缝状缝状(疏水口袋疏水口袋),),该部该部位

11、有些必需基团虽然位有些必需基团虽然在一级结构上可能相在一级结构上可能相距很远，但在空间结距很远，但在空间结构上彼此靠近，形成构上彼此靠近，形成具有一定空间结构的具有一定空间结构的区域。区域。(二二)酶原的激活酶原的激活 某些酶在最初合成和分泌时是没有催化活性的，只有某些酶在最初合成和分泌时是没有催化活性的，只有在一定条件下经适当物质作用可转变成有活性的酶，酶在一定条件下经适当物质作用可转变成有活性的酶，酶的这种最初没有活性的前体称为的这种最初没有活性的前体称为酶原酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活酶原的激活。酶原酶原的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改

12、变。的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改变。这个过程这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。酶原激活的生理意义酶原激活的生理意义 1 1、作为酶的贮存形式；、作为酶的贮存形式；2 2、保护自身组织细胞不被酶水解消化。、保护自身组织细胞不被酶水解消化。例如，胰蛋白酶原的激活肠激酶或肠激酶或胰蛋白酶胰蛋白酶(三三)同工酶同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。一组酶。l 能催化相同的

13、化学反应是因为同工酶的活性能催化相同的化学反应是因为同工酶的活性部位的结构相同或者至少非常相似。部位的结构相同或者至少非常相似。l 同工酶不仅存在于同一个体的不同组织中，同工酶不仅存在于同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞的不同亚细胞结构中。甚至同一组织、同一细胞的不同亚细胞结构中。乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)(LDH)有有五种同工酶五种同工酶，都由四个亚基组成。，都由四个亚基组成。其亚基可以分为两型：其亚基可以分为两型：骨骼肌型骨骼肌型(M)(M)和心肌型和心肌型(H)(H)。催化同一化学反应催化同一化学反应CH3CHCOO-+NAD+CH3CCOO-+NADH+H+OHO五、酶作

14、用的专一性酶作用的酶作用的专一性专一性结构专一性结构专一性立体异构专一性立体异构专一性族族(基团基团)专一性专一性绝对专一性绝对专一性一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，这种选择性作用称为酶的专一性。质，这种选择性作用称为酶的专一性。绝对专一性绝对专一性：只能作用于某一底物。只能作用于某一底物。1.1.结构专一性结构专一性:族专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。例如可作用于一类或一些结构很相似的底物。例如酯酶酯酶,-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶,蛋白酶。蛋白酶。OCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2

15、OOCH2OHOHOHOHOH15+ROHRCOO+R OH+H+酯酶酯酶：RCOR+H2OO脲酶脲酶：H2NCNH2+H2OO2NH3+CO22 2立体异构专一性立体异构专一性:酶对底物立体构型有特异的要求。立体酶对底物立体构型有特异的要求。立体异构专一性异构专一性包括包括旋光异构专一性旋光异构专一性和和几何异构专一性几何异构专一性。(2)(2)几何异构专一性几何异构专一性 延胡素酸延胡素酸(反式反式)苹果酸苹果酸 顺顺-丁烯二酸丁烯二酸延胡素酸酶延胡素酸酶延胡素酸酶延胡素酸酶(1)(1)旋光异构专一性旋光异构专一性:例如例如:L-L-乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶,它的底物只能是它的底物只能是L-L

16、-型乳酸，而不能是型乳酸，而不能是D-D-型乳酸。催化乳酸脱氢生成丙酮酸的反应如下型乳酸。催化乳酸脱氢生成丙酮酸的反应如下 酶如何使反应的活化能降低？酶如何使反应的活化能降低？酶和一般催化剂的作酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应用就是降低化学反应所需的活化能，从而所需的活化能，从而使活化分子数增多，使活化分子数增多，反应速度加快。反应速度加快。六、酶的作用机理(一一)酶的催化作用与分子活化能酶的催化作用与分子活化能(二二)中间产物学说中间产物学说中间产物存在的证据中间产物存在的证据(P101(P101102)102)ESES的形成，改变了原来反应的途径，使底物的活化能的形成，改变了原来反应的

17、途径，使底物的活化能大大降低，从而使反应速度加快。大大降低，从而使反应速度加快。酶与底物如何结合成中间产物？又如何完成其催化作用？酶与底物如何结合成中间产物？又如何完成其催化作用？酶催化时，酶活性中心首先与底物酶催化时，酶活性中心首先与底物(Substance)(Substance)结合结合生成生成酶酶-底物复合物底物复合物(ES)(ES)，此复合物再分解释放出酶，此复合物再分解释放出酶，并生成产物并生成产物(Product)(Product)。E+SESE+P相关的学说有相关的学说有锁钥学说锁钥学说诱导契合学说诱导契合学说酶与底物的过渡态互补酶与底物的过渡态互补(三三)诱导契合学说诱导契合学

18、说当底物与酶接近时，底物分子可以诱导酶活性中心的构当底物与酶接近时，底物分子可以诱导酶活性中心的构象发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象。象发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象。(四四)使酶具有高催化效率的因素使酶具有高催化效率的因素1 1底物与酶的底物与酶的“靠近靠近”与与“定向定向”；2 2张力学说：酶的活性中心与底物结合后，底物分子中不张力学说：酶的活性中心与底物结合后，底物分子中不稳定的化学键受到牵拉或变形，从而易于断裂；稳定的化学键受到牵拉或变形，从而易于断裂；3 3酸碱催化酸碱催化(多元催化多元催化)：酶蛋白中有好几种可以起广义酸：酶蛋白中有好几种可以起广义酸碱催化

19、作用的功能基团，如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪碱催化作用的功能基团，如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等；唑基等；4 4共价催化：底物与酶形成反应活性很高的共价中间物，共价催化：底物与酶形成反应活性很高的共价中间物，大大降低反应活化能；大大降低反应活化能；5 5表面效应：活性中心多为表面效应：活性中心多为“疏水口袋疏水口袋”，低介电环境中，低介电环境中的基团之间的反应会得到加强。的基团之间的反应会得到加强。七、酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素酶促反应速度的表示方法？酶促反应速度的表示方法？影响酶促反应速度的因素有哪些？影响酶促反应速度的因素有哪些？10 20 30 40 50 min产物

20、生成量酶反应过程曲线(一一)酶促反应速度的测量酶促反应速度的测量酶促反应速度表示：酶促反应速度表示：一定时间内底物减少的量；一定时间内底物减少的量；一定时间内产物生成的量。一定时间内产物生成的量。随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降，原因：随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降，原因：底物浓度下降底物浓度下降酶在一定酶在一定pHpH及温度下失活及温度下失活产物对酶的抑制，产物的生成加速逆反应的进行。产物对酶的抑制，产物的生成加速逆反应的进行。所以研究酶促反应速度以酶促反应的初速度为准。所以研究酶促反应速度以酶促反应的初速度为准。(二二)酶浓度对酶作用的影响酶浓度对酶作用的影响在有在有足够

21、底物足够底物和其他条件不变的情况下：和其他条件不变的情况下：v=k E(三三)底物浓度对酶作用的影响底物浓度对酶作用的影响1.1.底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响在在EE、T T和和pHpH等恒定时，等恒定时，SS对对反应速度的影响呈反应速度的影响呈矩形双曲线矩形双曲线.从左图可知：从左图可知：1.在在S较低较低时，时，v和和S的增加的增加呈正比关系呈正比关系，表，表现为现为一级反应一级反应。v=kS 2.当当S较高较高时，反应速时，反应速度增加的幅度不断下降度增加的幅度不断下降,表现为表现为混合级反应。混合级反应。3.当当S增加到一定限度增加到一定限度时时,v不再增加，不

22、再增加，表现为表现为0级反应。级反应。v=kEtEt代表酶的总浓度代表酶的总浓度图图 S S对对V V的影响的影响用用中间产物学说中间产物学说解释解释SS与与v关系曲线的二相现关系曲线的二相现象：象：u当当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间产物随着底物浓度的增加，中间产物(ES)的浓度不断增的浓度不断增加，反应速度亦随之增加。加，反应速度亦随之增加。u当当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成ES，虽增加底物浓度也不会有更多的，虽增加底物浓度也不会有更多的ES生成，因而生成，因而

23、反应速度不变。反应速度不变。S +EESE+Pk1k2k32.2.米氏方程式米氏方程式设 Km=k2+k3k1v=Vmax SKm +S(米氏方程式米氏方程式)MichaelisMichaelis和和MentenMenten根据中间产物学说推导出能表示整个反根据中间产物学说推导出能表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的方程式，称为米氏方程应中底物浓度和反应速度关系的方程式，称为米氏方程.当当 SKm时，时，v=S,v S,符合一级反应；符合一级反应；VmaxKm(米氏常数米氏常数)S +EESE+Pk1k2k3当当 SKm时，时，v=Vmax，符合零级反应，符合零级反应3.3.米氏常数的意义及

24、测定米氏常数的意义及测定(1)Km是酶的一个基本的特征常数是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。和离子强度而改变。(2)从从Km可判断酶的专一性和天然底物可判断酶的专一性和天然底物。Km最小的底物，通最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。v=Vmax SKm +S 当 v=Vmax/2则：Km=S米氏常数的涵义是米氏常数的涵义是v为为Vmax一半一半时的时的S。单位单位浓度单位浓度单位(mol/L,mmol/L)Km=(k2

25、+k3)/k1则 Km k2/k1 Km可以看作ES的解离常数ks：Km=ks=SEES当当Km大时，说明大时，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。容易解离，酶与底物结合的亲和力小。当当Km小时，酶与底物结合的亲和力大。小时，酶与底物结合的亲和力大。(3)当当k2k3时，时，Km的大小可以表示酶与底物的亲和性的大小可以表示酶与底物的亲和性。S +EESE+Pk1k2k3(4)km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径途径。丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛乳酸脱氢酶(1.710-5)丙酮酸脱氢酶(1.310-3)丙酮酸脱羧酶(1.010-3)米氏常数可根据实验

26、数据作图法直接求得：先测定不同底物米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从浓度的反应初速度，从v与与S的关系曲线求得的关系曲线求得Vmax，然后再，然后再从从1/2Vmax求得相应的求得相应的S即为即为Km(近似值近似值)。米氏常数的米氏常数的测定测定：通常用通常用双倒数作图法，双倒数作图法，将将矩形双曲线矩形双曲线方程式转变方程式转变成成直线方程式直线方程式作图。作图。1v=KmVmax S1+Vmax1(相当于y=ax+b)斜率=Km/Vmax1/S1/v1/Vmax-1/Km v=Vmax SKm +S(四四)pH)pH对酶作用的影响对酶作用的影响pHv最

27、适最适pH(optimum pH)1.1.最适最适pHpH：表现出酶最大活力的：表现出酶最大活力的pHpH值值 2.pH2.pH稳定性：在一定的稳定性：在一定的pHpH范围内酶是稳定的范围内酶是稳定的注意注意:最适最适pHpH不是酶的特征性常数。不是酶的特征性常数。最适最适pHpH、酶的最稳定、酶的最稳定pHpH、体内环境的、体内环境的pHpH三者不一定三者不一定相同。相同。动物动物体内大多数酶的最适体内大多数酶的最适pHpH值为值为6.56.58.08.0。但也有。但也有例外，如例外，如胃蛋白酶的最适胃蛋白酶的最适pHpH约约1.81.8，肝精氨酸酶最适，肝精氨酸酶最适pHpH约为约为9.0

28、9.0。pHpH对酶作用的影响机制：对酶作用的影响机制：1.1.环境过酸、过碱使酶变性失活；环境过酸、过碱使酶变性失活；2.2.影响酶活性基团的解离；影响酶活性基团的解离；3.3.影响底物的解离。影响底物的解离。(五五)温度对酶作用的影响温度对酶作用的影响两种不同影响：两种不同影响：1.1.温度温度升高，反应速度加快升高，反应速度加快；2.2.温度升高，热变性速温度升高，热变性速度加快度加快。Tv最适温度 酶的最适温度不是酶酶的最适温度不是酶的特征性常数。的特征性常数。从动物组织提取的酶，从动物组织提取的酶，其最适温度多在其最适温度多在37375050之间，温度升高到之间，温度升高到6060以

29、上时，大多数酶以上时，大多数酶开始变性，开始变性，8080以上，以上，多数酶发生不可逆变性。多数酶发生不可逆变性。(六六)激活剂对酶作用的影响激活剂对酶作用的影响凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。1.1.金属离子金属离子:Mg:Mg2+2+,Zn,Zn2+2+,Fe,Fe2+2+,Ca,Ca2+2+等是多种酶的激活剂，在等是多种酶的激活剂，在制备这些酶的过程中，应注意即时补充丢失的无机离子。制备这些酶的过程中，应注意即时补充丢失的无机离子。2.2.阴离子阴离子:如如ClCl是唾液淀粉酶的激活剂。是唾液淀粉酶的激活剂。3.3.有机分子有机分子:(1)(1)某

30、些还原剂某些还原剂,如如VitC,GSH,CysVitC,GSH,Cys等能激活某些酶。等能激活某些酶。(2)(2)金属螯合剂金属螯合剂(如如EDTAEDTA等等)能除去酶中重金属杂质能除去酶中重金属杂质,从而从而解除重金属离子对酶的抑制。解除重金属离子对酶的抑制。4.4.生物大分子物质生物大分子物质:可激活酶原可激活酶原,例如肠激酶例如肠激酶,胰蛋白酶胰蛋白酶(七七)抑制剂对酶作用的影响抑制剂对酶作用的影响使酶的必需基团或活性部位的基团化学性质改变而降低酶使酶的必需基团或活性部位的基团化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂抑制剂(Inhibitor

31、,I)(Inhibitor,I)。1.1.不可逆抑制作用不可逆抑制作用：抑制剂与酶以共价键结合：抑制剂与酶以共价键结合,是不可逆的。是不可逆的。不能用透析等方法除去抑制剂不能用透析等方法除去抑制剂,恢复酶的活性。恢复酶的活性。+IEI例如例如,碘乙酸、碘乙酰胺、对碘乙酸、碘乙酰胺、对-氯汞苯甲酸对巯基酶的不氯汞苯甲酸对巯基酶的不可逆抑制可逆抑制(与酶分子上的半胱氨酸与酶分子上的半胱氨酸-SH-SH作用作用)S +EESE+P 又如又如,有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的能专一作用于胆碱酯酶活性中心的SerSer残残基，生成磷酰化胆碱酯酶基，生成磷酰化胆碱酯酶,从而不可逆抑制

32、酶的活性。从而不可逆抑制酶的活性。解磷定解磷定等药物能与磷酰化胆碱脂酶反应等药物能与磷酰化胆碱脂酶反应,把连接在胆碱脂酶把连接在胆碱脂酶上的磷酸基夺过来上的磷酸基夺过来,自己与有机磷杀虫剂结合，使酶解离而复自己与有机磷杀虫剂结合，使酶解离而复活。该类药物在活。该类药物在临床上常用于急性有机磷中毒临床上常用于急性有机磷中毒.R1OPR2OXO+HXHO-EOER1OPR2OO+有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂胆碱酯酶胆碱酯酶磷酰化酶磷酰化酶磷酰化酶磷酰化酶解磷定解磷定(PAM)+E+CHNOH+NCH3OR2 OP OOR1CHN磷酰化磷酰化PAMOER1OPR2OO+NCH32.2.可逆抑制作用可逆抑

33、制作用：抑制剂与酶以非共价键结合，是：抑制剂与酶以非共价键结合，是可逆的。可逆的。可用透析等物理方法除去抑制剂可用透析等物理方法除去抑制剂,恢复酶的恢复酶的活性。活性。抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。剂的浓度以及底物的浓度决定。抑制常数抑制常数K Ki i表示表示I I从从EIEI上解离的常数上解离的常数:可逆抑制剂包括可逆抑制剂包括竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、反竞争性抑制剂。反竞争性抑制剂。Ki=EIEIEvI EvI 不可逆抑制剂的作用 可逆抑制剂的作用不可逆抑制剂和可逆抑制

34、剂的区分：不可逆抑制剂和可逆抑制剂的区分：(1)(1)透析或超滤的方法；透析或超滤的方法；(2)(2)动力学方法。动力学方法。(1)(1)竞争性抑制竞争性抑制(competitive inhibition)：抑抑制制剂剂和和底底物物竞竞争争与与酶酶的的同同一一活活性性中中心心结结合合，从从而而干干扰扰了了酶酶与与底底物物的的结结合合，使使酶酶的的催催化化活活性性降降低低，称称为为竞竞争争性性抑制作用抑制作用。竞争性抑制剂的米氏图竞争性抑制剂的米氏图1)当当E不变不变,若若SKm(1+I/Ki),则则Km(1+I/Ki)+S近似地等于近似地等于S,则则vVmax,最大反应速度不变。最大反应速度不

35、变。所以所以,升高升高s,可以解除抑制作用。可以解除抑制作用。2)Km=Km(1+I/Ki),所以所以Km Km 竞争性抑制的米氏图和米氏方程竞争性抑制的米氏图和米氏方程1v=kmVm S1+Vm11+IKi 竞争性抑制的双倒数图形特征竞争性抑制的双倒数图形特征动力学参数：动力学参数：KmKm值增大，值增大，VmaxVmax值不变值不变 竞争性抑制的特点：竞争性抑制的特点：竞争性抑制剂只与游离的酶结合竞争性抑制剂只与游离的酶结合。竞争性抑制剂竞争性抑制剂的结构的结构往往往往与与酶的酶的底物结构十分相似底物结构十分相似或是反或是反应产物。应产物。抑制剂与酶的抑制剂与酶的结合部位结合部位和底物与酶

36、的结合部位相同。和底物与酶的结合部位相同。竞争性抑制作用的大小取决于抑制剂与底物的浓度比，以竞争性抑制作用的大小取决于抑制剂与底物的浓度比，以及与酶结合的亲和力大小。及与酶结合的亲和力大小。抑制剂浓度越大，则抑制作用抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小。越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小。例例1 1，丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制，丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 琥珀酸琥珀酸 延胡索酸延胡索酸 丙二酸丙二酸例例2 2，磺胺类抗菌药物对二氢叶酸合成酶的竞争性抑制，磺胺类抗菌药物对二氢叶酸合成酶的竞争性抑制 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺FH2

37、合成酶合成酶FH2FH4竟争性抑制竟争性抑制细菌合成核细菌合成核酸不可缺少酸不可缺少的辅酶的辅酶2.非竞争性抑制非竞争性抑制(non-competitive inhibition)抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ESES复合物结合，但复合物结合，但形成的酶形成的酶-底物底物-抑制剂三元复合物抑制剂三元复合物(ESI)(ESI)不能进一步转变为不能进一步转变为产物产物,称为称为非非竞争性抑制作用竞争性抑制作用。非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂I I的结合改变了酶活性部位的构象，使酶失的结合改变了酶活性部位的构象，使酶失活，但不防碍活，但不防碍S S与与E E的结合

38、。的结合。非非竞争性抑制的米氏图和米氏方程竞争性抑制的米氏图和米氏方程Sv无 IV/2km有 I()VmaxVmaxv=Vmax1+I/ki Skm+SVmax1+I/kiVmax=km不变，不变，Vm减小减小 I I和和S S在结构上一般无相似之处，在结构上一般无相似之处，I I和和S S同时结合在同时结合在E E的不同部位的不同部位,即即I I和和E E结合的位置不是结合的位置不是S S和和E E的结合位的结合位,而而是与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结是与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减增加底物浓

39、度并不能减少少I I对酶的抑制程度。对酶的抑制程度。某些需要金属离子维持活性的酶某些需要金属离子维持活性的酶,也可能被非竟争也可能被非竟争性抑制性抑制,如如F F-、CNCN-等金属络合剂可与金属酶中的金属离等金属络合剂可与金属酶中的金属离子络合子络合,使酶的活性受到抑制。使酶的活性受到抑制。非非竞争性抑制的双倒数图形特征竞争性抑制的双倒数图形特征1v=kmVm S1+Vm11+IKi1+IKi1S3反竞争性抑制(uncompetitive inhibition)(自学)抑抑制制剂剂不不能能与与游游离离酶酶结结合合，但但可可与与ESES复复合合物物结结合合并并阻阻止止产物生成，使酶的催化活性降

40、低，称酶的产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制反竞争性抑制。v=Vmax1+Iki Skm1+Iki+SVmax和和km均减小均减小 反反竞争性抑制的米氏图和米氏方程竞争性抑制的米氏图和米氏方程Svkmkm无无I有有I 反竞争性抑制的双倒数图形特征(八八)酶的别酶的别(变变)构效应构效应当底物或底物以外的物质与酶当底物或底物以外的物质与酶非共价的结合非共价的结合后，后，可改变酶的构象，进而改变酶的催化活性，这种可改变酶的构象，进而改变酶的催化活性，这种效应称为效应称为别构效应别构效应。受别构效应调节的酶称受别构效应调节的酶称别构酶别构酶；别构酶通常为代别构酶通常为代谢途径的起始关键

41、酶。谢途径的起始关键酶。引起别构效应的物质称为引起别构效应的物质称为别构效应剂别构效应剂；凡使酶活；凡使酶活性增强的效应剂称性增强的效应剂称别构激活剂；别构激活剂；凡使酶活性减弱凡使酶活性减弱的效应剂称的效应剂称别构抑制剂。别构抑制剂。别构激活剂常常是酶的别构激活剂常常是酶的底物，别构抑制剂一般是代谢反应序列的终产物。底物，别构抑制剂一般是代谢反应序列的终产物。协同效应：当当别别构构酶酶的的一一个个亚亚基基与与其其配配体体(底底物物或或别别构构剂剂)结结合合后后，能能够够通通过过改改变变相相邻邻亚亚基基的的构构象象而而使使其其对对配配体体的的亲亲和和力力发发生生改改变变，这这种种效效应应就就称

42、称为为别别构构酶酶的的协同效应协同效应。如如果果对对相相邻邻亚亚基基的的影影响响是是导导致致其其对对配配体体的的亲亲和和力力增增加加，则则称称为为正正协协同同效效应应；反反之之，则则称称为为负负协协同同效应效应。1.别构酶特点：1.1.别构酶一般是寡聚酶，由多亚基构成，一些亚基为别构酶一般是寡聚酶，由多亚基构成，一些亚基为催化亚催化亚基基，另一些亚基为，另一些亚基为调节亚基调节亚基(有别构效应剂的结合部位有别构效应剂的结合部位)。2.2.具有别构效应；具有别构效应；3.3.别构酶大都不遵循米氏动力学。有正协同效应的别构酶其别构酶大都不遵循米氏动力学。有正协同效应的别构酶其v vSS曲线具有曲线

43、具有S S形，负协同则呈比较平坦的曲线，说明对底形，负协同则呈比较平坦的曲线，说明对底物浓度的敏感性不同。物浓度的敏感性不同。1 1为非调节酶动力学曲线；为非调节酶动力学曲线；2 2为具正协同效应的别构酶的为具正协同效应的别构酶的动力学曲线；动力学曲线；3 3为具负协同效应的别构酶的为具负协同效应的别构酶的动力学曲线动力学曲线调节亚基调节亚基催化亚基催化亚基底物底物别构激活剂别构激活剂2别构调节的机制：当调节亚基或调节部位与别构剂结合后，就可导致酶的空当调节亚基或调节部位与别构剂结合后，就可导致酶的空间构象发生改变，从而导致酶的催化活性中心的构象发生间构象发生改变，从而导致酶的催化活性中心的构

44、象发生改变而致酶活性的改变。改变而致酶活性的改变。例如，天冬氨酸转氨甲酰酶例如，天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)(ATCase)l ATCaseATCase有有2 2个催化亚基和个催化亚基和3 3个调节亚基。每个催化亚基上有三个调节亚基。每个催化亚基上有三个底物个底物AspAsp结合部分；每个调节亚基上有两个别构效应剂的结结合部分；每个调节亚基上有两个别构效应剂的结合部位。合部位。l V VSS曲线具有曲线具有S S形，表明各底物结合部位之间具有正协同形，表明各底物结合部位之间具有正协同效应，即一旦有一个部位结合了效应，即一旦有一个部位结合了AspAsp，酶构象立即发生改变，酶构象立即发生改

45、变，使其余的底物结合部位与使其余的底物结合部位与AspAsp的亲和力加强，反应速度加快。的亲和力加强，反应速度加快。l 底物、底物、CTPCTP、ATPATP都是都是ATCaseATCase的别构效应剂的别构效应剂,其中其中CTPCTP是别构抑制剂，是别构抑制剂，ATPATP是是别构激活剂。别构激活剂。lATPATP能使上述能使上述S S型曲线左型曲线左移移，饱和量的饱和量的ATPATP可将可将S S形形曲线转变为矩形双曲线。曲线转变为矩形双曲线。CTPCTP能能使使S S形曲线右移形曲线右移。八、酶活力的测定八、酶活力的测定酶加速其所催化的化学反应的能力称为酶的活酶加速其所催化的化学反应的能

46、力称为酶的活力力(activity)。测定的酶活力测定的酶活力测定酶促反应速度。测定酶促反应速度。酶酶(活力活力)单位：在一定条件下，一定时间内将单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。一定量的底物转化为产物所需的酶量。一个酶单位一个酶单位(U):在最适的反应条件在最适的反应条件(30)下，下，1分钟内转化分钟内转化1 mol底物的酶量或是转化底物中底物的酶量或是转化底物中1 mol有关基团的酶量。即有关基团的酶量。即 1U=1 mol/min酶的比活力是指每单位质量样品中的酶活力是指每单位质量样品中的酶活力。例如，每例如，每mg酶蛋白中所含的酶蛋白中所含的U数数(U

47、/mg)，即，即每分钟每毫克酶蛋白在每分钟每毫克酶蛋白在30下转化的底物的微摩数下转化的底物的微摩数(mol/minmg)。比活力=活力单位数/毫克蛋白纯化倍数纯化倍数每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力 在酶的提纯过程中，随着酶纯度的提高，酶的在酶的提纯过程中，随着酶纯度的提高，酶的比活力也在逐步增加，因此用比活力可以比活力也在逐步增加，因此用比活力可以比较酶比较酶制剂的纯度制剂的纯度。九、酶的制备酶分离纯化的目的：研究酶的理化性质，包括结构与功能、生物学作用及研究酶的理化性质，包括结构与功能、生物学作用及 对酶的鉴定。对酶的鉴定。纯酶可作为生化试剂及药物纯酶可作为生化试剂及药物(纯

48、度高纯度高)动植物的来源有限，动植物的来源有限，工业上大多采用工业上大多采用微生物发酵微生物发酵法来获法来获得大量的酶制剂。得大量的酶制剂。优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到，微生物繁殖快、产酶量丰富。还可以可从微生物体内找到，微生物繁殖快、产酶量丰富。还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。1、酶的粗提从动植物细胞中粗提酶：破碎动物细胞(研磨、匀浆、反复冻融等)缓冲液提取从细菌中粗提酶：破碎细菌(超声波、溶菌酶、化学试剂等)缓冲液提取2、酶的纯

49、化方法：a)a)根据溶解度不同根据溶解度不同(盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法法)；b)b)根据酶与杂蛋白分子大小的差别根据酶与杂蛋白分子大小的差别(凝胶过滤法、超速离心凝胶过滤法、超速离心法法)；c)c)根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同(吸附分离法吸附分离法)；d)d)根据带电性质及根据带电性质及与杂蛋白分子大小的差别与杂蛋白分子大小的差别(离子交换层析离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法法、电泳分离法、等电聚焦层析法)；e)e)根据酶与杂蛋白的稳定性差别根据酶与杂蛋白的稳定性差别(选

50、择性变性法选择性变性法)；f)f)根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用(亲和层析法亲和层析法)。操作要求：操作要求：a.a.尽量减少酶活性的损失尽量减少酶活性的损失 b.b.低温低温 0 055 有机溶剂：有机溶剂：-15-15-20-20 c.c.抽提液加入抽提液加入EDTA(EDTA(络合金属络合金属)d.d.抽提液加入巯基乙醇等还原剂抽提液加入巯基乙醇等还原剂(防止防止-SH-SH酶失活酶失活)e.e.不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性 f.f.测定酶的比活力测定酶的比活力2 2、酶