微波作用下醋酸亮丙瑞林的固相合成_张俊.docx

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1、微波作用下醋酸亮丙瑞林的固相合成 张俊，岑涛，王安明，周成，杜志强，武秀明，沈树宝 5 (南京工业大学制药与生命科学学院材料化学工程国家重点实验室，江苏南京 210009) 摘要 :在醋酸亮丙瑞林的固相合成中引入微波技术，深入研究了大位阻氨基酸 Fmoc-Arg(PbfHDH 与 H-Pro-Leu、 Tyr、 Ser、 Trp、 His 与 Pyr。 反应中各氨 基酸的过量倍数均为 1 倍。缩合过程中采用四氯 对苯醌定性显色 (Chloranil 法 )11检测反应进度。 1.2.4 肽树脂复合物的切割 用 r(l%TFA) :r(DCM)=l 400 将肽链从 树脂上切下，得到干燥的保护肽

2、 12。 1.2.5 肽片段 C-末端乙胺化 将保护肽与 0. 2 mmol DEA 溶于 2 mL THF， 振荡 5 10 min。 然后再加入 0. 2 mmol HBTU、 0. 2 mmolHOBt,振荡使溶解完全，最后加入 1 mL 2. 0 mol/L (2 mmol)的乙胺，常规条件下反应 2 h 后，40 C 浓缩以除去大部分乙胺与 THF。 加 入切 割试剂 r(TFA) :F(TIS) :K(H20) = 9. 5 :0.25: 0. 25,反应 1 h。 浓缩后，冰乙醚沉淀，离心后冷冻 干燥得到粗肽。 1.2.6 目标产品的分析鉴定 粗肽用 RP-HPLC纯化后，以 H

3、PLC与质谱分 析鉴定。 HPLC 的色谱条件为 :色谱柱 Kr_sil C18 柱 (4. 6 mmX250 mm)： 流动相 A 为 0. 1 % TFA/H20 ( / F= 1 :100)，流动相 B 为乙腈，线性梯度为 0 15 min 流动相 B(50% 100%)，之后维持 10 min; 检测波长 215 nm; 流速 1 mL/ min; 进样量 20 ML。 HPLC 分析得产品纯度 98 %。 质谱条件为：喷雾电压 5 kV， 毛细管温度 350 C；正离子检测，质谱鉴定结果如下。 MS， m/z: 1 209. 4 (M+H)+ ; 605. 2 (M+2H)2十 ，与

4、 亮丙瑞林的理论相对分子质量 13 致。 2 结果与讨论 2.1 微 波 辐 射 下 溶 剂 对 Fmoc-Aig(PbfK)H 与 H- PK)CTC 树脂缩合率的影响 反应温度 30 C,微波功率 300 W， 辐射 2 min, 反应温度的维持时间 6 min， Fmoc-Arg(PbfK)H 氨 基酸浓度为 21 mmol/L(过量倍数为 2 倍 )，缩合试 剂 HBTU， 溶剂用量 3 mL。 研究溶剂对缩合率的 影响。结果见表1。 表 1 溶剂对缩合率的影响 从结果可以看出在微波辐射下以 F(EMF): KNMP) :F HF)= 1 :1 :1 为 溶 剂 时 Fmoc-Aig

5、(Pbf)OH 与 H-ProCTC树脂的缩合率最高，达到 80. 3%。其次为 F(NMP) :r(EMSO) :F(THF) = 4 :1 :1 和 r(EMF) :r(EMSO) :mHF) = 4 :1 :1。 这是因为： 1)肽链溶解性与溶剂的供氢与受氢能 力密切相关，受氢能力EMSONMPOVIF14， 使 用同向溶剂 CMF/DMSO、NMP/aVISO 和 EMF/NMP 更强化了肽段溶解性 ;2)在极性溶剂中加入非极 性的 IHF 时，能使体系温度缓慢上升，增加了微 第 31 卷第 6 期 张俊等 :微波作用下醋酸亮丙瑞林的固相合成 403 图 1 反应温度对缩合率的影响 F

6、ig. 1 Effect of reaction tenperature on the coupling yield 结果表明， Fmoc-Aig (Pbf )OH 与 H-ProCIC 树脂的缩合率随着温度的升同逐渐升咼，当温度 升至 35 C 时， Fmoc-Ai (Pbf H)H 与 H-ProCIC 树 脂缩合率达到最高，超过 35 C 后，缩合率急剧下 降，这主要是因为升高温度会破坏固相载体的理 化性质 16。 2.4 微波辐射时间对 Fmoc-Aig (Pbf )OH 与 H- ProCTC 树脂缩合率的影响 微波辐射下，以 FCOVIF):厂 (NMP):厂 (THF)= 1 :

7、1 :1，共 3 mL 为溶剂，反应温度 35 C， 微波功率 300 W， 反应 温 度 的 维 持 时 间 6 min, Fmoc-Aig (Pbf)0 浓度21 mmol/L 缩合试剂 HBIU， 研宄辐 射时间对缩合率的影响。结果如图 2 所示。 图 2 微波辐射时间对缩合率的影响 Fig. 2 Effect of microwave irritation time on the coupling yield 从结果可看出辐射 1 min 后缩合率都达到 75%以上 ， 3 1时只 1(： -八屯（ ?匕 0011与 H-Pro- CTC树脂缩合率最高，为 84. 7%。这时因为微波

8、能量可以直接活化具有偶极力矩的分子，使得反 应快速进行，大大降低了困难氨基酸的空间位阻， 从而实现分子水平上的快速加热，且微波加热均 匀无温度梯度、无滞后效应17， 3 min时缩合率达 到最高，此后延长辐射时间缩合率基本保持不变。 2.5 亮 丙 瑞 林 C端 3-9 位氨基酸的缩合率 表 3 亮丙瑞林 C 端第 3-9 位氨基酸的缩合率 Tab. 3 The coupling yield of Leuprorelin residues fran teirninal-C 3 to 9 顺 序 保护氨基酸 缩合 率 /% 顺 序 保护氨基酸 缩合 率 /% 3 Fmoc-Leu-OH 99.2

9、 7 Fmoc-Trp (Boc )- H 100 4 Fmoc-D-Leu-OH 98.4 8 Fmoc-His (Trt )- H 99.2 5 Fmoc-Tyr (， -Bu )OH 99.7 9 H-Pyr-OH 99.7 6 Fmoc-Ser (t -Bu )- H 98.9 以 F(EMF) :F(NMP) :F(THF)=1 :1 :1 为溶 齐 II，缩合使用的最优条件为微波福射 3 min、 反应 温度 35 C、 持续时间 6 min、 缩合试剂 HBIU氨基 酸浓度 14 nmol/L 氨基酸总过量倍数为 1 倍，按 照亮丙按照中氨基酸从羧基到氨基的顺序合成， 波能量的利

10、用率，同时又使得活化的困难氨基酸 与氨基组分的碰撞频率增加，同向溶剂 :CMF 和 NMP 极性适中，再加上非极性的 THF， 在加强肽 段溶解性的同时相对增加了微波辐射时间，因此 使用 r(EMF) :F(NMP) :rHF)=l :1 :1 缩合率 为最高 ;3 )THF 结构是杂环，与Pro 结构类似，相 似相溶 ,可能对 H-Prc-CTC 树脂上含仲氨的五元 环更具亲和力，从而提高缩合率。 2. 2 微波辐射下缩合试剂对 Fmoc-Arg(Pbf)OH 与H-ProCTC树脂的缩合率的影响 在微波辐射下，以 F (DMF ) : F( NMP) : mHF)=l : 1 : 1 共

11、3 mL 为溶剂，选取反应温度 30 C,微波功率 300 W， 辐射 2 min,反应温度的维 持时间 6 min. Fmoc-Aig (Pbf)OH 浓度 21 ranol/L (过量倍数为 2倍 )，研宄缩合试剂对缩合率的影 响。结果如表 2 所示。 表 2 缩合试剂对缩合率的影响 Tab. 2 Effect of coupling reagent on the coupling yield 缩合试剂 DIC HATU HBTU HCTU TBTU 缩合率 /% 29.2 80.9 80.3 79.3 75.4 在微波辐射下，使用 HAIU 为缩合试剂时与 H-ProCTC树脂的缩合率最

12、高，其次为 HBTU、 HC- TU、TBTU 和 DIC。 HATU 属于吡啶并三卩坐铕盐类 缩合试剂 (AOP 族 )，缩合活性比 HBTU、 HCIU、 TB- TU(苯并三哩错盐， BOP 族 ) 要 高 在 微 波 辐 射 下HBTU活性仅略低于 HAIU， 综合考虑成本，选 用 HBIU为缩合试剂。 2.3 微波福射下反应的温度对 Fmoc-Arg(Pbf)- OH与 H-ProCTC 树脂的缩合率的影响 微波辐射下，以 3 mL F(EMF) :F(NMP) : F HF)=l :1 :1 为溶剂，微波功率 300 W， 辐射 2 min,反应温度的维持时间 6 min, Fmo

13、c-Aig(Pbf)- OH 浓度21 mmol/L缩合试剂 HBIU 研宄反应的 温度对缩合率的影响。结果如图 1。 404 化学试剂 2009 年 6 月 总产率达到 81. 3%。 3 结论 对于醋酸亮丙瑞林中大位阻氨基酸 Fmoc-Arg (Pbf )OH 与 H-PK)CIC 树 脂 的 缩 合 反 应 ， 以 r(EMF) :KNMP) :r(THF)=l :1 :1 为溶剂，缩合 使用的最优条件为微波辐射 3 min、 反应温度 35 C、持续时间 6 min、 缩合试剂 HBTU， 氨基酸浓 度 21 mmol/L氨基酸总过量倍数仅为 2倍， Fmoc- Ai (Pbf K)H

14、与 H-ProCTC 树脂的缩合率高达 84.7%。并在微波辐射下合成了后续序列，总产 率达到 81. 3 %，氨基酸过量倍数仅为 1 倍，与常规 方法比，氨基酸用量大大减少，反应速率提高了近 15 倍。 参考文献： 11 林碧莲 .醋酸亮丙瑞林临床应用评价 t J.中国处方药， 2005, 9 (3)： 23. 21 王德心 .固相有机合成 原理及应用指南 M.北 京：化学工业出版社， 2004:116-117. 31 VAN WOERKOM W J, VAN MSPEN J W. Difficult couplings in stepwise solid-phase peptide-syn

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22、anjing University of Technology, Nanjing 210009, China), Huaxue Shiji, 2009, 31 (6)， 401 404 Abstract： A microwave-irradiation technique was applied to the solid phase synthesis of leuprorelin. The coupling reaction of Fmoc-Arg(Pbf)-H known as a sterically hindered amino acid with H-Pro-CTC Resin (C

23、TC resin, 2-chlorotrityl chloride resin) was investigated. The optimal conditions were as follows： EMF/ NMP/THF (at a ratio of 1 :1 :1 by volume) was used as the solvent, HBTLJ was used as the coupling reagent, the concentration of amino acids was 21 mmol/L, the microwave irradiation time was 3 min,

24、 and the reaction tenperature was 35 Q viich was maintained for 6 min. The yield of the target prcxiuct after coupling of Fmoc-Arg (Pbf)-OH with the H-Pro-CTC resin was improved to reach 84. 7%.Finally, the yield of leuprorelin reached 81.3% under optimal conditions. Key words： microwave? SPPS (solid-phase peptide synthesis)； leuprorelin； sterically hindered amino acid 欢迎投稿 欢迎刊登广告