TRIzol中文说明书.pdf

《TRIzol中文说明书.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TRIzol中文说明书.pdf（7页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、TRIzol 2-8避光保存 产品包装：100ml 蓝色透明液体 产品简介：TRIzol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离 RNA。TRIzol 试剂有多组分分离作用,TRIzol 使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时保持 RNA 的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收 RNA；用乙醇沉淀中间层可回收 DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol 试剂可用于小量样品（50100mg 组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g 组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总 R

2、NA 无蛋白质和 DNA 污染，可用于 Northernblot，dotblot，ployA 筛选，体外翻译，RNase 保护分析和分子克隆。在用于 RT-PCR 时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的 DNA 可用作标准，比较不同样品 RNA 的得率，也可用于 PCR 和酶切。蛋白质可用于 westernblotting。注意事项：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤。预防 RNase 污染注意事项：1经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为 RNas

3、e 的来源。2使用灭过菌的 RNA 专用塑料制品避免交叉污染。3 RNA 在 TRIzol 试剂中时不会被 RNase 污染，但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150烘烤 4 小时，塑料制品可在中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除 RNase。4配制溶液应使用无 RNase 的水（将水加入处理过不含 RNase 的玻璃瓶中，加入DEPC 至终浓度v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC 有致癌之嫌，需小心操作。）RNA 的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，75乙醇，无 RNase 的水或SDS(溶液均需用 DEPC 处理过的水配制)操

4、作步骤:1.匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每 50-100mg 组织加入 1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过 TRIzol 体积 10。b.单层培养细胞直接在培养板中加入 TRIzol 裂解细胞，每 10cm2面积加 1ml，用移液器吸打几次。TRIzol 的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol 加量不足可能导致提取的 RNA 有 DNA 污染。c细胞悬液离心收集细胞，每 5-10106动物、植物、酵母细胞或 1107细菌细胞加入 1mlTRIzol，反复吸打。加 TRIzol 之前不要洗涤细胞以免 mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处

5、理。2将匀浆样品在室温（15-30）放置 5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于 2-810000g 离心 10 分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA，上清中含有 RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5.每使用 1mlTRIzol 加入氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温放置 3 分钟。10000g 离心 15 分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 TRIzol 试剂的 60。7.把

6、水相转移到新管中（如要分离 DNA 和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的 RNA。每使用 1mlTRIzol 加入异丙醇，室温放置 10 分钟。10000g 离心 10 分钟，离心前看不出 RNA 沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9.用 75乙醇洗涤 RNA 沉淀。每使用 1mlTRIzol 至少加 1ml75乙醇。2-8不超过 7500g 离心 5 分钟，弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干 RNA 沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾 5-10分钟。加入 25-200l 无 RNase 的水或SDS,用枪头吸打几次,55-60放置 10 分钟使 RNA 溶解.如

7、 RNA 用于酶切反应,勿使用 SDS 溶液。RNA 也可用 100的去离子甲酰胺溶解，-70保存。注意事项：1.从少量样品（1-10mg 组织或 102-104细胞）中提取 RNA 是可加入少许糖原以促进RNA 沉淀。例如加 800mlTRIzol 匀浆样品，沉淀 RNA 前加 5-10gRNase-free 糖原。糖原会与 RNA 一同沉淀出来，糖原浓度不高于 4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响 PCR 反应。2 匀浆后加氯仿之前样品可在-60-70保存至少一个月。RNA 沉淀可保存在 75%酒精中 2-8一个星期以上或-5-20一年以上。3分层和 RNA 沉淀时也可使用低速台式

8、离心机，2600g 离心 30-60 分钟。预期产量：1mg 组织或 1106细胞提取 RNA 分别为：肝和脾 6-10g,肾 3-4g,骨骼肌和脑组织g,胎盘 1-4g,上皮细胞 8-15g,成纤维细胞 5-7g.常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 BRNA 沉淀未完全溶解 A260/A28012000g 离心 10 分钟除去。DNA 的定量：取一份溶于 8mMNaOH 的 DNA 加水测 A260值。一单位 A260值相当于 50g/ml 双链 DNA。根据 DNA 产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠 1106二倍体细胞含 DNA 的量分别为g,g,g。预期产量：1mg 组织

9、或 1106细胞提取 DNA 分别为肝和肾 3-4g 骨骼肌，脑组织，胎盘 2-3g 人，大鼠，小鼠培养细胞（1106）5-7g,成纤维细胞 5-7g 应用：1.用于 PCR 溶于 8mMNaOH 的 DNA 用调 pH 至,取gDNA 用作模板。2.酶切反应用 HEPES 或 1mMEDTA 调节 pH 至适当值。每gDNA 使用 3-5 单位的酶，80-90%的 DNA 是可消化的。1ml8mMNaOH 溶解的 DNA 样品 pH 值调节：Final pH HEPES(l)Final pH 1M HEPES(l)86 23 93 32 101 117 159 注意事项：在中间层和有机相中时

10、可在 2-8保存过夜。2DNA 沉淀在 75%乙醇中 2-8可保存几个月。3DNA 在 8mMNaOH 溶液中 4可放置过夜，如长期保存需用 HEPES 调节 pH 至 7-8并且加 EDTA 至 1mM 可置于 4或-20长期保存。常见问题分析：得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底 B最终得到的 DNA 沉淀没有完全溶解 A260/A280：A.检测吸光度时，RNA 样品没有溶于水，而溶于了 TE 中 B酚除去的不彻底，可用柠檬酸钠（含 10%乙醇）再洗一遍 DNA 沉淀。DNA 降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻 B.待提取 RNA 的样品没有保存于-60 至-70,而保存在了-5 至-

11、20 C样品匀浆时使用了高速匀浆仪 RNA 污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净 BDNA 沉淀用柠檬酸钠（含 10%乙醇）洗的不彻底 蛋白质的提取 准备试剂：异丙醇含盐酸胍的95%乙醇无水乙醇 1%SDS 操作步骤：1.取沉淀 DNA 后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用 1mlTRIzol 加异丙醇，室温放置 10 分钟，2-812000g 离心 10 分钟弃上清。2用含盐酸胍的 95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用 1mlTRIzol 加 2ml 洗涤液，室温放置 20 分钟，2-87500g 离心 5 分钟，弃上清，重复两次。用 2ml 无水乙醇同样方法再洗一次。3真空抽干蛋白质沉淀 5-10 分钟，用 1%SDS 溶解蛋白质，反复吸打，50温浴使其完全溶解，不溶物 2-810000g 离心 10 分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于 Westernblot 或-5-20保存备用。注意事项：1.蛋白质沉淀可保存在含盐酸胍的 95%乙醇或无水乙醇中 2-8一个月以上或-5-20一年以上。2 用%SDS 在 2-8透析三次，10000g 离心 10 分钟取上清即可用于 Westernblot。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解 蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分