生物化学合工大第三章酶.ppt

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1、第三章第三章第三章第三章 酶酶酶酶 第一节第一节 酶通论酶通论 第二节第二节 酶促反应动力学酶促反应动力学 第三节第三节 酶的作用机制酶的作用机制 第四节第四节 酶的活性调节酶的活性调节第一节第一节 酶通论酶通论一、酶的研究历史一、酶的研究历史l1857巴斯德提出酒精发酵是巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果酵母细胞活动的结果。1分子分子Glc2分子乙醇分子乙醇+2分子分子CO2 从从Glc开始，开始，经过经过12种酶催化，种酶催化，12步反应，生成乙醇。步反应，生成乙醇。1897Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵不含细

2、胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。1913Michaelis和和Menten提出提出米氏学说米氏学说酶促动力学原理。酶促动力学原理。1926Sumner首次从刀豆中提出脲酶结首次从刀豆中提出脲酶结晶，并晶，并证明具有蛋白质性质证明具有蛋白质性质。1930年年Northrop等得到了胃蛋白酶、等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了一步证明了酶是蛋白质酶是蛋白质。l 1969 化学合成核糖核酸酶。化学合成核糖核酸酶。l 1967-1970 从从E.coli 中发现第中发现第I、第、第II类限制性类限制性 核酸内切酶。核酸内切酶。20世纪世纪80年

3、代发现年代发现某些某些RNA有催化活性，有催化活性，还有还有一些抗体也有催化活性，一些抗体也有催化活性，甚至甚至有些有些DNA也有催化活性，也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。到很大冲击。某些某些RNA有催化活性有催化活性（ribozyme，核酶），核酶）1982年美国年美国T.Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNA前体前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性有催化活性。Thomas Cech University of Colorado at Boulder,USA 1983年

4、美国年美国S.Altman等研究等研究RNaseP（由（由20%蛋蛋白质和白质和80%的的RNA组成），发现组成），发现RNaseP中的中的RNA可催化可催化E.coli tRNA的前体加工。的前体加工。Sidney Altman Yale University New Haven,CT,USA Cech和和Altman各自独立地发现了各自独立地发现了RNA的催化活的催化活性，并命名这一类酶为性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶）（核酶），2人共同人共同获获1989年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。1Cell vol 31,147157，1982年。2Sci.Amer.Vol 255,64

5、75，1986。抗体酶（抗体酶（abzyme）抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区 （即肽链的（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区端）是识别抗原的活性区域，这部分区 域被赋予了酶的属性。域被赋予了酶的属性。1986年美国年美国Schultz和和Lerner两个实验室同时在两个实验室同时在Science上上发表论文，报道他们成功地运用单克隆抗体技术制备了具有发表论文，报道他们成功地运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（酶活性的抗体（catalyti

6、c antibody）。）。有些有些DNA也有催化活性也有催化活性（脱氧核酶，（脱氧核酶，Deoxyribozyme）1995年年Cuenoud等发现有些等发现有些DNA分子亦分子亦具有催化活性。具有催化活性。酶及生物催化剂概念的发展克隆酶、遗传修饰酶克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：蛋白质类：Enzyme(天然酶、生物工程酶天然酶、生物工程酶)核酸类：核酸类：Ribozyme;Deoxyribozyme模拟生物催化剂模拟生物催化剂二、酶的概念二、酶的概念 酶酶是一类由活性细胞产生的具有催化作是一类由活性细胞产生的具有催化作用

7、和高度专一性的特殊用和高度专一性的特殊蛋白质或核酸蛋白质或核酸。简单说，酶是一类由活性细胞产生的简单说，酶是一类由活性细胞产生的生生物催化剂物催化剂。三、酶作为生物催化剂的特点三、酶作为生物催化剂的特点 1高效性高效性 2专一性专一性 3反应条件温和反应条件温和 4.酶的催化活性可调节控制酶的催化活性可调节控制酶的催化效率比化学催化剂高酶的催化效率比化学催化剂高10107-7-10101313 倍，比非倍，比非催化反应高催化反应高10108-8-10102020 倍。倍。例如：过氧化氢分解例如：过氧化氢分解 2 2H H2 2O O2 2 2H 2H2 2O +OO +O2 2 用用Fe+Fe

8、+催化，效率为催化，效率为661010-4-4 mol/molSmol/molS，而用而用过氧化氢酶催化，效率为过氧化氢酶催化，效率为6 106 106 6 mol/molSmol/molS。用用-淀粉酶催化淀粉水解，淀粉酶催化淀粉水解，1 1克结晶酶在克结晶酶在6565 C C条条件下可催化件下可催化2 2吨淀粉水解。吨淀粉水解。1 1高效性高效性E+SP+EES能量能量水平水平反应过程反应过程 G E1 E2转换数转换数（turnover number,TN or kcat）:每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底

9、物的摩尔数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。数。即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。可分为：专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。可分为：绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个 反应，反应，而不作用于任何其它物质。而不作用于任何其它物质。相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作 用。包括用。包括键专一性和基团专一性键专一性和基团专一性。立体异构专一性：这类酶不能辨别底物不同的立体异构立体异构专一性：这类酶不

10、能辨别底物不同的立体异构 体，只对其中的某一种构型起作用，而体，只对其中的某一种构型起作用，而 不催化其他异构体。包括不催化其他异构体。包括光学专一性光学专一性 和几何异构专一性和几何异构专一性。2 2专一性专一性基团基团(group)专一性。专一性。如如-葡萄糖苷酶，葡萄糖苷酶，催化由催化由-葡萄糖所构成的糖苷水解，但葡萄糖所构成的糖苷水解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。对于糖苷的另一端没有严格要求。键键(Bond)专一性。如酯酶催化酯的水解，专一性。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严格的要求。对于酯两端的基团没有严格的要求。相对专一性相对专一性酶促反应一般在常温、常压、中性酶促反

11、应一般在常温、常压、中性pH pH 条件下进行。条件下进行。高温或其它苛刻的物理或化学条件，高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。将引起酶的失活。3 3反应条件温和反应条件温和4.4.酶的催化活性可调节控制酶的催化活性可调节控制 如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。调节、酶原激活及激素控制等。某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关离子有关。（一）根据酶的化学组成分类：（一）根据酶的化学组成分类：1 单纯酶：单纯酶：只含有蛋白质成分，如：只含有蛋白质成分，如：脲酶、溶菌脲酶、溶菌 酶、淀粉酶、脂肪

12、酶、核糖核酸酶等。酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。2 结合酶结合酶：含有蛋白成分（酶蛋白）：含有蛋白成分（酶蛋白）决定酶的专一性决定酶的专一性 和非蛋白成分（辅助因子）和非蛋白成分（辅助因子）传递电子、原子或某传递电子、原子或某 些化学基团（决定反应类型）。些化学基团（决定反应类型）。四、酶的分类四、酶的分类全酶全酶 =酶蛋白酶蛋白+辅助因子辅助因子辅助因子辅助因子与酶蛋白结合比较疏松的小分子有机物。与酶蛋白结合比较疏松的小分子有机物。与酶蛋白结合紧密的小分子有机物。与酶蛋白结合紧密的小分子有机物。金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。金属离子金属离子 辅酶辅酶辅基辅基酶蛋白和辅助因子

13、单独存在均无催化活性，只有二者酶蛋白和辅助因子单独存在均无催化活性，只有二者结合为全酶才有催化活性。结合为全酶才有催化活性。参参与与的的酶酶促促反反应应主主要要为为氧氧化化-还还原原反反应或基团转移反应。应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性大多数辅酶的前体主要是水溶性 B B 族维生素。许多维生素的生理功能族维生素。许多维生素的生理功能与辅酶的作用密切相关。与辅酶的作用密切相关。辅酶在酶促反应中的作用特点辅酶在酶促反应中的作用特点辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。每每一一种种辅辅酶酶都都具具有有特特殊殊的的功功能能，可可以以特特定定地地催催某

14、某一类型的反应。一类型的反应。同同一一种种辅辅酶酶可可以以和和多多种种不不同同的的酶酶蛋蛋白白结结合合形形成成不不同的全酶。同的全酶。一一般般来来说说，全全酶酶中中的的辅辅酶酶决决定定了了酶酶所所催催化化的的类类型型（反反应应专专一一性性），而而酶酶蛋蛋白白则则决决定定了了所所催催化化的的底底物类型（底物专一性）。物类型（底物专一性）。（二）根据酶蛋白结构特点分类（二）根据酶蛋白结构特点分类单体体酶：由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子。由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子。一般一般为水解水解酶。寡聚寡聚酶：由两条或多条肽链组成的酶分子。由两条或多条肽链组成的酶分子。为大多数大多数酶。多多

15、酶复合体：复合体：由多种由多种酶彼此彼此镶嵌成的复合体嵌成的复合体,它它们相相互配合依次互配合依次进行行，催化，催化连续的的 一系列一系列相关相关反反应。丙丙酮酸脱酸脱氢酶复合体。复合体。多功能多功能酶：一条多肽链上含有两种或两种以上催化活一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。性的酶，往往是基因融合的产物。脂肪酸合成脂肪酸合成酶。五、酶的命名五、酶的命名（1 1）习惯命名方法）习惯命名方法 1.1.根据作用根据作用底物底物来命名，如来命名，如淀粉酶淀粉酶、蛋白酶蛋白酶等。等。2.2.根据所催化的根据所催化的反应的类型反应的类型命名，如命名，如脱氢酶脱氢酶、转转移酶移

16、酶等。等。3.3.两个原则结合起来命名，如两个原则结合起来命名，如丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶等。等。4.4.根据酶的根据酶的来源或其它特点来源或其它特点来命名，如来命名，如胃蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶胰蛋白酶等。等。(2)(2)国际系统命名法国际系统命名法 系统名称包括底物名称、构型、反应性质。系统名称包括底物名称、构型、反应性质。例如：例如：酶催化的反应酶催化的反应:谷氨酸谷氨酸+丙酮酸丙酮酸 -酮戊二酸酮戊二酸+丙氨酸丙氨酸 习惯名称习惯名称:谷丙转氨酶谷丙转氨酶 系统名称系统名称:丙氨酸：丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶 (3)酶的国际分类法及编号酶的国际分类法及编号 国际酶

17、学委员会根据酶催化的反应类型，将国际酶学委员会根据酶催化的反应类型，将酶分为六大类，分别用酶分为六大类，分别用1、2、3、4、5、6的编号来表示。的编号来表示。氧化氧化-还原酶催化氧化还原酶催化氧化-还原反应。还原反应。主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase)(Oxidase)。如如:乳酸乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1 氧化氧化-还原酶还原酶 OxidoreductaseAH2+B（O2）+BH2（H2O2，H2O）A转移酶催化基团转移反应，即将一个

18、底物分子的转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2 转移酶转移酶 TransferasevAX+BA+BX水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：3 3 水解酶水解酶 hydrolase hydrolase AOH+BHAB+H2O裂合酶催化从底物分子中移

19、去一个基团或裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，例如，延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。4 裂合酶裂合酶 LyaseABA+B异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。底物分子内基团或原子的重排过程。例如，例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。5 异构酶异构酶 IsomeraseAB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类常见的有消旋和变旋、醛

20、酮异构、顺反异构和变位酶类。合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。键的形成反应。这类反应必须与这类反应必须与ATPATP分解反应相互偶联分解反应相互偶联。A+B+ATP+H2O=AB+ADP+Pi A+B+ATP+H2O=AB+ADP+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应例如，丙酮酸羧化酶催化的反应:丙酮酸丙酮酸 +CO2+ATP+H2O CO2+ATP+H2O 草酰乙酸草酰乙酸+ADP+Pi+ADP+Pi 6 合成酶合成酶 Ligase or Synthetase 核酶是唯一的非蛋白酶。它是

21、一类特殊的核酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNARNA，能够催化能够催化RNARNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。应。7 核酶（催化核酸）核酶（催化核酸）ribozyme 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的顺序编号每个酶都有一个有四个数字组成的编号每个酶都有一个有四个数字组成的编号六、六、酶活力酶活力的测定的测定 1.酶活力酶活力:又称为酶活性，指又称为酶活性，指酶催化一定化学酶催化一定化学反应的能力反应的能力。通常。通常以在一定条件下酶所催化的以在一定条件

22、下酶所催化的化学反应化学反应(初初)速度来表示速度来表示。因此酶活力可用因此酶活力可用单位时间内底物的减少量或单位时间内底物的减少量或产产物的增加量物的增加量表示表示，单位为浓度，单位为浓度/单位时间。单位时间。研研究究酶酶促促反反应应速速度度，以以酶酶促促反反应应的的初初速速度度为准（底物消耗低于为准（底物消耗低于5%）。）。酶促反应的速度曲线酶促反应的速度曲线2.酶活力测定的基本原理酶活力测定的基本原理 一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白浓度一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白浓度,而是测定其催化化学反应的能力。这是基于而是测定其催化化学反应的能力。这是基于 在最优化条件下在最优化条件下(最

23、适温度、最适最适温度、最适pHpH、最适缓冲液等、最适缓冲液等)，当底物足够（过量，当底物足够（过量，SE），在酶促反应的初始阶段，在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比 （即（即V=KV=KE E）。故酶活力测定的是化学反应速度，）。故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。一定条件下可代表酶活性分子浓度。3.3.酶活力的表示方法酶活力的表示方法(1)(1)酶活力单位酶活力单位U U（UnitUnit）：是衡量酶活力大小的计量单位是衡量酶活力大小的计量单位,又称又称酶单位，酶单位，规定条件（最适条件）下一定时

24、间内催化完规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。成一定化学反应量所需的酶量。根据不同情况有几种酶活力单位：根据不同情况有几种酶活力单位：国际单位国际单位IUIU：19611961年，年，在最适条件下每分钟转化在最适条件下每分钟转化1 1mol mol 底物底物所需要的酶量为一个酶活力单位。所需要的酶量为一个酶活力单位。即即1IU=11IU=1mol/minmol/min国际单位国际单位KatKat：19721972年，指在最适条件下年，指在最适条件下1 1秒钟内转化秒钟内转化1mol1mol 底物所需的酶量。底物所需的酶量。即即 1 Kat=1mol/s 1 Kat

25、=1mol/s Kat和和IUIU的换算关系的换算关系：1 Kat=6107 7 IUIU，1 IUIU=16.67n Kat习惯单位习惯单位:在实际使用中在实际使用中,不同酶有各自的规定不同酶有各自的规定,如如:糖化酶活力单位糖化酶活力单位:在规定条件下在规定条件下,每小时转化可溶性淀粉每小时转化可溶性淀粉产生产生1mg1mg还原糖还原糖(以葡萄糖计以葡萄糖计)所需的酶量为所需的酶量为1 1个酶单位。个酶单位。蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生产生1 1gg酪氨酸所需的酶量。酪氨酸所需的酶量。(2)(2)比活力（比活力（spe

26、cific activityspecific activity）酶的比活力（比活性）：每单位（一般是酶的比活力（比活性）：每单位（一般是mgmg）蛋白质中）蛋白质中 的酶活力单位数（酶单位的酶活力单位数（酶单位/mg/mg蛋白）。蛋白）。实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位单位/mL/mL（液体制剂），酶单位（液体制剂），酶单位/g/g（固体制剂），（固体制剂），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质（含杂质越少），所以越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标比

27、活力是评价酶纯度高低的一个指标。在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念：在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念：纯化倍数与回收率纯化倍数与回收率纯化倍数纯化倍数=某纯化操作后的比活力某纯化操作后的比活力/第一步操作后的比活力第一步操作后的比活力回收率回收率=某纯化操作后的总活力某纯化操作后的总活力/第一步操作后的总活力第一步操作后的总活力 总活力单位体积的酶活力总活力单位体积的酶活力(U/ml)分离溶液总体积分离溶液总体积(ml)第二节第二节 酶促反应动力学酶促反应动力学 酶促反应动力学是研究酶促反应动力学是研究酶促反应的速度酶促反应的速度以及以及影影响酶反应速度的各种

28、因素响酶反应速度的各种因素的科学。的科学。影响酶反应速度的因素有：影响酶反应速度的因素有：底物浓度、酶浓度、温度、底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。值、激活剂、抑制剂等。在低底物浓度时在低底物浓度时,反应速反应速度与底物浓度成正比，为度与底物浓度成正比，为一级反应。一级反应。底物浓度增大与速度的增底物浓度增大与速度的增加不成正比加不成正比,为混合级反应为混合级反应.当底物浓度达到一定值，当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大合后，反应速度达到最大值（值（V V maxmax），此时再增加），此时再增加底物浓度，反应速度不再底物浓

29、度，反应速度不再增加，表现为零级反应。增加，表现为零级反应。一、一、底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响(一一)V-S)V-S曲线曲线底物浓度对酶促反应初速度的影响V 初初V maxu1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程米氏方程。（二）米氏方程（二）米氏方程 根据中间产物学说，酶促反应分两步进行根据中间产物学说，酶促反应分两步进行:米氏方程的推导：米氏方程的推导：米氏方程米氏方程n当反应速度等于最大速度当反应速度等于最大速度一半时一半时,即即V

30、V=1/2 =1/2 V Vmaxmax,K Km=S m=S n上式表示上式表示,米氏常数是反米氏常数是反应速度为最大值的一半时的应速度为最大值的一半时的底物浓度。底物浓度。n因此因此,米氏常数的单位为米氏常数的单位为mol/Lmol/L。（三）米氏常数的意义及测定（三）米氏常数的意义及测定K Km m 米氏常数米氏常数V Vmax max 最大反应速度最大反应速度米氏常数米氏常数KmKm的意义的意义不同的酶具有不同不同的酶具有不同K Km m值，它是酶的一个重值，它是酶的一个重要的特征物理常数。要的特征物理常数。KmKm值只是在固定的底物，一定的温度和值只是在固定的底物，一定的温度和pHp

31、H条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的条件下具有不同的KmKm值。值。K Km m值表示酶与底物之间的亲和程度：值表示酶与底物之间的亲和程度：K Km m值值大表示亲和程度小，酶的催化活性低大表示亲和程度小，酶的催化活性低;K Km m值小表示亲和程度大值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。酶的催化活性高。米氏常数的测定米氏常数的测定基基本本原原则则：将将米米氏氏方方程程变变化化成成相相当当于于y=ax+b的的直线方程，再用作图法求出直线方程，再用作图法求出Km。例：例：双倒数作图法双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）法）米氏方程的

32、双倒数形式：米氏方程的双倒数形式：1 1 K Km 1 1m 1 1 =+V V V Vmax S max S V Vmaxmax取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数米氏常数KmKm的的测定：测定：酶的酶的Km在实际应用中的意义在实际应用中的意义鉴定酶：通过测定鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。反应的酶是否是属于同一种酶。判断酶的最适底物（天然

33、底物）判断酶的最适底物（天然底物）。计算一定速度下底物浓度。计算一定速度下底物浓度。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。判断反应方向或趋势。判断反应方向或趋势。判断抑制类型。判断抑制类型。二、酶浓度对酶反应速度的影响二、酶浓度对酶反应速度的影响 在有足够底物和其他条件不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比。当SE时，V=K3E 三、温度对酶反应速度的影响三、温度对酶反应速度的影响 一方面是温度升高一方面是温度升高,酶酶促反应速度加快。促反应速度加快。另一方面另一方面,温度升高温度升高,酶酶的高级结构将发生变化的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降或变性，导致酶活

34、性降低甚至丧失。低甚至丧失。因此大多数酶都有一个因此大多数酶都有一个最适温度。最适温度。在最适温在最适温度条件下度条件下,反应速度最反应速度最大大。最适温度不是一个固定的常数最适温度不是一个固定的常数，它随底物的种类、，它随底物的种类、浓度浓度,溶液的离子强度溶液的离子强度,pH,反应时间等的影响。反应时间等的影响。例例:反应时间短，最适温度高。反应时间短，最适温度高。反应时间长，最适温度低。反应时间长，最适温度低。四、四、pH对酶反应速度的影响对酶反应速度的影响 1酶反应的最适酶反应的最适pH（optimum pH）酶的最适酶的最适pH也不是一个固定的常数也不是一个固定的常数，它受到，它受到

35、底物的种类、浓度底物的种类、浓度;缓冲液的种类、浓度缓冲液的种类、浓度;酶的酶的纯度纯度;反应的温度、时间等的影响。反应的温度、时间等的影响。例例:碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时 s为为2.5x10-5 M，最适，最适pH为为 8.3 s为为2.5x10-2 M，最适，最适pH为为10.0 2pH影响反应速度的原因影响反应速度的原因 (1)pH影响了酶分子、底物分子和影响了酶分子、底物分子和ES复合物的复合物的 解离状态。解离状态。(2)过高、过低的过高、过低的pH导致酶蛋白变性。导致酶蛋白变性。五、激活剂对酶反应速度的影响五、激活剂对酶反应速度的影响 酶的激活剂酶的

36、激活剂1.无机离子无机离子（1）一些金属离子，如）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。等。（2）阴离子：如）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等等（3）氢离子）氢离子 凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如：凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如：Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。是唾液淀粉酶的激活剂。2.有机分子有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA 激活酶原的酶激活酶原的酶 六、抑制剂对酶活性的影响六、抑制剂对酶活性的影响使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作使酶的

37、活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。抑制剂并非变性剂，抑制剂具有不同程度的剂。抑制剂并非变性剂，抑制剂具有不同程度的选择性。选择性。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过 渡状态相似。渡状态相似。b.b.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定 的复合体或结合物。的复合体或结合物。抑制剂类型和特点抑制剂类型和特点 竞争性抑制剂竞争性抑制剂可逆抑制剂可逆

38、抑制剂 非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂反竞争性抑制剂 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂抑制作用的类型：抑制作用的类型：(一一)不可逆抑制作用不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的抑制剂与酶反应中心的活性基团以活性基团以共价共价形式形式结结合合，引起，引起酶的永久性失酶的永久性失活活。如有机磷毒剂二异。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。丙基氟磷酸酯。（二）可逆抑制作用（二）可逆抑制作用(reversible inhibition)及其动力学及其动力学 E+I EI 抑制剂与酶蛋白以抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合非共价方

39、式结合，引起酶活，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被可以通过透析等方法被除去除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类。抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类。1.1.竟争性抑制竟争性抑制 某些抑制剂的化学结构与某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反心之外，其结果是酶促反应被抑制了。应被抑制了。+IEIESP+EE

40、+S竞争性抑制作用竞争性抑制作用 实例：磺胺药物的药用机理实例：磺胺药物的药用机理H2N-SO2NH2对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺H2N-COOH对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸谷氨酸蝶呤蝶呤叶酸叶酸例例:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用 此酶的竞争性抑制剂还有：竞争性抑制作用特点竞争性抑制作用特点：1）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似，）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似，二者竞争酶的结合部位。二者竞争酶的结合部位。4）Vmax不变，不变，Km增大增大2）抑制程度取决于抑制程度取决于I和和S的浓度以及与酶结合的的浓度以及与酶结合的亲和力

41、大小。亲和力大小。SvV/2kmkm无 I有 I3）可以通过增大底物可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞浓度，即提高底物的竞争能力来消除。争能力来消除。2.2.非竟争性抑制非竟争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导致酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的化，并导致酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的基团结合，不与底物竞争酶的活性中心，所以称为基团结合，不与底物竞争酶的活性中心，所以称为非竞争性抑制剂。非竞争性抑制剂。如某些金属离子（如某些金属离子（CuCu2+2+、AgAg+、HgHg2+2+）以及）以及EDTAEDTA等，等，通常能

42、与酶分子的调控部位中的通常能与酶分子的调控部位中的-SH-SH基团作用，改基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用+IEI+SESIESP+EE+S+I实例：重金属离子（实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）非竞争性抑制特点非竞争性抑制特点：1）抑制剂与底物结构不相似，抑制剂与酶活性）抑制剂与底物结构不相似，抑制剂与酶活性 中心以外的基团结合。中心以外的基团结合。2）Vm下降，下降，Km不变不变3）非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法）非竟争性抑制

43、不能通过增大底物浓度的方法 来消除来消除。Sv无 IV/2km有 I()3、反竞争性抑制作用、反竞争性抑制作用ESIESP+EE+S+I酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。活性下降。反竞争性抑制特点：反竞争性抑制特点：1 1）抑制剂与酶和底物的复合物结合。）抑制剂与酶和底物的复合物结合。2 2）KmKm和和VmVm下降下降3 3）底物浓度增加，抑制作用加强。）底物浓度增加，抑制作用加强。有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程 表观表观第三节第三节 酶的作用机制酶的作用机制酶活活性性中中心心 结合

44、合部位部位：与与底物结合底物结合,使底物与酶的一定构象形成复使底物与酶的一定构象形成复 合物，合物，决定决定酶的的专一性。一性。催化催化部位部位：影响底物中某些化学影响底物中某些化学键的的稳定性，定性，催催 化底物转变成产物的部位化底物转变成产物的部位,决定决定酶的的催催 化效率和催化化效率和催化反应的性质。反应的性质。一、酶的活性中心一、酶的活性中心1.活性中心活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基形成的一定空间结构。少数氨基酸残基形成的一定空间结构。包括包括底物结合部位底物结合部位和和催化部位催化部位。结合部位结合部位(Binding site

45、)(Binding site)：酶分子中与底物结合的部：酶分子中与底物结合的部位或区域位或区域。酶活性中心的特点酶活性中心的特点酶活性中心的特点酶活性中心的特点a.酶的活性中心只有几个氨基酸组成，多为极性氨基酸。酶的活性中心只有几个氨基酸组成，多为极性氨基酸。b.酶的活性中心是一个三维实体结构，活性中心的几个氨基酸酶的活性中心是一个三维实体结构，活性中心的几个氨基酸 残基在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同肽链上，通残基在一级结构上可能相距很远，甚至位于不同肽链上，通 过肽链的盘绕折叠而在空间结构上相互靠近，形成一个能与过肽链的盘绕折叠而在空间结构上相互靠近，形成一个能与 底物结合并催化底物

46、形成产物的位于酶蛋白分子表面的特化底物结合并催化底物形成产物的位于酶蛋白分子表面的特化 的空间区域。的空间区域。c.酶的活性中心与底物的结合通过次级键。酶的活性中心与底物的结合通过次级键。d.酶的活性中心具有柔性，可与底物诱导契合发生相互作用。酶的活性中心具有柔性，可与底物诱导契合发生相互作用。e.酶的活性中心位于酶分子表面的酶的活性中心位于酶分子表面的”空穴空穴“中，为非极性环境。中，为非极性环境。2.必需基必需基团：在在酶分子中有一些分子中有一些基团对维持基团对维持酶活性中心应有的空间构象及发挥正常的活性中心应有的空间构象及发挥正常的催化催化活活性是必需的，若将这些基团改变后会导致酶的性是

47、必需的，若将这些基团改变后会导致酶的催化活性减弱甚至丧失，这些基团称为必需基催化活性减弱甚至丧失，这些基团称为必需基团。团。活性中心内外都可以有必需基团。活性中心内外都可以有必需基团。酶酶必需基团必需基团非必需基团非必需基团活性中心活性中心活性中心外基团活性中心外基团结合基团结合基团催化基团催化基团二、酶作用专一性的机制二、酶作用专一性的机制 酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行。应可

48、以按单一方向进行。1.锁锁 钥钥 学学 说说锁钥学说：锁钥学说：认为整个酶分子的天然构象是具有认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。对一把锁一样。2.2.诱导契合学说诱导契合学说诱导契合学说诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状才形成了互补形状.E+SP+EES能能量量水水平平反应过程反应过程 G E1 E2 酶（酶（E）与底物（）与底物（S）结

49、合生成不稳定的中间结合生成不稳定的中间物（物（ES），再分解成产），再分解成产物（物（P）并释放出酶，使）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快需活化能，所以能加快反应速度。反应速度。E +S E-S P +E（一）（一）中间产物学说中间产物学说三、酶作用高效性的机制三、酶作用高效性的机制（二）影响酶催化效率的有关因素（二）影响酶催化效率的有关因素1.1.邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应 在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在一方面底物在酶活性中心的有效浓度

50、大大增加酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应参与反应的基团相互接近的基团相互接近，并被严格，并被严格定向定位定向定位，使酶促，使酶促反应具有高效率和专一性特点。反应具有高效率和专一性特点。邻邻 近近 定定 向向 效效 应应底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变”，从而促使酶底物中间产物进入过渡态。2.2.“张力”与“形变”酶分子中的广义酸、碱基团通过提供部酶分子