《氨基酸分析》PPT课件.ppt

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1、1 1第二章第二章 氨基酸分析氨基酸分析2 氨基酸分析氨基酸分析在蛋白质化学和生物技术研究、在蛋白质化学和生物技术研究、临床诊断和细胞生理学研究、营养学与卫生临床诊断和细胞生理学研究、营养学与卫生保健、培育农作物优良品种、食品、制药等保健、培育农作物优良品种、食品、制药等领域具有非常领域具有非常重要的意义重要的意义。氨基酸分析氨基酸分析3 氨基酸的基本结构及性质氨基酸的基本结构及性质n氨基酸是分子中氨基酸是分子中含有含有氨基和羧基氨基和羧基的一类化合物。的一类化合物。n组成蛋白质的氨基酸只有二十种。其中有组成蛋白质的氨基酸只有二十种。其中有八种八种为为人人体必需体必需氨基酸。氨基酸。n人体必需

2、的氨基酸：人体内不能合成，只有靠食物人体必需的氨基酸：人体内不能合成，只有靠食物供给的氨基酸供给的氨基酸。n各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。4氨基酸的分类氨基酸的分类1 1、根据氨基酸的酸碱性、根据氨基酸的酸碱性酸酸性性氨氨基基酸酸碱碱性性氨氨基基酸酸中中性性氨氨基基酸酸氨基酸氨基酸5酸性氨基酸酸性氨基酸二个羧基二个羧基一个氨基一个氨基天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸碱性氨基酸碱性氨基酸一个羧基一个羧基二个或二个以上氨基二个或二个以上氨基赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸中性氨基酸中性氨基酸一个羧基一个羧基一个氨基一个氨基实际水溶液呈弱酸性实际

3、水溶液呈弱酸性：电离能力电离能力 COOH NH262 2、根据氨基酸的化学特性、根据氨基酸的化学特性疏水性：疏水性：Ala（丙氨酸）（丙氨酸）Val（缬氨酸）（缬氨酸）Leu（亮氨酸）（亮氨酸）Ile（异亮（异亮氨酸）氨酸）Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）Pro（脯氨酸）（脯氨酸）Met（蛋氨酸）（蛋氨酸）带电带电：Arg（精氨酸）（精氨酸）Lys（赖氨酸）（赖氨酸）Asp（天冬氨酸）（天冬氨酸）Glu（谷（谷氨酸）氨酸）(His)组氨酸组氨酸极性：极性：Tyr（酪氨酸）（酪氨酸）Trp（色氨酸）（色氨酸）Ser（丝氨酸）（丝氨酸）Cys（半胱氨酸）（半胱氨酸）Thr（苏氨酸）（苏氨酸）Asn

4、（天冬酰胺）（天冬酰胺）Gln（谷氨酰胺）（谷氨酰胺）His（组氨酸）（组氨酸）特殊特殊：Gly(Pro)甘氨酸甘氨酸 脯氨酸脯氨酸氨基酸的分类氨基酸的分类7带电氨基酸带电氨基酸8极性氨基酸极性氨基酸9氨基酸的立体化学氨基酸的立体化学 由蛋白质水解的氨基酸都为由蛋白质水解的氨基酸都为-氨基酸，除甘氨基酸，除甘氨酸外，所有氨酸外，所有-C-C都为手性碳原子。都为手性碳原子。天然的氨基酸均为天然的氨基酸均为L-L-氨基酸氨基酸10氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质v1.溶解度溶解度v2.熔点熔点:高高v3.旋光性有旋光性旋光性有旋光性v4.味感：味感：D-氨基酸大氨基酸大多带甜味，多带甜味，L-氨基

5、酸有氨基酸有苦、甜、鲜、酸等四种苦、甜、鲜、酸等四种不同味感。不同味感。v1.两性性质：氨基酸分子两性性质：氨基酸分子中含有氨基及羧基，使其既中含有氨基及羧基，使其既能象酸又能象碱一样解离；能象酸又能象碱一样解离；v2.与甲醛作用：与甲醛作用：v3.与与2,4-二硝基氟苯作用：二硝基氟苯作用：v4.与茚三酮的作用：与茚三酮的作用：v5.与异硫酸苯酯的作用：与异硫酸苯酯的作用：v6.与荧光胺的作用：与荧光胺的作用：v7.与与5,5-双硫基双硫基-双双(硝基硝基苯甲酸苯甲酸)反应反应11等电点等电点概念：概念：将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节，使氨基将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节，使氨基

6、酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时，氨基酸带酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时，氨基酸带有的正电荷数目和负电荷数目相等，此溶液的有的正电荷数目和负电荷数目相等，此溶液的pH值称为值称为氨基酸的等电点，用氨基酸的等电点，用 pI 表示。表示。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀等电点可用酸碱滴定方法测定，也可通过等电点可用酸碱滴定方法测定，也可通过pK值计算值计算侧链无解离基团时：侧链无解离基团时：pI=(pK1+pK2)/2侧链有解离基团时侧链有解离基团时,pI相当于氨基酸的两性离子状态两相当于氨基酸的两性离子状态两侧的基团侧的基团pK值和的

7、一半值和的一半12pH=pI净电荷为零净电荷为零在电场中不移动在电场中不移动pH pI带负电荷带负电荷等电点等电点要使氨基酸达到等电状态：要使氨基酸达到等电状态：中性氨基酸：中性氨基酸：pI pH 7 pI pH 7 加少量酸加少量酸酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI pH 7 pI pH 7 pI pH 7 加碱加碱13与茚三酮的显色反应与茚三酮的显色反应水合茚三酮水合茚三酮CO214蓝紫色化合物蓝紫色化合物 根据根据COCO2 2的量或蓝紫色的深浅程度的量或蓝紫色的深浅程度 作为作为-氨基酸定量分析的依据。氨基酸定量分析的依据。与茚三酮的显色反应与茚三酮的显色反应15氨基酸的定量斑点分析氨基酸的

8、定量斑点分析 大多数氨基酸不含有特征发色基团。因此，氨基酸的大多数氨基酸不含有特征发色基团。因此，氨基酸的分析依赖于分析依赖于衍生化衍生化 反应反应。n对衍生化试剂的要求是对衍生化试剂的要求是反应快反应快，并且，并且 产物与试剂本身的产物与试剂本身的光谱性质有明显的差异光谱性质有明显的差异。n常用的衍生化试剂常用的衍生化试剂有有2 2，4-4-二硝基氟二硝基氟 苯、荧光胺苯、荧光胺及邻苯二甲醛等。及邻苯二甲醛等。n根据产物性质的不同，衍生化试剂可分为根据产物性质的不同，衍生化试剂可分为显色显色剂剂及及荧光衍生化试剂荧光衍生化试剂两大类。两大类。16斑点显色分析法斑点显色分析法 茚三酮茚三酮是氨

9、基酸的斑点显色分析中非常简单的是氨基酸的斑点显色分析中非常简单的衍生化试剂。衍生化试剂。它可以与它可以与一级和二级胺一级和二级胺在酸性介质中在酸性介质中pHpH（3 34 4）加热反应，反应产生氨、二氧化碳和）加热反应，反应产生氨、二氧化碳和蓝蓝-紫色紫色的络合物的络合物。一级和二级胺的检测波长分别为。一级和二级胺的检测波长分别为570570和和440nm440nm。若二者同时存在，一般在。若二者同时存在，一般在500 nm500 nm处测处测定，灵敏度有所降低。定，灵敏度有所降低。17另一种常用的显色反应试剂是另一种常用的显色反应试剂是2 2，4-4-二硝基氟苯二硝基氟苯，它可以与样品中氨基

10、酸及一级和二级胺反应，生它可以与样品中氨基酸及一级和二级胺反应，生成成黄色络合物黄色络合物，检测波长在，检测波长在420nm420nm。该法测定的。该法测定的是是氨基酸的总量氨基酸的总量。斑点显色分析法斑点显色分析法18斑点荧光分析法斑点荧光分析法荧光胺荧光胺是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍 生化试剂，可用于氨基酸的表面分析，如生化试剂，可用于氨基酸的表面分析，如 薄层色谱。薄层色谱。邻苯二甲醛（邻苯二甲醛（OPAOPA）是用于氨基酸荧光分是用于氨基酸荧光分 析的另一种常见的衍生化试剂。析的另一种常见的衍生化试剂。19色谱方法色谱方法离子交换色谱法离子交换色谱法反相

11、色谱分析法反相色谱分析法柱前衍生气相色谱法柱前衍生气相色谱法衍生化毛细管电泳法衍生化毛细管电泳法20离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱的离子交换色谱的基本原理基本原理是基于带电荷的阴阳离是基于带电荷的阴阳离 子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。氨基酸、肽和蛋白质在溶液中带电荷，可与离子氨基酸、肽和蛋白质在溶液中带电荷，可与离子 交换基团产生静电作用而保留。交换基团产生静电作用而保留。其其固定相固定相应具有分离效能高、物化性质稳定、柱应具有分离效能高、物化性质稳定、柱 容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和容量大、分辨率高、能快速保持生物分子

12、活性和 构象完好。构象完好。21阳离子交换树脂阳离子交换树脂：强酸型磺酸化的：强酸型磺酸化的 聚苯乙烯聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。二乙烯基苯共聚物。阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：只有在特殊情况下只有在特殊情况下 用于强酸性氨基酸的分析。用于强酸性氨基酸的分析。离子交换色谱法离子交换色谱法221 1、直接检测法、直接检测法 离子交换色谱法用于氨基酸分析时，可在离子交换色谱法用于氨基酸分析时，可在200nm200nm处对各种氨基酸进行直接检测，检出限处对各种氨基酸进行直接检测，检出限在在1 110 pmol10 pmol之间。之间。23（1 1）选择性差选择性差：生物样品中多种内源：生物样品中多

13、种内源 性成分在性成分在200 nm200 nm处均有吸收；处均有吸收；（2 2）背景高背景高：HPICHPIC常用的各种溶剂在常用的各种溶剂在 200 nm 200 nm处也有吸收。处也有吸收。直接检测的缺点直接检测的缺点242 2、柱后衍生化法、柱后衍生化法衍生化是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。衍生化是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有法检测，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外较强紫外或或荧光吸荧光吸收收的衍生物。的衍生物。为了提高灵敏度及选择性，一

14、般采用柱后衍生化，再用为了提高灵敏度及选择性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或荧光法对产物进行检测。紫外或荧光法对产物进行检测。常用衍生化试剂：茚三酮、邻苯二甲醛、荧光胺。常用衍生化试剂：茚三酮、邻苯二甲醛、荧光胺。25柱后衍生化法的优点柱后衍生化法的优点1 1、几乎不需要样品处理步骤，蛋白质水解产物可以、几乎不需要样品处理步骤，蛋白质水解产物可以直接进样分析直接进样分析；2 2、反应产物与副产物的混合物、反应产物与副产物的混合物无需分离无需分离；3 3、离子色谱柱的稳定性高，因而样品间的、离子色谱柱的稳定性高，因而样品间的重现性好重现性好；4 4、反应无需完成，产物也可以是多种。只要混合时、反

15、应无需完成，产物也可以是多种。只要混合时间及反应产物的比例是一定的，则分析的重现性间及反应产物的比例是一定的，则分析的重现性就不会受到影响。就不会受到影响。5 5、对反应产物的稳定性要求低，因为反应及检测几、对反应产物的稳定性要求低，因为反应及检测几乎是同时进行的。乎是同时进行的。26反相色谱分析法反相色谱分析法反相色谱法是以反相色谱法是以表面非极性载体为固定表面非极性载体为固定 相相，以极性，以极性溶剂为流动溶剂为流动 相的一种液相色谱分离模式。相的一种液相色谱分离模式。反相色谱分析法的反相色谱分析法的效率效率比离子色谱法比离子色谱法高高；用于氨基酸分析一般采用用于氨基酸分析一般采用柱前衍生

16、化柱前衍生化。衍生化不仅可。衍生化不仅可以提高氨基酸被检测的信号强度，而且可以提高氨基以提高氨基酸被检测的信号强度，而且可以提高氨基酸的疏水性，从而可以用反相色谱法进行分离。酸的疏水性，从而可以用反相色谱法进行分离。27柱前衍生气相色谱法柱前衍生气相色谱法气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱联用等优点。柱效高、容易和质谱联用等优点。氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极 性基团，需要先对其性基团，需要先对其衍生化衍生化。28两步法两步法是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化，是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化，然后再用各种

17、酸酐将然后再用各种酸酐将N-N-（OO、S S）基团乙酰）基团乙酰 化。化。一步法一步法是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡 啶介质中将氨基酸一步衍生化生成啶介质中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳烃基碳 氧酰烃基酯氧酰烃基酯。衍生化方法衍生化方法29毛细管电泳具有毛细管电泳具有微量微量、灵敏灵敏和和柱效高柱效高的的 特点，特点，适合于氨基酸适合于氨基酸手性分离手性分离和复杂样和复杂样 品中的氨基酸品中的氨基酸分析。分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用 两种分两种分离模式：离模式：毛细管区带电泳毛细管区带电泳和和胶束电动毛细管电胶束电动毛

18、细管电泳泳。检测方式主要有检测方式主要有紫外法紫外法和和荧光法荧光法。毛细管电泳法毛细管电泳法30毛细管电泳法可以进行毛细管电泳法可以进行柱前、柱内和柱后衍生化柱前、柱内和柱后衍生化。柱内衍生化柱内衍生化要求反应速度快，一般采用串联或要求反应速度快，一般采用串联或 “夹心饼夹心饼”两种形式，具有两种形式，具有试剂和样品用量少试剂和样品用量少的的 优点。优点。柱后衍生化柱后衍生化可以避免柱前或柱内衍生化时其他可以避免柱前或柱内衍生化时其他 化合物对衍生反应的干扰，缺点是柱后反应装化合物对衍生反应的干扰，缺点是柱后反应装 置体积大，会引起色谱峰变宽而降低分离效果。置体积大，会引起色谱峰变宽而降低分

19、离效果。毛细管电泳法毛细管电泳法31氨基酸选择性反应的分析方法氨基酸选择性反应的分析方法1 1、显色分析法、显色分析法2 2、荧光法、荧光法3 3、微生物方法、微生物方法4 4、酶分析法、酶分析法32显色分析法显色分析法有几种显色试剂只有当干扰物预先除去后有几种显色试剂只有当干扰物预先除去后才有定量分析的价值。才有定量分析的价值。在有些情况下可以通过改变试剂的组成或在有些情况下可以通过改变试剂的组成或反应条件以便进行某一种氨基酸的选择性反应条件以便进行某一种氨基酸的选择性测定。测定。33荧光法荧光法色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照 射下会产生荧光，其它氨

20、基酸与某些有机射下会产生荧光，其它氨基酸与某些有机 试剂反应之后其产物才会产生荧光。试剂反应之后其产物才会产生荧光。相对于显色法，荧光分析法的相对于显色法，荧光分析法的选择性和灵选择性和灵 敏度要好敏度要好。34微生物方法微生物方法微生物方法用于氨基酸分析的微生物方法用于氨基酸分析的原理原理是：有些微生物是：有些微生物的生长和复制需要特定氨基酸的存在。的生长和复制需要特定氨基酸的存在。在有限量的氨基酸存在下微生物的生长将受到限制。在有限量的氨基酸存在下微生物的生长将受到限制。利用利用浊度分析法浊度分析法或或测定乳酸生成量的增加测定乳酸生成量的增加可对微生可对微生物的生长进行评价。物的生长进行评

21、价。微生物方法适合于各种生物样品，可用于大量样品微生物方法适合于各种生物样品，可用于大量样品的批量分析，而且分析耗费低。的批量分析，而且分析耗费低。35酶分析法酶分析法一种酶对氨基酸某一种异构体的特异性一种酶对氨基酸某一种异构体的特异性可可 以用于以用于D D或或L L型氨基酸的测定。在这一应用型氨基酸的测定。在这一应用 中氨基酸氧化酶非常有用。中氨基酸氧化酶非常有用。36存在的问题及发展趋势存在的问题及发展趋势氨基酸分析中最主要的问题是来自氨基酸分析中最主要的问题是来自环境的氨基环境的氨基酸的干扰酸的干扰；微量氨基酸的分析微量氨基酸的分析仍然是一个富有挑战性的课仍然是一个富有挑战性的课题；题；氨基酸构型分析及手性拆分氨基酸构型分析及手性拆分也是国内外研究的也是国内外研究的热点。热点。37研究应用研究应用-蒸发光散射法蒸发光散射法38研究应用研究应用-测定血浆中氨基酸测定血浆中氨基酸39研究应用研究应用-口服水解蛋白成分分析口服水解蛋白成分分析40研究应用研究应用-羊肉氨基酸成分分析羊肉氨基酸成分分析41研究应用研究应用-鱼肉中氨基酸含量分析鱼肉中氨基酸含量分析42研究应用研究应用-慢性肝病研究慢性肝病研究