《分子杂交技术》PPT课件.ppt

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1、第九章第九章 分子杂交技术分子杂交技术Hybridization technique 概念：概念：概念：概念：在在在在DNADNA与与与与DNADNA，DNADNA与与与与RNARNA之间，存在之间，存在之间，存在之间，存在 着着着着碱基互补的关系，在加热或碱基互补的关系，在加热或碱基互补的关系，在加热或碱基互补的关系，在加热或加入变性剂等条件下，加入变性剂等条件下，加入变性剂等条件下，加入变性剂等条件下，DNADNA双链之间的氢键被破坏，双双链之间的氢键被破坏，双双链之间的氢键被破坏，双双链之间的氢键被破坏，双链解开成为单链，此时加入链解开成为单链，此时加入链解开成为单链，此时加入链解开成为

2、单链，此时加入有互补序列的有互补序列的有互补序列的有互补序列的DNADNA或或或或RNARNA，在一定离子强度和温度下保在一定离子强度和温度下保在一定离子强度和温度下保在一定离子强度和温度下保温，则加入的温，则加入的温，则加入的温，则加入的DNADNA或或或或RNARNA可可可可与模板链形成稳定的与模板链形成稳定的与模板链形成稳定的与模板链形成稳定的DNA-DNA-DNADNA或或或或DNA-RNADNA-RNA异源双链，异源双链，异源双链，异源双链，此过程称为杂交。此过程称为杂交。此过程称为杂交。此过程称为杂交。主主 要要 内内 容容l l核酸杂交的基本理论核酸杂交的基本理论l l核酸探针核

3、酸探针l l核酸分子杂交方法核酸分子杂交方法l l蛋白质分子杂交蛋白质分子杂交第一节 核酸杂交的基本理论DNA的变性与复性l lDNA变性l l方法方法l l热变性：热变性：9010090100l l酸碱变性：常采用碱变性酸碱变性：常采用碱变性l l化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等l l特点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解特点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解温度温度(melting temperature,T(melting temperature,Tmm)l lDNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/R

4、NADNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等等核酸分子杂交的原理核酸分子杂交的原理第二节 核酸探针探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异性结合的核酸分子DNA/RNA探针探针探针探针主主要要内内容容探针的分类探针的分类探针的标记探针的标记 标记物标记物一、探针的分类一、探针的分类l DNA探针探针 l cDNA探针探针l RNA探针探针 l 寡核苷酸探针寡核苷酸探针根据核酸探针的来源及性质可分为：这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁殖，制备方法简便。这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁殖，制备方法简便。DNA探针不易降解（相对探针不易降解（相对RNA而言）而言）DNA探针的标

5、记方法较成熟探针的标记方法较成熟lcDNA探探针针 用这种技术获得的用这种技术获得的DNADNA探针不含有内含子序列。因此尤其适探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。用于基因表达的检测。DNA探针探针（包括（包括cDNA探针）探针）的主要优点的主要优点有下面三点：有下面三点：RNARNA探针探针的主要优点有的主要优点有RNA/RNARNA/RNA和和RNA/DNARNA/DNA杂交体的稳定性较杂交体的稳定性较DNA/DNADNA/DNA杂交体的稳杂交体的稳定性高，因而杂交的特异性更高。定性高，因而杂交的特异性更高。单链单链RNARNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待分子

6、由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸顺序杂交的效率较高。测核酸顺序杂交的效率较高。RNARNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。杂交后可用杂交后可用RnaseRnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。底降低。由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。寡寡核核苷苷酸酸探探针针可可识识别别靶靶序序列列内内1 1个个碱碱基基的的变变化化，因因为为短短探针中碱基的错配能大幅度地

7、降低杂交体的探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的TmTm值。值。一一次次可可大大量量合合成成寡寡核核苷苷酸酸探探针针（110mg），使使得得这这种种探探针针价价格格低低廉廉，与与克克隆隆探探针针一一样样，寡寡核核苷苷酸酸探探针针能能够够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针l l切口平移法切口平移法(nick translation)(nick translation)l l随机引物法随机引物法l l聚合酶链式反应法聚合酶链式反应法l T4T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA5DN

8、A5末端末端l lDNADNA快速末端标记快速末端标记l l化学标记技术化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上核酸上二、探针的标记 切口平移法切口平移法该技术由该技术由Kelly等于等于1970年创立。年创立。其原理是首先用其原理是首先用DNA酶在双链酶在双链DNA探针分子的一条链上制探针分子的一条链上制造一些切口（造一些切口（nick）,切口处会形成切口处会形成3羟基末端，这时再在羟基末端，这时再在大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在的催化下将核苷酸残基加在3羟基羟基上，同时，根据大肠杆菌酶上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶

9、聚合酶I的的53核酸外切酶核酸外切酶活性，此酶将缺口活性，此酶将缺口5侧核苷酸依次切除。侧核苷酸依次切除。其结果是在切口平移。其结果是在切口平移。用切口平移法标记的用切口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。探针能满足大多数杂交要求。随机引物延伸随机引物延伸（random primer)random primer)这是以单链这是以单链DNADNA或或RNARNA模板合成高比活性模板合成高比活性3232P P标记探针所选标记探针所选用的方法。用的方法。原理是使长原理是使长6 68nt8nt的寡核苷酸片段与变性的的寡核苷酸片段与变性的DNADNA或或RNARNA模板模板退火，在退火，在DNA

10、DNA聚合酶聚合酶I I或反转录酶的作用下，以每一个退火或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNADNA链的合成，在反应链的合成，在反应时将时将-3232PdNTPPdNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针的探针DNADNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板与模板DNADNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物随机发生退火反应，因此被称为

11、随机引物（random primerrandom primer）。）。这种随机引物可用小牛胸腺这种随机引物可用小牛胸腺DNADNA或鱼精或鱼精DNADNA制备。制备。聚合酶链反应聚合酶链反应PCRPCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性活性DNADNA探针。探针。PCRPCR技术具有很高的特异性，可在技术具有很高的特异性，可在1 12h2h之内大量合成探之内大量合成探针针DNADNA片段，如果在底物中加入片段，如果在底物中加入-32PdNTP-32PdNTP或其它标记的或其它标记的dNTPdNTP，则探针则探针DNADNA合成过程中

12、可得到很好的标记，标记物的合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达掺入率可高达70%70%80%80%。因此，因此，PCRPCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。记。该法的缺点是要合成一对特异性该法的缺点是要合成一对特异性PCRPCR引物。引物。使用从探针使用从探针DNADNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。记效果。T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA5末端末端 寡核苷酸探针或短的寡核苷酸探针或短的RNARNA和和DNADNA探针可选用此法标记，探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多

13、用这种方法标记。在大肠杆菌寡核苷酸探针一般多用这种方法标记。在大肠杆菌T4T4噬噬菌体多聚核苷酸激酶（菌体多聚核苷酸激酶（T4PNKT4PNK）的催化下，将）的催化下，将-3232P-ATPP-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的上的磷酸连接到寡核苷酸的5 5末端上。要求标记的寡核末端上。要求标记的寡核苷酸苷酸5 5端必须带羟基。反应式为：端必须带羟基。反应式为：三、标记物l l放射性同位素放射性同位素1 1）灵敏度极高，可以检测）灵敏度极高，可以检测）灵敏度极高，可以检测）灵敏度极高，可以检测1010-14-141010-18-18 g g 的物质。最适条的物质。最适条的物质。最适条的物质。最适条

14、件下，可以测出样品中少于件下，可以测出样品中少于件下，可以测出样品中少于件下，可以测出样品中少于10001000个分子的核酸含量。个分子的核酸含量。个分子的核酸含量。个分子的核酸含量。2 2）放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。定性和杂

15、交性质。定性和杂交性质。定性和杂交性质。3 3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。其缺点是：其缺点是：其缺点是：其缺点是：1 1）放射性污染。）放射性污染。）放射性污染。）放射性污染。2 2）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。3 3）半衰期短，标记后立即使用（）半衰期短，标记后立即使用（）半衰期短，标记

16、后立即使用（）半衰期短，标记后立即使用（3232P/14.3d P/14.3d 3535S/87.1dS/87.1d 3 3H/12.1yH/12.1y ）。）。）。）。常用的放射性同位素有：常用的放射性同位素有：1）32P放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短，放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短，灵敏度高。广泛应用于各种滤膜杂交和液相杂交。灵敏度高。广泛应用于各种滤膜杂交和液相杂交。射线散射严重，分辨率不高射线散射严重，分辨率不高2）35S 可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高（可用于核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。（可用

17、于核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。灵敏度较灵敏度较P低低3）3H 散射极少，半衰期长散射极少，半衰期长 自显影时间较长自显影时间较长4）125I、131I 散射小，分辨率高，显影时间比散射小，分辨率高，显影时间比H短很多。短很多。具有挥发性，吸入后蓄积具有挥发性，吸入后蓄积非放射性标记物有下述几类：金属如Hg，荧光物质如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过氧化物酶（HRP）；半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AP）等。非放射性同位素非放射性同位素无放射性、稳定性好无放射性、稳定性好灵敏度及特异性不高灵敏度及特异性不高图20-4生物素标记核酸探针荧光免疫反应图解图图 生物素标记核酸探针

18、荧光免疫反应图解生物素标记核酸探针荧光免疫反应图解非放射性探针标记的显色体系l lAPAPAPAP显色体系显色体系显色体系显色体系：AP APBCIP BCI-OH +NBTBCIP BCI-OH +NBT紫色紫色BCIPBCIP：5 5溴溴-4-4氯氯-3-3吲哚磷酸，吲哚磷酸，NBTNBT：四氮唑蓝：四氮唑蓝l lHRPHRPHRPHRP显色体系显色体系显色体系显色体系：HRPHHRPH2 2O O2 2DAB2NHDAB2NH2 2 棕色棕色+2H+2H+H+H2 2O O l lABCABCABCABC显色体系显色体系显色体系显色体系：DNA B+SA APDNA B SA-APDNA

19、 B+SA APDNA B SA-AP或或DNA B+SA-BAPDNA DNA B+SA-BAPDNA B SA BAPB SA BAP 经上述两反应，把经上述两反应，把APAP连接在连接在DNADNA上以后，再进行上以后，再进行APAP酶显色。酶显色。SA SA为为StreptavidinStreptavidin（链霉亲合素），（链霉亲合素），BAPBAP为生物素化的磷酸酶，为生物素化的磷酸酶，B B为生为生物素（物素（biotin biotin），），ABCABC为为Avidin Biotin-Enzyme complex,Avidin Biotin-Enzyme complex,即即亲

20、合素亲合素-生物素生物素-酶复合物。酶复合物。B B和和SASA还可以换成还可以换成DIGDIG和和ANTIANTIDIGDIG 在选择标记方法时，应考虑实验的要求在选择标记方法时，应考虑实验的要求 一般认为放射性探针比非放射性探一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。较稳定的碱性磷酸酶显示系统。第三节 核酸

21、分子杂交的类型l l固相杂交固相杂交 菌落原位杂交（菌落原位杂交（Colony in situ hybridizationColony in situ hybridization）斑点杂交（斑点杂交（Dot blotDot blot）Southern Southern印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交（southern blot southern blot）Northern Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotNorthern blot）组织原位杂交（组织原位杂交（Tissue in situ hybridizationTissue in situ hybridizat

22、ion）l l液相杂交液相杂交 固相支持物应具备的特点：固相支持物应具备的特点：1)具有较强的结合核酸分子的能力（具有较强的结合核酸分子的能力（10 g/cmcm2 2）2)与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。3)与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作 过程。过程。4)非特异性吸附少。非特异性吸附少。5)具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。1、固相杂交支持物的选择几种常用固相支持物几种常用固相支持物1)硝酸纤维素虑膜（硝酸纤维素虑膜（nitrocellulo

23、se filter membrane）具有较强吸附单链具有较强吸附单链DNA和和RNA的能力（高盐下达的能力（高盐下达 80 g/cmcm2 2 100 g/cmcm2 2）。）。真空烘干后，依靠疏水性相互作用。真空烘干后，依靠疏水性相互作用。杂交本底较低。杂交本底较低。不易反复杂交和洗膜（结合力）不易反复杂交和洗膜（结合力）质地较脆，烘烤后更甚，小心操作质地较脆，烘烤后更甚，小心操作与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，不易核酸电转不易核酸电转2)尼龙膜（尼龙膜（nylon membrane）结合单链结合单链DNA和和RNA的能力比的能力比NC膜强（达膜强（达

24、350 g/cmcm2 2 500 g/cmcm2 2）。）。真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后照射后,部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA 变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。韧性较强，操作方便。韧性较强，操作方便。能结合小分子核酸。能结合小分子核酸。低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。可反复杂交和洗膜。可反复杂交和洗膜。杂交本底较高

25、杂交本底较高2、固相杂交的一般程序流程流程流程流程1.DNA1.DNA的变性的变性的变性的变性2.2.变性的变性的变性的变性的DNADNA在硝酸纤维薄膜上的固定在硝酸纤维薄膜上的固定在硝酸纤维薄膜上的固定在硝酸纤维薄膜上的固定3.3.预杂交预杂交预杂交预杂交4.4.杂交杂交杂交杂交5.5.洗膜洗膜洗膜洗膜6.6.检测检测检测检测 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出裂菌以释出DNA。将。将DNA烘干固定于膜

26、上烘干固定于膜上与与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。落杂交信号，并与平板上的菌落对位。3、固相核酸分子杂交类型斑点杂交（斑点杂交（Dot blot）斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如），如Minifold I和和II、Bio-Dot(Bio Rad)和和

27、Hybri Dot,它们有许多孔，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。膜就可以进行杂交。Southern 印迹杂交l l1975年，英国Southern创建l lDNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。流程流程流程流程1.1.1.1.将核酸分子酶切成将核酸分子酶切成将核酸分子酶切成将核酸分子酶切成为多个片段为多个片段为多个片段为多个片段2.2.2.

28、2.变性电泳（或者电变性电泳（或者电变性电泳（或者电变性电泳（或者电泳之后变性），泳之后变性），泳之后变性），泳之后变性），使各片段分离使各片段分离使各片段分离使各片段分离3.3.3.3.将凝胶中的核酸片将凝胶中的核酸片将凝胶中的核酸片将凝胶中的核酸片段转移到固相支段转移到固相支段转移到固相支段转移到固相支持物上持物上持物上持物上4.4.4.4.预杂交预杂交预杂交预杂交 杂交杂交杂交杂交5.5.5.5.洗膜洗膜洗膜洗膜6.6.6.6.检测检测检测检测 流程流程流程流程1.1.1.1.将核酸分子酶切成将核酸分子酶切成将核酸分子酶切成将核酸分子酶切成为多个片段为多个片段为多个片段为多个片段2.2.

29、2.2.变性电泳（或者电变性电泳（或者电变性电泳（或者电变性电泳（或者电泳之后变性），泳之后变性），泳之后变性），泳之后变性），使各片段分离使各片段分离使各片段分离使各片段分离3.3.3.3.将凝胶中的核酸片将凝胶中的核酸片将凝胶中的核酸片将凝胶中的核酸片段转移到固相支段转移到固相支段转移到固相支段转移到固相支持物上持物上持物上持物上4.4.4.4.预杂交预杂交预杂交预杂交 杂交杂交杂交杂交5.5.5.5.洗膜洗膜洗膜洗膜6.6.6.6.检测检测检测检测Northern 印迹杂交印迹杂交l l检测RNA（主要是mRNA）的方法l l与Southern杂交的不同l l靶核酸：靶核酸：RNARNA

30、l lRNARNA电泳电泳l l转膜：不需变性转膜：不需变性u组组织织原原位位杂杂交交简简称称原原位位杂杂交交，指指组组织织或或细细胞胞的的原原位位杂交，它与菌落的原位杂交不同。杂交，它与菌落的原位杂交不同。u原原位位杂杂交交是是经经适适当当处处理理后后，使使细细胞胞通通透透性性增增加加，让让探探针针进进入入细细胞胞内内与与DNADNA或或RNARNA杂杂交交。因因此此,原原位位杂杂交交可可以以确确定定探探针针的的互互补补序序列列在在胞胞内内的的空空间间位位置置，这这一一点点具具有重要的生物学和病理学意义。有重要的生物学和病理学意义。u原原位位杂杂交交还还是是显显示示细细胞胞亚亚群群分分布布和

31、和动动向向及及病病原原微微生生物存在方式和部位的一种重要技术。物存在方式和部位的一种重要技术。组织原位杂交组织原位杂交 （Tissue in situ hybridizationTissue in situ hybridization）第四节 蛋白质分子杂交l l自从1975年苏格兰爱丁堡大学Southern EM 首先提出DNA的印迹术（Southern Blotting)以来，给后人许多的启示，1977年Alwine将此技术应用于RNA的研究Nouthern Blotting。1979年，Towbin等人首先将印迹术引入对抗原（蛋白质）的检测Immunoblotting，Western b

32、lotting。WESTERN BLOTTING其基本过程为：其基本过程为：其基本过程为：其基本过程为：（1 1）首先做蛋白质的）首先做蛋白质的）首先做蛋白质的）首先做蛋白质的SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳电泳电泳。（2 2）然后将凝胶中的蛋白质）然后将凝胶中的蛋白质）然后将凝胶中的蛋白质）然后将凝胶中的蛋白质电转印电转印电转印电转印到固相膜上。到固相膜上。到固相膜上。到固相膜上。（3 3）在膜上以相应的抗体进行）在膜上以相应的抗体进行）在膜上以相应的抗体进行）在膜上以相应的抗体进行抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应。（4 4）显色。）显色。）显色。）显色。本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的抗原。抗原。抗原。抗原。转膜Protein HRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、显色